Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dorosłego Schistosoma japonicum

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół opisujący izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w pożywce hodowlanej in vitro od dorosłego Schistosoma japonicum.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to błoniaste pęcherzyki uwalniane przez różne komórki do mikrośrodowiska zewnątrzkomórkowego. EV reprezentują populację niejednorodnych pęcherzyków, których wielkość waha się od 40 do 1000 nm. Zgromadzone dowody wskazują, że EV odgrywają ważną rolę regulacyjną w interakcjach między patogenem a gospodarzem. Dogłębne zrozumienie schistosomów EV powinno dostarczyć informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw interakcji schistosom-gospodarz, umożliwiając opracowanie nowych strategii zwalczania schistosomatozy. W tym miejscu dążymy do dalszego badania funkcji EV w schistosomach, przedstawiając protokół izolacji i charakterystyki EV od dorosłego Schistosoma japonicum (S. japonicum). EV wyizolowano z pożywki do hodowli in vitro za pomocą wirowania w połączeniu z komercyjnym zestawem do izolacji egzosomów. Izolowane S. japonicum EVs (SjEVs) mają zazwyczaj średnicę 100 - 400 nm i charakteryzują się transmisyjną mikroskopią elektroniczną i western blot. Zastosowanie SjEV znakowanych barwnikiem PKH67 wykazało, że SjEV są internalizowane przez komórki biorcze. Ogólnie rzecz biorąc, nasz protokół zapewnia alternatywną metodę izolowania EV od dorosłych schistosomów; izolowane SjEV mogą być odpowiednie do analizy funkcjonalnej.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to populacja małych pęcherzyków błonowych otoczonych różnymi białkami, lipidami i kwasami nukleinowymi. Ostatnie badania wykazały, że EV odgrywają kluczową rolę w komunikacji między komórkami i biorą udział w regulacji wielu procesów fizjologicznych, w tym rozwoju komórek, regulacji immunologicznej, angiogenezy i migracji komórek^2,3,4,5. Coraz więcej dowodów wskazuje, że EV, krążące egzosomy i ich ładunek miRNA stanowią potencjalne biomarkery niektórych chorób⁶.

Wykazano, że kilka pierwotniaków, takich jak Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruzi i Leishmania spp., są zdolne do wydzielania EV; dodatkowo odkryto, że robaki wydzielają EV do żywych gospodarzy⁷. Wykazano, że pasożytnicze EV są zaangażowane w utrzymanie infekcji, chorobotwórczości⁸ i regulację immunologiczną⁹. Ostatnie badania nad schistosomami, zarówno Schistosoma mansoni (S. mansoni) ^10,11, jak i S. japonicum¹² wykazały, że dorosłe schistosomy wydzielają pęcherzyki podobne do egzosomów, które mogą być zaangażowane w funkcjonalne regulacje określonych procesów biologicznych.

Do tej pory do izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych użyto kilku metod, takich jak ultrawirowanie, ultrafiltracja¹³, użycie odczynników na bazie polimerów, chromatografia wykluczająca rozmiar i izolacja immunoaffinity. Te różne metody mają swoje zalety i ograniczenia¹⁴. Ogólnie rzecz biorąc, ultrawirowanie jest uważane za złoty standard metody izolacji pęcherzyków. Jednak ta metoda cierpi z powodu ograniczenia potencjalnej agregacji EV¹⁴.

W schistosomach opisano kilka metod izolacji EV: obejmują one ultrawirowanie^11,12,10 oraz użycie komercyjnego zestawu do izolacji EV¹⁶ dla kilku etapów (jaja¹⁶, schistosomula¹¹, dorosłe schistosomomy^10,12,17). Biorąc pod uwagę, że mikropęcherzyki mają szeroki zakres rozmiarów od kilkuset nanometrów do tysięcy nanometrów, opracowaliśmy alternatywną metodę, która łączy się z użyciem wirówki laboratoryjnej, ultrafiltracji i komercyjnego zestawu do izolacji EV w celu wyizolowania EV od dorosłego Schistosoma japonicum. Izolowane EV miały zazwyczaj średnicę 100 - 400 nm i były z powodzeniem internalizowane przez komórki biorcze.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną Instytutu Badań Weterynaryjnych w Szanghaju, Chińskiej Akademii Nauk Rolniczych (numer zezwolenia: SHVRIAU-14-0101).

1. Hodowla schistoposomów in vitro

Uwaga: Schistosomy stanowią zagrożenie biologiczne. Pracownicy powinni nosić rękawice lateksowe przez cały czas pracy z robakami, zawiesinami schistosomalnymi lub innymi pokrewnymi materiałami biologicznymi. Króliki nowozelandzkie zostały zarażone ~ 2,000 cerkarii poprzez ekspozycję brzuszną. Schistosomy w fazie wątroby pobrano od królików zakażonych S. japonicum cercariae po 28 dniach od zakażenia przez perfuzję żył wątrobowych i krezkowych. Procedury zbierania robaków zostały omówione w poprzednich publikacjach opisujących badania na myszach¹⁸.

1. Zbierz pasożyty w zlewce o pojemności 500 ml. Umyj je dokładnie i delikatnie 3x 200 ml podgrzanego (37 °C) PBS (pH 7,4).
2. Oddziel ~200 par robaków na każdą szalkę Petriego o średnicy 90 mm. Następnie dokładnie i delikatnie umyć pasożyty 2x 50 ml podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej RPMI-1640 zawierającej 100 j. penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny.
3. Utrzymuj pasożyty w 40 ml podgrzanej pożywki hodowlanej RPMI-1640 bez antybiotyków w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO₂ przy gęstości ~5 par robaków / ml przez 2 godziny na szalce Petriego o średnicy 90 mm
   Notatki: Pożywka RPMI 1640 nie powinna zawierać surowicy, w przeciwnym razie zostaną wprowadzone egzogenne pęcherzyki zewnątrzkomórkowe.

2. Wstępnie poddane obróbce media

1. Zebrać pożywkę hodowlaną, a następnie odwirować pożywkę w temperaturze 4 °C w temperaturze 2 000 × g przez 30 minut w celu usunięcia jaj i resztek robaków.
2. Przenieść supernatant do świeżej probówki, a następnie przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
3. Przefiltrowany roztwór należy zebrać do worka do dializacji (granica masy cząsteczkowej: 3,5 kD), a następnie dializować roztwór przy użyciu 8% roztworu PEG8000 w temperaturze 4 °C przez noc.
   Notatki: Ten krok jest ważny dla wzbogacenia SjEVs w celu zwiększenia wydajności izolacji SjEVs.

3. Izolacja SjEVs

1. Przenieś dializowany roztwór do nowej probówki, a następnie dodaj 0,5 objętości całkowitego odczynnika do izolacji egzosomów.
2. Dobrze wymieszaj roztwór, wirując lub pipetując w górę iw dół, aby zapewnić jednorodność roztworu.
3. Inkubować mieszaninę w temperaturze od 2 °C do 8 °C przez noc.
4. Odwirować mieszaninę w temperaturze 15 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze od 2 °C do 8 °C.
5. Odessać i wyrzucić supernatant.
   Notatki: EV znajdują się w granulce na dnie rurki (w większości przypadków niewidoczne).
6. Zawiesić osad EVs w 2 ml PBS, a następnie przechowywać roztwór EVs w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

4. Charakterystyka EV za pomocą Western Blotting

1. Oznaczyć stężenie białka w próbce SjEVs, np. za pomocą testu BCA.
2. Przygotuj 10 - 20 μg EV w buforze RIPA o pojemności 22,5 μl. Następnie dodać 7,5 μl 4x bufora ładującego i podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
3. Oddziel białka SjEVs za pomocą 12% żelu SDS-PAGE.
4. Przenieś białka do błony PVDF, a następnie sonduj przeciwciałami anty-CD63 (rozcieńczenie 1:1,000), a następnie sonduj anty-króliczą IgG-HRP (rozcieńczenie 1:5,000).
5. Użyj odczynnika do wykrywania ECL do opracowania membrany i wykryj sygnały za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.

5. Charakterystyka EV za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

1. Dodaj 2 μl izolowanych SjEVs do siatek pokrytych formą o oczkach 200, a następnie pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
2. Plamić 2% kwasem fosfowolframowym przez 1 minutę, a następnie pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
3. Załaduj siatki na uchwyt próbki transmisyjnego mikroskopu elektronowego i wystaw na działanie wiązki elektronów 80 kV w celu uchwycenia obrazu.

6. Etykieta SjEVs z PKH67 i testem wychwytu komórek

Uwagi: Wszystkie kolejne kroki były wykonywane w temperaturze otoczenia (20 - 25 °C), chyba że zaznaczono inaczej.

1. Przenieś 5 μg roztworu SjEVs do stożkowej dolnej probówki polipropylenowej i dostosuj objętość do 12 ml, dodając pożywkę RPMI 1640.
2. Odwirować SjEVs w temperaturze 110 000 × g przez 90 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzania SjEVs.
3. Po odwirowaniu ostrożnie odessać supernatant.
   nuta: Barwnika etanolowego PKH67 nie należy dodawać bezpośrednio do granulatu SjEV, ponieważ spowodowałoby to niejednorodne zabarwienie i zmniejszoną żywotność komórek.
4. Przygotować roztwór zawiesiny 2x EV, dodając 1 ml rozcieńczalnika C do granulki SjEV; aby zapewnić całkowitą dyspersję, ponownie zawiesić za pomocą delikatnego pipetowania.
5. Tuż przed barwieniem w rozcieńczalniku C przygotuj świeży 2x roztwór barwnika, dodając 2 μl roztworu barwnika etanolowego PKH67 do 1 ml rozcieńczalnika C w probówce wirówki polipropylenowej i dobrze mieszając do dyspersji.
6. Szybko dodaj 1 ml zawiesiny 2x EV (krok 6.4) do 1 ml 2x roztworu barwnika (krok 6.5) i natychmiast wymieszaj próbkę przez pipetowanie.
7. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 4 minuty.
8. Zatrzymaj barwienie, dodając 4 ml FBS, a następnie inkubuj przez 1 minutę.
9. Dodać RPMI1640 pożywkę, aby dostosować objętość do 12 ml, a następnie odwirować w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C przez 90 minut.
10. Usunąć supernatant i dodać RPMI1640 pożywkę, aby ponownie zawiesić granulki SjEV oznaczone PKH67.
11. Odwirować w temperaturze 110 000 × g w temperaturze 4 °C przez 90 minut w celu jednokrotnego umycia, a następnie dodać PBS w celu ponownego zawieszenia granulek SjEVs.

7. Test wychwytu komórek SjEVs

1. Komórki nasienne ssaków, takie jak NCTC, klonują 1469 komórek lub HEK293T komórek na płytkach 6-dołkowych (2× 10,⁵ komórek na dołek) i hodują komórki przez noc.
2. Dodać 5 μg SjEV znakowanych PKH67, a następnie hodować komórki w temperaturze 37 °C przez 2-4 godziny.
3. Po inkubacji usunąć pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki PBS.
4. Utrwal komórki 4% roztworem formaldehydu przez 15 minut i umyj jeszcze dwukrotnie PBS.
5. Barwienie jąder komórkowych 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI).
6. Obserwuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Wyniki

Aby określić ilościowo wydajność izolowanych SjEV za pomocą opisanego protokołu, użyliśmy testu białka BCA, aby uzyskać dostęp do stężenia białka wyizolowanych SjEV z 28-dniowych dorosłych schistosomów. Jak pokazano w tabeli 1, stężenie białka SjEV wahało się od 208 μg do 250 μg na 100 ml pożywki (tabela 1). Wielkość cząstek, określona przez analizę nanocząstek Malvern, wykazała, że izolowane SjEV miały od 100 nm do 400 nm, przy czym największa populacja ...

Dyskusja

Ostatnie badania nad EV wykazały, że schistosomy EV odgrywają ważną rolę w interakcjach gospodarz-patogen 3,9,12,16. Aby jeszcze bardziej zająć się ich funkcjami regulacyjnymi, konieczne jest wyizolowanie EV od schistosomów. W tym miejscu opisujemy alternatywną metodę izolacji SjEV. Metoda ta pozwala uzyskać szeroki zakres wielkości SjEV, od 100 nm do 400 nm, u dorosłych S. japonicum. ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiał
Total Exosome Isolation Reagent (z pożywki do hodowli komórkowych)	ThermoFisher SCIENTIFIC 4478359		Do izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych S. japonicum
PKH67	Sigma-aldrich	MINI67	Do znakowania Evs
RPMI 1640 Medium	ThermoFisher SCIENTIFIC 11875119		Do hodowli pasożytów
Penicylina-Streptomycyna	ThermoFisher SCIENTIFIC 15140122
0,22μ m filtr strzykawkowy	Merck	SLGP033RB
Wężyk do dializy SnakeSkin	Thermo SCIENTIFIC	68035
PEG8000	Sangon Biotech	A100159
RIPA	Beyotime	P0013B
EMD Millipore&handel; Immobilon&handel; Zachodni chemiluminescencyjny substrat HRP (ECL)	Fisher WBKLS0100
Technologia sygnalizacji komórkowej	DAPI	4083
Zestaw BCA	Beyotime	P0010
Przeciwciała CD63	Sangon Biotech	D160973-0025
PVDF	Bio-Rad	1704273
Formvar/Carbon 400 mesh	Ted Pella	01754-F
Kwas fosfowolframowy	Ted Pella	19402
anty-mysie IgG-HRP	CWBIO	CW0102
NCTC klon 1469 komórek	ATCC	ATCC & reg; CCL-9.1 i handel;
FBS	HyClone	SV30087.02
Equipments
GE system obrazowania chemoluminescencji	GE	ImageQuant LAS4000mini
Transmisyjna mikroskopia elektronowa	Hitachi	H-7600
Milli-Q woda	Milli-Q	Milli-Q Elix
Eppendor Wirówka	Wirówka Eppendorf	5804R
Zetasizer Nano	Malvern	Zetasizer Nano ZS
Ultrawirówka	Beckman	Optima L-100 XP Ultrawirówka
Inkubator	ESCO	CCL-107B
	Mikroskop Zeiss	Zeiss Axin Observer Z1