Artykuł metodologiczny

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57518

⸱

30 kwietnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, University of Michigan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Streszczenie

Zgrupowany regularnie przeplatany system reaktorów palindromicznych (CRISPR) i związany z CRISPR białkiem 9 (Cas9) prokariotyczny adaptacyjny system obrony immunologicznej został dokooptowany jako potężne narzędzie do precyzyjnej inżynierii genomu eukariotycznego. W tym miejscu przedstawiamy szybką i prostą metodę wykorzystującą chimeryczne pojedyncze przewodnikowe RNA (sgRNA) i rybonukleoproteiny (RNP) CRISPR-Cas9 do wydajnego i precyzyjnego generowania punktowych mutacji genomowych u C. elegans. Opisujemy proces selekcji celu sgRNA, projektowanie szablonów naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR), kompleksowanie i dostarczanie CRISPR-Cas9-RNP oraz strategię genotypowania, która umożliwia solidną i szybką identyfikację prawidłowo edytowanych zwierząt. Nasze podejście nie tylko pozwala na łatwe generowanie i identyfikację pożądanych zmutowanych genomowo zmutowanych zwierząt, ale także ułatwia wykrywanie innych złożonych alleli indel w ciągu około 4-5 dni przy wysokiej skuteczności i zmniejszonym obciążeniu badaniami przesiewowymi.

Wprowadzenie

Ostatnie osiągnięcia technologiczne radykalnie przekształciły i przyspieszyły możliwość precyzyjnego inżynierii genomów. W szczególności system CRISPR-Cas9, który opiera się na endonukleazie Cas9 kierowanej przez RNA w celu wywołania pęknięcia podwójnej nici (DSB) w pobliżu docelowej sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania, był szeroko stosowany do dokładnej inżynierii genomu większości organizmów modelowych wykorzystywanych w badaniach biomedycznych1,2,3,4. Co istotne, zastosowanie CRISPR-Cas9 umożliwiło edycję genomu nawet u trudnych gatunków, takich jak C. elegans5. Niezależnie od gatunku, generowanie mutacji punktowych za pomocą systemu edycji genomu opartego na CRISPR-Cas9 opiera się na trzech podstawowych komponentach: 1) endonukleazie Cas9, 2) pojedynczym przewodniku RNA (sgRNA), który kieruje endonukleazę Cas9 do sekwencji docelowej oraz 3) zaprojektowanym przez użytkownika szablonie naprawy ukierunkowanej na homologię (HDR) zawierającym pożądane zmiany będące przedmiotem zainteresowania2.

Istnieje kilka metod, które mogą być użyte do wprowadzenia do komórek ukierunkowanego nukleazy sgRNA i Cas9, w tym plazmid, RNA i metody dostarczania oparte na wirusach6. Ostatnio bezpośrednie dostarczanie wstępnie skompleksowanych rybonukleoprotein sgRNA-Cas9 (RNP) okazało się potężnym i wydajnym narzędziem w edycji genomu opartej na CRISPR-Cas97. Bezpośrednie dostarczanie wstępnie skompleksowanych RNP CRISPR-Cas9 ma kilka wyraźnych zalet, a mianowicie: 1) RNP omijają potrzebę transkrypcji i translacji komórkowej, 2) RNP są szybko usuwane, co może zwiększyć specyficzność poprzez skrócenie dostępnego czasu na rozszczepienie poza celem, oraz 3) RNP nie zawierają obcych elementów DNA/RNA, co pozwala uniknąć wprowadzenia nienatywnych sekwencji do genomu gospodarza poprzez losową integrację. Razem te atrybuty prawdopodobnie zapewniają krótkotrwałą eksplozję edycji CRISPR na celu, jednocześnie minimalizując efekty niecelowe.

Opisujemy prosty i skuteczny protokół wprowadzania specyficznych dla danego miejsca zmian genomowych u C. elegans. Protokół ten obejmuje celowanie w projekt matrycy HDR sgRNA i jednoniciowych oligonukleotydów (ssODN), kompleksowanie i dostarczanie sgRNA-Cas9 RNP oraz strategię genotypowania w celu jednoznacznej identyfikacji prawidłowo edytowanych zwierząt. Stosując tę strategię, nie tylko można odzyskać pożądane zmiany specyficzne dla danego miejsca, ale także inne niespecyficzne mutacje indel. W związku z tym nasza strategia pozwala na generowanie serii allelicznej przy użyciu jednej strategii, w której w pokoleniu F1 mogą być generowane zarówno mutanty monoalleliczne, dwualleliczne, jak i indelowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów były zgodne z wytycznymi National Institutes of Health i Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Michigan. Używaj roztworów wolnych od RNaz i końcówek do pipet przez cały czas trwania protokołu. Oczyść obszar roboczy, pipety, probówki i wirówkę roztworem do odkażania RNazy zgodnie z wytycznymi producenta (patrz tabela materiałów).

1. Wybór celu sgRNA

  1. Korzystając z przeglądarki internetowej, otwórz stronę internetową: http://crispor.tefor.net8
    1. Wprowadź ~60 par zasad (bp) sekwencji otaczającej żądaną edycję będącą przedmiotem zainteresowania (tj. 30 pz 5' i 3' żądanej edycji).
    2. Wybierz genom Caenorhabditis elegans z menu rozwijanego.
    3. Z menu rozwijanego wybierz motyw przylegający do protospaceru (20 bp-NGG - SpCas9, SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1).
    4. Kliknij przycisk Prześlij. Na stronie wyników wybierz sekwencję docelową o najwyższej pozycji, która znajduje się najbliżej interesującej Cię edycji. Jeśli w bocznej sekwencji wejściowej 60 pz nie ma odpowiednich miejsc docelowych, rozwiń sekwencję zapytań do 100 pz (tj. 50 pz po obu stronach żądanej edycji).
  2. Z dostępnego źródła, np. synthego, otrzymaj 20-merowy docelowy sgRNA o następującej specyfikacji: 3 nmol; bez modyfikacji.
  3. Po otrzymaniu odwirować liofilizowaną probówkę zawierającą sgRNA o >12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Dodać 60 μl TE wolnego od nukleaz do probówki i delikatnie zawiesić, pipetując w górę i w dół 15-20 razy za pomocą pipety P200. Końcowe stężenie wynosi 50 μM.

2. Projekt szablonu naprawy ukierunkowanego na homologię

  1. Zaprojektuj szablon ssODN HDR zawierający: 1) mutację będącą przedmiotem zainteresowania, 2) unikalne miejsce endonukleazy restrykcyjnej w ramce, 3) cichą mutację jednego lub obu Gs w sekwencji NGG PAM oraz 4) ramiona homologii 5' i 3' 50 bp flankujące pierwszą i ostatnią mutację. (Rysunek 1C)9,10.
    1. Jeśli mutacja sekwencji NGG PAM nie jest możliwa, wprowadź 5 - 6 cichych mutacji w sekwencji rozpoznawania celu sgRNA, aby zapobiec rozszczepieniu matrycy ssODN HDR za pośrednictwem sgRNA.
  2. Z dostępnego źródła, np. idtDNA, otrzymać "oligonukleotyd Ultramer DNA" o następujących parametrach: Skala: 4 nmol; Skład: Brak; Oczyszczanie: Standardowe odsalanie.
  3. Po otrzymaniu odwirować liofilizowaną probówkę zawierającą ssODN o >12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Delikatnie zawiesić ssODN do końcowego stężenia 100 μM w ddH2O bez nukleaz, pipetując w górę i w dół 15 - 20 razy za pomocą pipety P200.

3. Projektowanie podkładów genotypowania

  1. Zaprojektuj zestaw starterów flankujący modyfikację genomu, aby wygenerować amplicon11.
  2. Zoptymalizuj warunki cykliczne PCR, aby wytworzyć pojedynczy i specyficzny amplicon11.

4. Przygotuj mieszankę do iniekcji

  1. Odwirować odczynniki z tabeli 1 z maksymalną prędkością przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  2. W podanej kolejności dodaj odczynniki z tabeli 1 do probówki PCR bez nukleazy.
  3. Dokładnie wymieszaj, delikatnie pipetując 10 razy w górę i w dół za pomocą pipety P20.
  4. Inkubować mieszaninę do wstrzykiwań przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

5. Protokół iniekcji

  1. Załaduj mikropipetę iniekcyjną około połową mieszanki iniekcyjnej 12. Zachowaj pozostałą mieszankę do wstrzykiwań na wypadek zatkania lub pęknięcia igły iniekcyjnej.
  2. Rozbij końcówkę mikropipety tak, aby ~20 - 30 p.s.i. dało stopniowo płynący roztwór12.
    UWAGA: Końcówki o większej średnicy negatywnie wpływają na zdrowie zwierząt i zmniejszają plon potomstwa F1.
  3. Jeśli to możliwe, wstrzyknij 10 - 15 młodych dorosłych robaków w oba ramiona gonad12. Jeśli nie, wystarczy wstrzyknięcie do jednego ramienia gonady.
  4. Pozostawić zwierzętom, którym wstrzyknięto (P0) regenerację przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej na płytce z pożywką hodowlaną nicieni (NGM) o średnicy 35 mm wysiewanej przez OP50. Następnie, pojedynczo wstrzyknięte zwierzęta P0 do pojedynczych płytek NGM o średnicy 35 mm z nasionami OP50 za pomocą platynowego drutu drucianego pick12.

6. Ekran P0 Płyty i pojedynczy mCherry(+) F1s

  1. Dwa dni po wstrzyknięciu zidentyfikuj płytki P0 zawierające potomstwo F1 wyrażające mCherry w gardle za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego (Ryc. 1D, dzień 2 - 3). Wybierz trzy płytki P0, które zawierają najwięcej zwierząt mCherry(+) F1.
  2. Z każdej z trzech wybranych płytek P0 pojedynczo 8 - 12 mWiśnia(+) F1 zwierzęta, w sumie 24-36 mWiśnia(+) F1s za pomocą kilofa do robaków (Rysunek 1D, dzień 2 - 3).
    UWAGA: Zwierzęta mCherry(-) można również wyodrębnić z tych tabliczek P0, ale prawdopodobieństwo zidentyfikowania poprawnie zredagowanych zwierząt jest znacznie mniejsze (Rysunek 2A).
  3. Pozostawić poszczególne F1s do samozapłodnienia i złożyć jaja przez 1 - 2 dni w temperaturze pokojowej.

7. PCR z pojedynczym robakiem i genotypowanie

  1. Po 1 - 2 dniach składania jaj przenieś F1s do pojedynczych nakrętek probówki paskowej PCR zawierających 7 μl buforu do lizy robaków za pomocą kilofa do robaków (Tabela 2, Ryc. 1D, dzień 4 - 5).
  2. Odwirować probówki do PCR z maksymalną prędkością przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby sprowadzić zwierzęta na dno probówki, i zamrozić probówki w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę
    UWAGA: Robaki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony.
  3. Lizować zamrożone robaki w termocyklerze za pomocą następującego programu: 60 °C przez 60 min, 95 °C przez 15 min, 4 °C trzymać.
  4. Przygotuj PCR mastermix, jak pokazano w Tabeli 3.
  5. Dodaj 21 μl mastermixu PCR do czystych probówek PCR, a następnie dodaj 4 μl lizy robaków z kroku 3. Dobrze wymieszać za pomocą pipety i uruchomić program PCR zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela materiałów).
  6. Oczyść reakcje PCR za pomocą zestawu DNA Clean and Concentrate, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Eluować DNA, dodając 10 μl wody do kolumny wirowej.
  7. Ustawić enzym restrykcyjny mastermix, jak pokazano w Tabeli 4.
  8. Dodać 10 μl mastermixu enzymu restrykcyjnego do każdej oczyszczonej reakcji PCR i inkubować przez 1 - 2 godziny w temperaturze 37 °C13.
  9. Oddziel strawione produkty PCR na 1,5% żelu agarozowym przy napięciu 120 V przy użyciu 1x buforu Tris-acetate-EDTA (TAE)14.

8. Identyfikacja i weryfikacja sekwencji edytowanych zwierząt

  1. Zbadaj próbki trawione enzymatycznie pod kątem obecności prążków, które wskazują na potencjalne edytowane zwierzęta14 (Rysunek 1D, dzień 4 - 5).
    UWAGA: Załaduj kontrolę N2, aby zidentyfikować potencjalne mutacje indel, które można zaobserwować jako zmiany w wielkości pasma i/lub nieoczekiwane i złożone wzorce pasm trawienia enzymu restrykcyjnego.
  2. Po zidentyfikowaniu potencjalnie edytowanych zwierząt użyj pozostałych 3 μl lizy robaków i powtórz reakcję PCR. Nie czyść ani nie ograniczaj trawienia enzymu reakcji PCR po zakończeniu programu. Załaduj reakcję PCR na 1% żel agarozowy, oddziel i wyekstrahuj pasmo za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu15 (patrz Tabela Materiałów).
  3. Sekwencja Sangera16 żelowe DNA wyekstrahowane przy użyciu startera F1 w celu identyfikacji poprawnie edytowanych zwierząt (Rysunek 1A)
    UWAGA: Odczyty heterozygoty będą zawierały nałożone piki ze względu na obecność typu dzikiego i zmodyfikowanego allelu.
  4. Aby uzyskać homozygotyczne zwierzęta ze zweryfikowanych heterozygotycznych edytowanych zwierząt, pobierz 8 - 12 zwierząt F2 i wykonaj kroki 7 - 8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mutacje w ludzkiej dysmutazie ponadtlenkowej 1 (SOD1odpowiadają za ~10–20% przypadków rodzinnego stwardnienia bocznego zanikowego, wyniszczającej choroby neurodegeneracyjnej, która nieuchronnie prowadzi do paraliżu i śmierci17Ludzka SOD-1 jest ewolucyjnie konserwatywnym białkiem, wykazującym 55% identyczności i 70% podobieństwa do C. elegans białko SOD-1 (Rysunek 1B). Aby zademonstrować prostotę, wykonalność i efektyw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

System CRISPR-Cas9 jest potężnym i skutecznym narzędziem do precyzyjnej modyfikacji genomu organizmów modelowych. Tutaj pokazujemy, że chimeryczne sgRNA20 w połączeniu z matrycami HDR ssODN umożliwiają wysoce wydajne generowanie punktowych mutacji genomowych u C. elegans. Co ważne, wykazaliśmy, że dostarczanie RNP zapewnia wysoką wydajność edycji, gdy fluorescencja jest używana jako marker koselekcji, podkreślając łatwość i niezawodność techniki.

Większość meto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Dziękujemy członkom laboratorium Beg za krytyczną lekturę tego manuskryptu. Szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Badania w laboratorium Beg są wspierane przez granty NIH (R01 NS094678) i Muscular Dystrophy Association (MDA382300) dla A.A.B.

Podziękowania

Nie ma żadnych konfliktów interesów związanych z tym raportem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CRISPRevolution sgRNA  EZ KitSynthego Inc.chimeryczny sgRNA
wolny od nukleaz TESynthego Inc.dostarczany z zestawem sgRNA, zestawem
wodą wolną od nukleaz,Synthego, Inc.dostarczany z zestawem sgRNA EZ kit
4 nmole Ultramer DNA OligoIntegrated DNA TechnologiesssODN HDR template
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLSIntegrated DNA Technologies1078728Cas9 białko
pCFJ90 Addgene19327Pmyo-2::mWiśniowy marker plazmid
KClSigmaP5405
HEPESSigmaH4034
DNA Clean & KoncentratorZymo ResearchD4004
Zymoclean Gel Zestaw do odzyskiwania DNAZymo ResearchD4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BiolabsM0494L
Proteinaza KSigmaP2308
Szklane mikropipety ze szkła borokrzemianowegoSutter InstrumentsBF100-78-10OD: 1,0 mm. ID: 0,78 mm
Chlorowodorek TrizmaSigmaT5941
MgCl2SigmaM2393
NP-40Sigma74385
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Roztwór do odkażania RNaseZapFisher ScientificAM9780
EZ,

Bibliografia

  1. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
  2. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096(2014).
  3. Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
  5. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
  6. Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
  7. Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
  8. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148(2016).
  9. Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
  10. Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
  11. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
  14. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
  15. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
  16. Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
  17. Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
  18. Evans, T. C. WormBook. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  19. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  20. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  21. Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
  22. Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis? Brain. 136, 2342-2358 (2013).
  23. Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
  24. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Edycja genomu C elegansdob r celu dla sgRNAszablon HDR ssODNgenotypowanie za pomoc enzym w restrykcyjnychfluorescencyjny marker mCherryweryfikacja sekwencjonowaniem Sangerazwierz ta z mutacj homozygotycznszybki schemat wprowadzania mutacji

Powiązane artykuły