Toeprinting ma na celu zmierzenie zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia kompleksów inicjujących translację z rybosomami w różnych warunkach. Protokół ten opisuje metodę odciskania palca RNA ssaków i może być stosowany do badania translacji zarówno zależnej od czapeczki, jak i sterowanej przez IRES.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Inicjacja translacji jest etapem ograniczającym szybkość syntezy białek i stanowi kluczowy punkt, w którym komórki regulują produkcję białka. Regulacja syntezy białek jest kluczem do komórkowej odpowiedzi na stres, a rozregulowanie ma kluczowe znaczenie dla wielu stanów chorobowych, takich jak rak. Na przykład, chociaż stres komórkowy prowadzi do zahamowania globalnej translacji poprzez osłabienie inicjacji zależnej od czapeczki, niektóre białka odpowiedzi na stres są selektywnie translowane w sposób niezależny od czapeczki. Dyskretne elementy regulatorowe RNA, takie jak wewnętrzne miejsca wejścia rybosomów w komórkach (IRES), umożliwiają translację tych specyficznych mRNA. Identyfikacja takich mRNA i charakterystyka ich mechanizmów regulacyjnych była kluczowym obszarem biologii molekularnej. Odcisk palca u nogi to metoda badania struktury i funkcji RNA w odniesieniu do inicjacji translacji. Celem badania jest ocena zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia stabilnych kompleksów z rybosomami w różnych warunkach, w celu określenia, które sekwencje, elementy strukturalne lub czynniki dodatkowe są zaangażowane w wiązanie rybosomów - prekursor skutecznej inicjacji translacji. Wraz z innymi technikami, takimi jak analiza zachodnia i profilowanie polisomów, odcisk palca u nogi pozwala na solidną charakterystykę mechanizmów regulacji inicjacji translacji.
Wprowadzenie
Ponieważ tłumaczenie zużywa najwięcej energii komórkowej, ma sens, że tłumaczenie jest ściśle regulowane1. I odwrotnie, rozregulowanie translacji - i wynikające z tego zmiany w produkcji białek - jest często obserwowane w stanach stresowych i chorobowych, takich jak rak1,2. Główną zaletą kontroli translacyjnej jest szybkość, z jaką komórki mogą zmieniać swoje białko wyjściowe, aby reagować na różne bodźce3. Regulacja translacji stanowi zatem ważny mechanizm, który może wpływać na przeżycie i śmierć komórki1,2
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: RNA jest bardzo podatne na degradację przez rybonukleazy (RNazy). Podejmij standardowe środki ostrożności, aby utrzymać RNA w stanie nienaruszonym. Często zmieniaj rękawice. Używaj filtrowanych końcówek do pipet, plastikowych naczyń niezawierających nukleaz i chemikaliów wolnych od nukleaz na wszystkich etapach protokołu. Do wszystkich roztworów należy używać wody wolnej od nukleaz lub uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC).
1. Przygotowanie roztworów
- Przygotuj bufor do odcisków palców: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5% (w/v) sacharozy, 2 mM ditiotreitol (DTT) i 0,5 mM spermidyny.
- ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisaliśmy wcześniej zdolność IRES XIAP do wspierania niezależnej od czapeczki inicjacji translacji in vitro8,10. Metoda toeprintingu była kluczową techniką służącą do zbadania szczegółów mechanistycznych kompleksu inicjacji IRES XIAP. Konstrukt DNA kodujący mRNA zawierający IRES XIAP (Rycyna 1A) został poddany transkrypcji in vitro i analizie toeprintingowej. Warian.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Odcisk palca u nogi jest potężną techniką bezpośredniego pomiaru zdolności interesującego RNA do wspierania tworzenia kompleksów inicjujących translację w ściśle kontrolowanych warunkach. Protokół ten opisuje uproszczoną technikę odciskania palców u stóp RNA ssaków. Lizat retikulocytów królika (RRL) jest używany jako wygodne źródło rybosomów, eIF, inicjującego tRNA i czynników transakcyjnych IRES (ITAF). Eksperymentator podaje wybrane przez siebie RNA, a także może uzupełnić reakcję odcisku palca u nogi o określ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została sfinansowana przez Radę Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Kanady-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), Kanadyjską Fundację na rzecz Innowacji-John R. Evans Leaders Fund (35017), Campus Alberta Innovates Program oraz Ministerstwo Rozwoju Gospodarczego i Handlu Alberty.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| DEPC (pirowęglan dietylu) | Sigma | D5758-100ML | |
| Baza TRIS, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (octan potasu) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (tetrahydrat octanu magnezu) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sacharoza, klasa biologii molekularnej | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidyna | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (hydrat soli trisodowej 5′-[&beta,γ-imido]trifosforanu guanozyny) 0,1 M roztwór | Sigma | G0635 | |
| ATP (adenozyno-5&-trifosforan), roztwór 100 mM Sigma | A6559 | ||
| 19:1 Akrylamid: bis-akrylamid, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Mocznik | Bio Basic | UB0148 | |
| 500 ml jednostki filtracyjne do butelek, 0,2 i mikro; m | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamid | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (sól disodowa, dihydrat) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Błękit bromofenolowy | Bio Basic | BDB0001 | |
| Cyjanol ksylenowy FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAskrót T7 zestaw do transkrypcji | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE Zestaw do transkrypcji T7 | Ambion | AM1344 | |
| Kwas Fenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy | Invitrogen | 15593-049 | |
| Lizat retikulocytów królika (RRL). NIE powinien być traktowany nukleazą. | Zielone Hektary, USA | Skontaktuj się z Green Hectares, poproś o 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNaza Inhibitor (40 U/µ L) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Wymieszaj równe części na zapas 25 mM każda. |
| AMV-RT, 10 U/&mikro; L | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 Analizator DNA | LI-COR | Produkt został wycofany | |
| z produkcji APS (Nadsiarczan amonu) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion Polimeraza o wysokiej wierności | Nowość Anglia Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
Bibliografia
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
