Artykuł metodologiczny

Analiza odcisków palców u nóg tworzenia kompleksu inicjacji translacji na mRNA ssaków

DOI:

10.3791/57519

⸱

10 maja 2018

 , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, Alberta RNA Research and Training Institute, University of Lethbridge, 2Department of Neuroscience and the Canadian Centre for Behavioral Neuroscience (CCBN), University of Lethbridge, 3Arnie Charbonneau Cancer Institute, University of Calgary

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toeprinting ma na celu zmierzenie zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia kompleksów inicjujących translację z rybosomami w różnych warunkach. Protokół ten opisuje metodę odciskania palca RNA ssaków i może być stosowany do badania translacji zarówno zależnej od czapeczki, jak i sterowanej przez IRES.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inicjacja translacji jest etapem ograniczającym szybkość syntezy białek i stanowi kluczowy punkt, w którym komórki regulują produkcję białka. Regulacja syntezy białek jest kluczem do komórkowej odpowiedzi na stres, a rozregulowanie ma kluczowe znaczenie dla wielu stanów chorobowych, takich jak rak. Na przykład, chociaż stres komórkowy prowadzi do zahamowania globalnej translacji poprzez osłabienie inicjacji zależnej od czapeczki, niektóre białka odpowiedzi na stres są selektywnie translowane w sposób niezależny od czapeczki. Dyskretne elementy regulatorowe RNA, takie jak wewnętrzne miejsca wejścia rybosomów w komórkach (IRES), umożliwiają translację tych specyficznych mRNA. Identyfikacja takich mRNA i charakterystyka ich mechanizmów regulacyjnych była kluczowym obszarem biologii molekularnej. Odcisk palca u nogi to metoda badania struktury i funkcji RNA w odniesieniu do inicjacji translacji. Celem badania jest ocena zdolności transkrybowanego RNA in vitro do tworzenia stabilnych kompleksów z rybosomami w różnych warunkach, w celu określenia, które sekwencje, elementy strukturalne lub czynniki dodatkowe są zaangażowane w wiązanie rybosomów - prekursor skutecznej inicjacji translacji. Wraz z innymi technikami, takimi jak analiza zachodnia i profilowanie polisomów, odcisk palca u nogi pozwala na solidną charakterystykę mechanizmów regulacji inicjacji translacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ponieważ tłumaczenie zużywa najwięcej energii komórkowej, ma sens, że tłumaczenie jest ściśle regulowane1. I odwrotnie, rozregulowanie translacji - i wynikające z tego zmiany w produkcji białek - jest często obserwowane w stanach stresowych i chorobowych, takich jak rak1,2. Główną zaletą kontroli translacyjnej jest szybkość, z jaką komórki mogą zmieniać swoje białko wyjściowe, aby reagować na różne bodźce3. Regulacja translacji stanowi zatem ważny mechanizm, który może wpływać na przeżycie i śmierć komórki1,2,3. Spośród etapów translacji, inicjacja jest najbardziej uregulowana i złożona3. Krótko mówiąc, większość eukariotycznych mRNA zawiera kap o długości 5 stópi 7G, który prawie zawsze jest niezbędny do ich translacji. Inicjacja zależna od czapeczki wymaga eukariotycznych czynników inicjacji eIF4E, eIF4A i eIF4G (kompleks rozpoznawania kapu) do interakcji z końcem 5' mRNA. Kompleks rybosomów preinicjacyjnych 43S, który zawiera tRNA i eIF3 związany z eIF2, jest rekrutowany do końca 5' mRNA poprzez interakcję eIF4G z eIF3. Uważa się, że kompleks preinicjacyjny skanuje mRNA, wspomagany przez eIF4A (helikazę RNA) do momentu zlokalizowania kodonu start (AUG). Następnie tworzy się kompleks inicjacyjny 48S, a tRNA jest dostarczane do miejsca P rybosomu. Wreszcie, podjednostki rybosomów 60S i 40S są łączone, tworząc kompleks inicjacyjny 80S, po którym następuje wydłużenie translacji1,3,4. W przeciwieństwie do tego, wewnętrzne miejsca wejścia rybosomów (IRES) omijają wymóg czapki 5', rekrutując podjednostkę rybosomalną 40S bezpośrednio do kodonu inicjacyjnego3. Fizjologiczne warunki stresu osłabiają globalną translację mRNA ze względu na modyfikacje kluczowych ogólnych czynników inicjacji eukariotycznej (eIF). Jednak niekanoniczne mechanizmy inicjacji translacji pozwalają na selektywną translację niektórych mRNA, które często kodują białka odpowiedzi na stres, a rozregulowanie niekanonicznej inicjacji translacji jest związane ze stanami chorobowymi, takimi jak rak1,2. Dyskretne elementy regulatorowe RNA, takie jak komórkowe IRES, pozwalają na translację takich mRNA2,3.

Szczególnie interesującym aspektem kontroli translacyjnej jest zrozumienie mechanizmów kanonicznej kontra niekanonicznej translacji danego mRNA. Odcisk palca u nogi to technika, która pozwala na szczegółowe badanie mechanistyczne inicjacji translacji określonych RNA in vitro. Ogólnym celem odcisku palca u nogi jest ocena zdolności interesującego RNA do zarodkowania tworzenia kompleksu inicjującego translację z rybosomem w różnych warunkach, w celu określenia, które sekwencje, elementy strukturalne lub czynniki pomocnicze są wymagane do skutecznej inicjacji translacji. Na przykład rekrutacja rybosomów może być utrudniona w przypadku braku czapeczki 5', ale stymulowana przez obecność IRES.

Zasada tej techniki polega na transkrypcji in vitro interesującego RNA, inkubacji go w obecności ekstraktów komórkowych zawierających składniki translacji (lub oczyszczonych składników), aby umożliwić tworzenie się kompleksów inicjacyjnych i odwrotną transkrypcję RNA za pomocą określonego startera. Stabilne kompleksy RNA-rybosom spowodują zatrzymanie odwrotnej transkrypcji na krawędzi 3' rybosomu - tak zwany 'odcisk palca'5,6,7.

W tym protokole, podjednostki rybosomalne, eIFs, tRNA i czynniki transaktywne IRES (ITAFs) są wygodnie dostarczane przez lizat retikulocytów królika (RRL). Kolejną zaletą tego protokołu jest użycie znakowanego fluorescencyjnie startera i fluorescencyjnego żelu obrazującego zamiast startera znakowanego radioaktywnie. Eliminuje to dodatkowe czynności, w tym znakowanie radioaktywnie podkładu, a także suszenie żelu i wystawianie go na działanie intensyfikującego ekranu. Pasma fluorescencyjne są rejestrowane w czasie rzeczywistym, podczas pracy żelu, co pozwala na uzyskanie większej rozdzielczości. Jako przykład użyto tutaj nieograniczonego inhibitora białka apoptozy sprzężonego z chromosomem X (XIAP) IRES RNA, chociaż za pomocą tej techniki można również analizować mRNA z ograniczonym rdzeniem8.

W przeciwieństwie do analizy zachodniej, która mierzy końcowy wynik procesu translacji w lizatach komórkowych, odcisk palca u nogi jest podejściem in vitro do pomiaru tworzenia kompleksu inicjującego translację na RNA. To redukcjonistyczne podejście pozwala na bardzo szczegółowe badanie substratów lub czynników, które regulują inicjację translacji (np. mRNA z czapeczką lub bez niej, struktura IRES, obecność lub brak ogona poli-A, dostarczanie określonych czynników białkowych itp.). W związku z tym odcisk palca u nogi może być wykorzystany do badania różnych trybów translacji8 lub wpływu struktur mRNA, takich jak IRESes, na syntezę białek9,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: RNA jest bardzo podatne na degradację przez rybonukleazy (RNazy). Podejmij standardowe środki ostrożności, aby utrzymać RNA w stanie nienaruszonym. Często zmieniaj rękawice. Używaj filtrowanych końcówek do pipet, plastikowych naczyń niezawierających nukleaz i chemikaliów wolnych od nukleaz na wszystkich etapach protokołu. Do wszystkich roztworów należy używać wody wolnej od nukleaz lub uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC).

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj bufor do odcisków palców: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5% (w/v) sacharozy, 2 mM ditiotreitol (DTT) i 0,5 mM spermidyny.
    1. Przechowywać naziemną telewizję cyfrową i spermidynę w jednorazowych podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
      UWAGA: DTT i spermidynę należy dodać do bufora do odcisków palców u nóg bezpośrednio przed użyciem. Roztwór pozbawiony naziemnej telewizji cyfrowej i spermidyny można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować podwielokrotności 85 mM imidodifosforanu 5'-guanylilu (GMP-PNP) i 91 mM trifosforanu adenozyny (ATP). Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
  3. Przygotuj 450 ml mieszanki żelu mocznikowego 6% poliakryloamid i 7M: 67,5 ml 40% akryloamidu: bis-akryloamidu (19:1), 189 g mocznika, 112,5 ml 5x TBE (tris/boran/kwas tylenodiaminotetraoctowy (EDTA)) i 120 ml wody. Rozpuścić mocznik przez ogrzanie w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C lub na gorącej płycie, mieszając. Przefiltrować roztwór (np. filtr próżniowy nitrocelulozy 0,2 μm).
    UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej jeden miesiąc.
    Uwaga: Akrylamid monomeryczny jest neurotoksyną, która może być wchłaniana przez skórę. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć kontaktu ze skórą (tj. noś rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne). Z poliakrylamidem należy również obchodzić się ostrożnie, ponieważ polimeryzacja może nie przebiegać do 100% zakończenia.
  4. Przygotuj barwnik obciążający formamid: 95% formamidu, 18 mM EDTA, 0,025% (w/v) dodecylosiarczan sodu (SDS), 0,025% (w/v) błękit bromofenolowy, 0,025% (w/v) cyjanol ksylenowy. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Rozpuścić 1 nmol startera (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' na końcu znakowanym IRDye 800) w 100 μl wody do uzyskania stężenia roboczego 10 pmol/μL. Przechowywać w temperaturze -20 °C w jednorazowych porcjach (około 10 μl), chronić przed światłem.

2. Przygotowanie mRNA

  1. Amplifikacja matryc DNA do syntezy mRNA w drodze reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z odpowiednich matryc (tj. genomowego DNA lub plazmidowego DNA, w zależności od przypadku). Użyć polimerazy DNA o wysokiej wierności zgodnie z instrukcjami producenta, w następujących warunkach reakcji (35 cykli): stopienie, 98 °C, 10 s; wyżarzanie, 53 °C, 20 s; rozszerzać, 72 °C, 30 s.
    UWAGA: Starter do przodu (5' AAGCTTAATACGACTATAG) zawiera sekwencję promotora T7, aby umożliwić transkrypcję RNA; odwrócony starter (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) zawiera 51 reszt tyminy, aby zapewnić ogon poli-A dla transkrybowanego RNA. Należy pamiętać, że RNA może być również transkrybowane in vitro z plazmidowego DNA.
  2. Użyj odpowiedniego zestawu do transkrypcji in vitro RNA zawierającego IRES lub RNA z czapeczką z matrycy DNA. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować próbkę RNA w standardowych objętościach reakcyjnych 20 μl. Traktować nowo zsyntetyzowany RNA 2 jednostkami DNazy wolnej od RNaz przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Rozcieńczyć RNA poddane działaniu DNazy do 110 μl wodą bez nukleaz, dodać 110 μl kwaśnego fenolu, wirować 5 s i wirować przez 3 minuty przy 20 000 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć 100 μl fazy wodnej do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, dodać 10 μl 3 M octanu sodu i przemieszać 2 s. Dodać 3 objętości 100% etanolu, wirować 5 s i wytrącić RNA w temperaturze -20 °C przez noc.
  4. Wirować przy >20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Przemyć granulat 500 μl lodowatego etanolu o stężeniu 70% (v/v) i powtórzyć wirowanie. Zassać jak najwięcej supernatantu i suszyć osad na powietrzu przez 5 - 10 minut. Uważaj, aby nie usunąć granulki.
  5. Zawiesić RNA w odpowiedniej objętości wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać stężenie robocze 0,5 μg/μl. Można go przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast zużyć.

3. Reakcja odcisku palca u nogi

  1. Wymieszaj 15 μl lizatu retikulocytów królika (RRL, nie traktowany nukleazą), 1 μl (40 jednostek) inhibitora RNazy, 1 μl 91 mM ATP (1,82 mM końcowy) i 1 μl 85 mM GMP-PNP (1,7 mM końcowy) w probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 5 min.
    UWAGA: RRL powinien być podawany do jednorazowego użytku, aby uniknąć powtarzającego się zamrażania i rozmrażania. Krytyczna kontrola to reakcja, w której brakuje RRL, w celu wyjaśnienia naturalnych przerw w odwrotnej transkrypcji spowodowanych drugorzędową strukturą RNA. Dodaj bufor do odciskania palców, aby zastąpić RRL dla tej kontroli.
  2. Dodać 0,5 μg (1 μl) RNA i inkubować w temperaturze 30 °C przez 5 minut.
  3. Dodać 22 μl buforu do odcisków palców u nóg i inkubować w temperaturze 30 °C przez 3 minuty.
  4. Dodać 0,5 μl (5 pmol) startera znakowanego IRDye i inkubować na lodzie przez 10 minut.
  5. Dodać 2 μl 25 mM dNTP (końcowe stężenie: 1 mM każdy), 2 μL 100 mM Mg(OAc)2, 1 μl odwrotnej transkryptazy wirusa mieloblastozy ptaków (AMV-RT) i 3,5 μl buforu do odcisków palców u stóp. Ostateczna objętość to 50 μL.
  6. Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 45 minut.
  7. Dodać 200 μl wody wolnej od nukleaz i natychmiast ekstrahować 250 μl alkoholu fenolo-chloroformowego o proporcji 25:24:1 (pH około 8,0). Wirować 5 s i wirować przy 20 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć fazę wodną do nowej probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml, dodać 3 objętości 100% etanolu, wirować 5 s i wytrącać w temperaturze -20 °C przez noc.
  8. Wirować przy >20 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Przemyj osad DNA 500 μl lodowatego etanolu o stężeniu 70% (v/v). Wirować przy >20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odessać jak najwięcej supernatantu i suszyć granulki na powietrzu przez 5 - 10 minut. Uważaj, aby nie usunąć granulki.
  9. Rozpuść osad w 6 μl wody wolnej od nukleaz i dodaj 3 μl barwnika ładującego formamid.

4. Sekwencjonowanie reakcji

  1. Użyj matrycy DNA z 2.1 i startera znakowanego IRDye z kroku 3.4 dla standardowych reakcji sekwencjonowania, używając dideoksynukleotydów (ddNTP) jako terminatorów łańcucha. Użyj odpowiedniego zestawu do sekwencjonowania DNA i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Zmieszać 6 μl każdej reakcji sekwencjonowania z 3 μl barwnika ładującego formamid.

5. Przygotowanie żelu sekwencjonującego i elektroforeza

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje żel fluorescencyjny i żel o wymiarach 21 cm x 23 cm x 0,2 mm, ale może być dostosowany do innych sekwenserów lub rozmiarów żelu, jeśli jest to wymagane.

  1. Dokładnie wyczyść przekładki 0,2 mm oraz krótkie (23 × 25 cm) i długie (30 × 25 cm) szklane płytki 100% etanolem. Suszyć na powietrzu.
  2. Zmieszać 30 ml 6% mieszanki żelu mocznikowego poliakryloamid-7M z 200 μl 10% (w/v) nadsiarczanu amonu (APS) i 20 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Wlej żel, uważając, aby nie powstały bąbelki, i włóż grzebień żelowy "ząb rekina". Pozostawić żel do polimeryzacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Zmontuj aparaturę do sekwencjonowania i napełnij zbiorniki 1x TBE.
  4. Uruchomić przez 15 minut przy napięciu 1500 V, aż do osiągnięcia optymalnej temperatury 55 °C.
  5. Podgrzewać próbkę i mieszaninę barwnika ładującego (z etapów 3.9 lub 4.2) do temperatury 85 °C przez 5 minut. Załadować 1 μl na żel sekwencyjny.
  6. Uruchom żel pod napięciem 1500 V przez 8 godzin. Maszyna będzie odczytywać pasma w czasie rzeczywistym.
  7. Zdemontuj aparaturę i wyrzuć żel akrylowy oraz działający bufor.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniej opisaliśmy zdolność XIAP IRES do obsługi inicjacji translacji niezależnej od czapki in vitro8,10. Odcisk palca u nogi był kluczową techniką do badania mechanistycznych szczegółów kompleksu inicjacyjnego XIAP IRES. Konstrukt DNA kodujący mRNA zawierający XIAP IRES (Figura 1A) został przepisany in vitro i poddany analizie odcisku palca u nogi. Zastosowane tutaj zmutowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odcisk palca u nogi jest potężną techniką bezpośredniego pomiaru zdolności interesującego RNA do wspierania tworzenia kompleksów inicjujących translację w ściśle kontrolowanych warunkach. Protokół ten opisuje uproszczoną technikę odciskania palców u stóp RNA ssaków. Lizat retikulocytów królika (RRL) jest używany jako wygodne źródło rybosomów, eIF, inicjującego tRNA i czynników transakcyjnych IRES (ITAF). Eksperymentator podaje wybrane przez siebie RNA, a także może uzupełnić reakcję odcisku palca u nogi o określ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Radę Nauk Przyrodniczych i Inżynierii Kanady-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), Kanadyjską Fundację na rzecz Innowacji-John R. Evans Leaders Fund (35017), Campus Alberta Innovates Program oraz Ministerstwo Rozwoju Gospodarczego i Handlu Alberty.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DEPC (pirowęglan dietylu)SigmaD5758-100ML
Baza TRIS, UltrapureJT Baker4109-01
KOAc (octan potasu)Bio BasicPB0438
Mg(OAc)2 (tetrahydrat octanu magnezu)Bio BasicMB0326
Sacharoza, klasa biologii molekularnejCalbiochem573113-1KG
SpermidynaSigma85558
GMP-PNP (hydrat soli trisodowej 5′-[&beta,γ-imido]trifosforanu guanozyny) 0,1 M roztwórSigmaG0635
ATP (adenozyno-5&-trifosforan), roztwór 100 mM SigmaA6559
19:1 Akrylamid: bis-akrylamid, 40%Bio BasicA0006
MocznikBio BasicUB0148
500 ml jednostki filtracyjne do butelek, 0,2 i mikro; mSarstedt83.1823.101
FormamidSigmaF9037-100ML
EDTA (sól disodowa, dihydrat)Bio BasicEB0185
SDSBio BasicSB0485
Błękit bromofenolowyBio BasicBDB0001
Cyjanol ksylenowy FFBio BasicXB0005
MEGAskrót T7 zestaw do transkrypcjiAmbionAM1354
mMESSAGE mMACHINE Zestaw do transkrypcji T7AmbionAM1344
Kwas Fenol:Chloroform (5:1)AmbionAM9722
25:24:1 Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowyInvitrogen15593-049
Lizat retikulocytów królika (RRL). NIE powinien być traktowany nukleazą.Zielone Hektary, USASkontaktuj się z Green Hectares, poproś o 1:1 RRL:water
RiboLock RNaza Inhibitor (40 U/µ L)Thermo FisherE00382
100 mM dNTPsInvitrogen56172, 56173, 56174, 56175Wymieszaj równe części na zapas 25 mM każda.
AMV-RT, 10 U/&mikro; LPromegaM5101
Sequenase Version 2.0Thermo Fisher707701KT
Model 4200 IR2 Analizator DNALI-CORProdukt został wycofany
z produkcji APS (Nadsiarczan amonu)Bio BasicAB0072
TEMEDBio BasicTB0508
Phusion Polimeraza o wysokiej wiernościNowość Anglia BiolabsM0530
Turbo DnaseThermo FisherAM2238
Zestaw do sekwencjonowania DNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
  3. Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).
  4. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
  5. Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
  6. Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
  7. Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15(2010).
  8. Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
  9. Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
  10. Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
  11. Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
  12. Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
  13. Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
  14. Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
  15. Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
  16. Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295(2014).
  17. Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).
  18. Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

IRES Mediated TranslationRNA PurificationReverse TranscriptionPolyacrylamide Gel ElectrophoresisFluorescent ImagingRibosome BindingCap Dependent Initiation

Powiązane artykuły