Ten protokół opisuje nowo ustaloną metodę dostarczania wirusa do mysiej prostaty. Wykorzystując technologię CRISPR/Cas9, nadekspresję genów lub dostarczanie rekombinazy Cre, technika ta umożliwia ortotopową zmianę ekspresji genów i wdraża nowy mysi model raka prostaty.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Dostarczanie wirusów z przewodników CRISPR do mysiej prostaty w celu zmiany genów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wraz z rosnącą częstością występowania raka prostaty, identyfikacja nowych czynników lub modulatorów nowotworów jest kluczowa. Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) raka prostaty są utrudnione przez niejednorodność guza i jego złożoną dynamikę mikroewolucji. Tradycyjne mysie modele raka prostaty obejmują m.in. nokaut linii zarodkowej i warunkowy, transgeniczną ekspresję onkogenów i modele ksenoprzeszczepów. Generowanie mutacji de novo w tych modelach jest złożone, czasochłonne i kosztowne. Ponadto większość tradycyjnych modeli jest ukierunkowana na większość nabłonka prostaty, podczas gdy ludzki rak prostaty jest dobrze znany z tego, że ewoluuje jako izolowane zdarzenie tylko w niewielkim podzbiorze komórek. Wartościowe modele muszą symulować nie tylko inicjację raka prostaty, ale także progresję do zaawansowanej choroby.
Tutaj opisujemy metodę celowania w kilka komórek w nabłonku prostaty poprzez transdukcję komórek przez cząsteczki wirusa. Dostarczenie zmodyfikowanego wirusa do mysiej prostaty umożliwia zmianę ekspresji genów w nabłonku prostaty. Typ i ilość wirusa określi w ten sposób liczbę komórek docelowych do zmiany genów poprzez transdukcję kilku komórek do inicjacji raka i wielu komórek do terapii genowej. Poprzez chirurgiczne wstrzyknięcie w płat przedni, dystalny od drogi moczowej, guz w tym modelu może się rozszerzać bez upośledzenia funkcji oddawania moczu przez zwierzę. Ponadto, celując tylko w podzbiór komórek nabłonka prostaty, technika ta umożliwia klonalną ekspansję guza, a zatem naśladuje inicjację, progresję i inwazję ludzkiego guza przez błonę podstawną.
Ta nowatorska technika dostarcza potężnego modelu raka prostaty o ulepszonym znaczeniu fizjologicznym. Cierpienie zwierząt jest ograniczone, a ponieważ nie jest wymagana dodatkowa hodowla, ogólna liczba zwierząt jest zmniejszona. Jednocześnie przyspiesza się analizę nowych genów i szlaków kandydujących, co z kolei jest bardziej opłacalne.
Wprowadzenie
Wykrywanie i leczenie raka prostaty znacznie się poprawiło w ciągu ostatniej dekady. Mimo to częstość występowania raka prostaty wzrasta wraz ze średnią długością życia. Szacuje się, że na całym świecie jest to 1,1 miliona nowych przypadków, co czyni go jedną z najczęstszych przyczyn zgonów związanych z rakiem u mężczyzn 1. Rak prostaty rozwija się powoli, ale gdy rak rozwinie się do zaawansowanego stanu przerzutowego, rokowanie jest złe ze względu na ograniczone możliwości leczenia. Do tej pory tylko kilka genów zostało zidentyfikowanych jako wspólne czynniki powodujące ten nowotwór, a jego heterogeniczność i wieloogniskowość utrudnia wykrywanie biomarkerów i docelowych czynników choroby2,3.
Klasyczne techniki generowania GEMM-ów są często utrudnione przez ich złożoność, terminowość wydatków i koszty. Modele warunkowego nokautu są szeroko stosowane do badania genów kandydujących na raka prostaty, które powodują śmiertelność zarodka po inaktywacji w linii zarodkowej4. Najpopularniejsze modele obejmują specyficzną dla prostaty rekombinazę Cre napędzaną przez zmodyfikowany Probasin5 lub promotor PSA6 zintegrowany z GEMM poprzez dodatkowe krzyżowanie. W tych modelach gen będący przedmiotem zainteresowania będzie ukierunkowany na większość komórek nabłonka prostaty, generując przerost w całym narządzie, który może upośledzać funkcję dróg moczowych zwierzęcia7.
Wirusowe dostarczenie białka Cre poprzez wstrzyknięcie do przedniego płata mysiej prostaty może rozwiązać ten problem, celując tylko w kilka komórek8. Biorąc pod uwagę wymagania techniczne, wiedzę specjalistyczną i cele laboratoriów, metoda ta korzysta z szerokiego zakresu możliwych wariantów. Wykazano między innymi skuteczne podejścia wykorzystujące adenowirusa ukierunkowanego na JunB i Pten9 lub lentiwirusa ukierunkowanego na Pten i Trp5310. Dodanie transgenów, takich jak lucyferaza, do konstruktu wirusa lub do GEMM umożliwi ponadto nieinwazyjne monitorowanie postępu choroby za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego11.
Edycja genomu oparta na technologii CRISPR/Cas9 otwiera nowe i szybkie możliwości badania raka poprzez szybkie generowanie somatycznych nokautów12. Wirusowe dostarczanie pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA) skierowanych do przedniego płata mysiej prostaty ustanawia fizjologicznie bardziej odpowiedni model raka prostaty. W ten sposób pojedyncze komórki przenoszące wybrane mutacje mogą tworzyć klony, które są zdolne do ekspansji i inwazji. Co więcej, zastosowanie przewodnikowych RNA dla wielu genów docelowych pozwoli na wygenerowanie klonów komórek ze zmianami w różnych genach. Pozwoli to na niejednorodność guza i presję selekcji naturalnej na progresję raka, co może ujawnić znaczenie każdej zmiany genu lub mechanizmów epistatycznych.
Tutaj prezentujemy metodę dostarczania cząsteczek wirusa do mysiej prostaty w celu zmiany ekspresji genów. Przez małe nacięcie brzucha odsłania się mysi przedni płat prostaty i do niego wstrzykiwane są cząsteczki wirusa. Pięć dni po operacji klipsy chirurgiczne można usunąć ze skóry, a rak gruczołu krokowego można analizować od 8 tygodni po. Ogólnie rzecz biorąc, jest to szybka i opłacalna procedura, która ma niewielki wpływ na mysz i pozwala na rozwój większego guza bez narażania myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół obejmuje zabieg chirurgiczny na myszach laboratoryjnych. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach muszą być indywidualnie oceniane i zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystywania (IACUC). Ponieważ podejście to opiera się na powrocie do zdrowia i przeżyciu zwierząt, należy przez cały czas zapewnić odpowiednie znieczulenie, leczenie bólu i aseptyczne środowisko chirurgiczne. Użyj poduszki grzewczej, aby zapobiec hipotermii podczas operacji i do czasu powrotu do zdrowia po znieczuleniu.
1. Uwagi na początek
- W zależności od użytego wirusa mogą obowiązywać różne wymagania dotyczące miana; należy odpowiednio rozcieńczyć wirusa.
UWAGA: W tym przykładzie wirus związany z adenowirusem rozcieńczony w PBS jest wstrzykiwany przy mianie 1 x 1012 j.m./ml. Wirus ma serotyp 9 i zawiera przewodnik RNA do Pten oraz ekspresję białka Cre pod promotorem ubikwityny (Ryc. 1). Utrata Pten zwiększyła pAKT i proliferację nabłonka gruczołu krokowego13. - Używaj samców myszy w wieku 8 tygodni w momencie operacji, aby zapewnić odpowiedni rozwój prostaty.
UWAGA: Myszy pokazane w tym eksperymencie to myszy knockin Rosa26-LSL-Cas9-EGFP na tle C57BL/6J12 (Rysunek 1). - Świeżo przygotuj mieszankę do znieczulenia ogólnego i, jeśli to możliwe, utrzymuj ją w sterylnej formie.
UWAGA: Aby zapewnić lepszą rekonwalescencję zwierząt po operacji, zdecydowanie zaleca się stosowanie antidotum w postaci znieczulenia.- Aby przygotować całkowitą objętość 5 ml środka znieczulającego, zmieszaj 0,15 ml chlorowodorku medetomidyny (1 mg/ml), 0,4 ml midazolamu (5 mg/ml) i 0,25 ml butorfanolu (10 mg/ml) z 4,2 ml sterylnej wody z solą fizjologiczną.
UWAGA: Alternatywne metody znieczulenia, takie jak wziewny izofluran, mogą być stosowane zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi opieki nad zwierzętami. - Aby odwrócić działanie chlorowodorku medetomidyny po operacji, należy zmieszać 0,1 ml atipamezolu (5 mg/ml) z 4,9 ml sterylnej wody z solą fizjologiczną.
- Aby przygotować całkowitą objętość 5 ml środka znieczulającego, zmieszaj 0,15 ml chlorowodorku medetomidyny (1 mg/ml), 0,4 ml midazolamu (5 mg/ml) i 0,25 ml butorfanolu (10 mg/ml) z 4,2 ml sterylnej wody z solą fizjologiczną.
- Przygotuj aseptyczne środowisko chirurgiczne poprzez odpowiednią dezynfekcję i sterylizację. Autoklaw narzędzi chirurgicznych przed użyciem.
2. Dostarczanie wirusa do mysiej prostaty
- Znieczulić zwierzę przez wstrzyknięcie dootrzewnowe za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i igły 27G x 1/2". Stosować dawkę znieczulenia 0,01 ml/g masy ciała. Jeśli zabieg trwa dłużej niż 30 minut, należy zachować znieczulenie, wstrzykując 1/3 dawki początkowej co 30 minut.
- Zbadaj głębokość znieczulenia, oceniając rozluźnienie mięśni, wycofanie pedału i odruchy powiekowe. Gdy zaobserwuje się utratę odruchów, ogol dolną część brzucha zwierzęcia.
- Ostrożnie zakryj oczy zwierzęcia weterynaryjną maścią okulistyczną za pomocą sterylnego bawełnianego wacika, aby zapobiec ślepocie z powodu braku odruchu rogówkowego.
- Przetrzyj ogolony brzuch 70% etanolem i 10% jodowidonem, aby zdezynfekować obszar operacyjny. Wyszoruj obszar operacyjny od środka pola operacyjnego w kierunku obwodu.
- Wykonaj pionowe nacięcie skóry w dolnej linii środkowej brzucha na wysokości około 1 cm za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych.
- Podnieś otrzewną za pomocą cienkich kleszczy, aby zapobiec uszkodzeniu narządów, które leżą pod spodem. Ostrożnie wykonaj < nacięcie 8 mm nożyczkami chirurgicznymi przez otrzewną.
UWAGA: W przeciwieństwie do człowieka, gruczoł krokowy gryzonia składa się z czterech oddzielnych płatów. Płat przedni jest przymocowany do pęcherzyka nasiennego. - Delikatnie odsuń tkankę tłuszczową na bok, aby odsłonić pęcherzyk nasienny. Za pomocą kleszczy pierścieniowych ostrożnie podnieś pęcherzyk nasienny, aż będzie można zidentyfikować przednią część prostaty (Ryc. 1).
- Wstrzyknąć całkowitą objętość 30 μl roztworu wirusa (3 x10 10 cząstek wirusa) do przedniego nabłonka gruczołu krokowego za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,5 ml z igłą 30 g x 8 mm. Zminimalizuj wyciek i upewnij się, że płyn został wchłonięty w tkance, tworząc mały pęcherzyk. Umieść pęcherzyk nasienny z powrotem w jamie brzusznej.
- Zszyj otrzewną za pomocą 2-3 prostych szwów przerywanych za pomocą szwów wchłanialnych 6-0 z kołem 13 mm, 3/8 i igłą stożkową.
- Zszyj skórę 3 sterylnymi klipsami o wymiarach 4,8 x 6,5 mm, unosząc skórę kleszkami, aby uniknąć uszkodzenia otrzewnej.
- W celu lepszej rekonwalescencji należy zastosować antidotum na znieczulenie w dawce 0,01 ml/g masy ciała we wstrzyknięciu dootrzewnowym za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i igły 27G x 1/2". Ostrożnie umieść zwierzę z powrotem w klatce.
3. Zabiegi pooperacyjne
- Trzymaj klatkę z myszami, które przeszły operację, na poduszce grzewczej przez 1 godzinę po zabiegu, aby zapobiec hipotermii do czasu pełnego wyzdrowienia. W przypadku zastosowania antidotum, zwierzę powinno być przytomne kilka minut po wstrzyknięciu.
- Codziennie monitoruj zwierzęta pod kątem prawidłowego gojenia się ran i wskazań bólowych. W razie potrzeby podaj dodatkowe środki przeciwbólowe zgodnie z wytycznymi instytucji opieki nad zwierzętami.
- Usuń klipsy do skóry po 4-5 dniach, po zamknięciu rany.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby ocenić dostarczenie wirusa do prostaty mysiej, próbki przeanalizowano trzy miesiące po zabiegu. Myszy Rosa26-LSL-Cas9-EGFP12 wykazują ekspresję GFP w komórkach, które zostały poddane działaniu białka Cre wyrazonego przez wirusa. Próbki prostaty badano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu zidentyfikowania obszarów z sygnałem GFP (Rycyna 2A). Sygnał GFP wskazuje na aktywność Cre w nabłonku prostaty, ale nie określa, czy dosz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole opisujemy metodę zmiany ekspresji genów w przednim płacie mysiej prostaty poprzez wstrzyknięcie wirusa, tworząc potężny nowy mysi model raka prostaty (ryc. 2). Skuteczne podanie adenowirusa zostało po raz pierwszy opisane przez Leow i wsp. w 2005 r.8. Wcześniej pokazaliśmy, w jaki sposób adenowirus kodujący białko rekombinazy Cre może zastąpić czasochłonne krzyżowanie allelu Cre w celu delecji specyficznej dla tkanki 9 ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
MR został sfinansowany przez stypendium Duńskiego Towarzystwa Onkologicznego (R146-A9394-16-S2). MFB i MKT zostały sfinansowane przez AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). MR i MFB były współfinansowane przez Graduate School, HEALTH, AU. Laboratorium E.F.W. jest wspierane przez granty hiszpańskiego Ministerstwa Gospodarki (SAF2015-70857, współfinansowane przez EFRR-UE) oraz zaawansowany grant ERC (741888 - CSI-Fun).
Chcemy podziękować Lilianie Fajardo Mellor (Geny, Rozwój i Choroba; National Cancer Research Center) za krytyczną lekturę manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J myszy | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 strzykawka insulinowa | BD | 324825 | do wstrzykiwań wirusa |
| 1 ml strzykawka | BD | 300013 | do wstrzykiwań anestezjologicznych |
| 30 G 1/2' ' igła | BD | 304000 | do wstrzykiwań anestezjologicznych |
| 6-0 Szew Polysorb | Medtronic | GL889 | do zamknięcia otrzewnej |
| Jednorazowa sterylizowana serweta chirurgiczna | wielu dostawców | ||
| Poduszka grzewcza | wielu dostawców | ||
| Podkładka przygotowawcza powidonowo-jodowa | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Przycinanie maszyna | Aesculap | GT415 | do golenia brzucha |
| Kleszcze Dumont | FST | 11252-00 | |
| Mikro uchwyt na igły Halsey | FST | 12500-12 | |
| Nożyczki do tęczówki | FST | 14094-11 | |
| Kleszcze wąskie | 11002-12 | ||
| Kleszcze pierścieniowe | FST | 11106-09 | |
| System klipsów do ran Uchwyt wraz z klipsami | FST | 12030-01 | do zamykania skóry |
| System spinania ran Remover | FST | 12030-04 | |
| Mikroskop | Leica | różne modele | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | uzyskany z zakładu dla zwierząt | ||
| Butorfanol | uzyskany z zakładu dla zwierząt | ||
| medetomidyny | uzyskany z zakładu dla zwierząt | ||
| Midazolam | uzyskany w obiekcie dla zwierząt | ||
| 100% etanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Maść do oczu | Takeda | 7242 | |
| Wirus (AAV, AV) | wielu dostawców | wirus używany w tym protokole jest własnym produkcją | |
| przeciwciało pAKT | CST | 4060 | używane rozcieńczenie 1:200 GFP |
| anitbody | CST | 2956 | używane rozcieńczenie 1:100 |
Bibliografia
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454(2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
