Method Article

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

DOI:

10.3791/57543

⸱

May 21st, 2018

 ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Efektywna i solidna izolacja i hodowla pierwotnych oligodendrocytów (OL) jest cennym narzędziem do badań in vitro rozwoju oligodendroglii, jak również biologii chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane i choroba Pelizaeus-Merzbacher (PMLD). W tym miejscu przedstawiamy prostą i skuteczną metodę selekcji immunomagnetycznej izolacji komórek preoligodendrocytów O4 + w trzecim etapie od nowonarodzonych szczeniąt myszy. Ponieważ niedojrzałe OL stanowią ponad 80% istoty białej mózgu gryzonia w 7. dniu po urodzeniu (P7), ta metoda izolacji nie tylko zapewnia wysoką wydajność komórkową, ale także specyficzną izolację OL już zaangażowanych w linię oligodendroglialną, zmniejszając możliwość wyizolowania komórek zanieczyszczających, takich jak astrocyty i inne komórki, z mózgu myszy. Metoda ta jest modyfikacją opisanych wcześniej technik i zapewnia czystość preparatu oligodendrocytów powyżej 80% w ciągu około 4 godzin.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligodendrocyty (OL) to mielinizujące się komórki ośrodkowego układu nerwowego (OUN)1. Izolacja i hodowla pierwotnych oligodendrocytów w ściśle regulowanym środowisku jest cennym narzędziem do badań in vitro rozwoju oligodendroglii, a także biologii chorób demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane2. Wymaga to wydajnej i solidnej metody izolacji i hodowli oligodendrocytów3. W tym badaniu wykorzystaliśmy ekspresję charakterystycznego markera powierzchni komórek oligodendrocytów, aby wdrożyć zmodyfikowaną technikę izolacji, która jest szybka i specyficzna.

Zidentyfikowano cztery odrębne etapy dojrzewania oligodendrocytów, z których każdy charakteryzuje się ekspresją charakterystycznych markerów powierzchni komórki dla każdego etapu rozwoju (Rysunek 1). Te markery powierzchni komórek mogą być rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała4,5 i mogą być używane do izolowania OL na określonych etapach. W pierwszym etapie komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC) mają zdolność do proliferacji, migracji, a specyficznie ekspresji receptora czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGF-Rα)6, gangliozyd A2B5, proteoglycan NG27,8, wielosasikalna cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych9 i białko wiążące kwasy tłuszczowe 7 (FABP7)10. OPC mają dwubiegunową morfologię z kilkoma krótkimi procesami emanującymi z przeciwległych biegunów ciała komórki, co jest charakterystyczne dla neuronalnych komórek prekursorowych11.

Diagram dojrzewania oligodendrocytów; stadia z markerami: OPC, Preoligodendrocyty, Niedojrzałe, Dojrzałe.
Rycina 1: Ekspresja markerów powierzchni komórki podczas rozwoju oligodendrocytów myszy. Markery powierzchniowe komórek OL, takie jak A2B5, GalC (O1), NG2, O4 i PDGF-Rα, mogą być używane do specyficznej izolacji oligodendrocytów na określonym etapie rozwoju przy użyciu specyficznych przeciwciał. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W drugim etapie, OPC powodują powstawanie preoligodendrocytów i wyrażają na błonie komórkowej nie tylko markery OPC, ale także sulfatyd (siarczanowy galaktolipid) rozpoznawany przez przeciwciało O412,13, oraz białko GPR1714, które utrzymuje się aż do stadium niedojrzałych oligodendrocytów (OL). Na tym etapie preoligodendrocyty wydłużają wielobiegunowe krótkie procesy. Preoligodendrocyty są głównym stadium OL w 2. dniu po urodzeniu (P2) w istocie białej mózgu zarówno szczura, jak i myszy z niewielką populacją niedojrzałych OL15.

Podczas trzeciego etapu, niedojrzałe OL kontynuują ekspresję O4, tracą ekspresję markerów A2B5 i NG2 i zaczynają wyrażać galaktocerebrozyd C16. Na tym etapie OL są zaangażowane w linię oligodendroglialną i stają się komórkami postmitotycznymi z długimi, rozgałęzionymi gałęziami17,18. Niedojrzałe OL stanowią ponad 80% istoty białej gryzoni w P7 i w tym czasie obserwuje się pierwsze komórki MBP+15,19,20,21. Dlatego izolacja OL w P7 może zapewnić wysoką wydajność komórkową.

W końcowym i czwartym etapie rozwoju OL, dojrzałe OL wyrażają białka mielinizujące (podstawowe białko mieliny (MBP), białko proteolipidowe (PLP), glikoproteina związana z mieliną (MAG) i glikoproteina oligodendrocytów mielinowych (MOG)22,23,24,25,26. Na tym etapie dojrzałe OL rozciągają błony, które tworzą zwarte osłonki otaczające aksony i są zdolne do mielinizacji. Zbiega się to z obserwacją, że w mózgach szczurów i myszy komórki MBP+ stają się coraz liczniejsze w P1419,20,21.

Od czasu pierwszej izolacji oligodendrocytów przez Fewstera i współpracowników w 1967 roku27, zaimplementowano kilka metod izolacji OL z OUN gryzoni, w tym immunopanning28,29,30, sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) wykorzystujące antygeny specyficzne dla powierzchni komórki28,31, wirowanie w gradiacji różnicowej32,33,34,35 i metoda wstrząsania oparta na zróżnicowanym przyleganiu różnych glejów OUN gleju36,37. Jednak istniejące metody hodowli mają ograniczenia, szczególnie pod względem czystości, wydajności i czasu wymaganego do wykonania procedur38. Dlatego potrzebne są bardziej wydajne metody izolacji oligodendrocytów.

W tym artykule prezentujemy prostą i efektywną metodę selekcji immunomagnetycznej izolacji komórek preoligodendrocytów trzeciego stopnia O4+ od nowonarodzonych szczeniąt myszy. Metoda ta jest modyfikacją technik opisanych przez Emery'ego i wsp.39 oraz Dincman et al.40 i zapewnia czystość preparatu oligodendrocytów powyżej 80% w ciągu około 4 godzin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy użyte w tym badaniu były opiekowane zgodnie z wytycznymi SUNY Downstate Medical Center Division of Laboratory Animal Resources (DLAR) numer protokołu 15-10492.

UWAGA: Pierwotne oligodendrocyty zostały wyizolowane od noworodków (P5-P7 typu dzikiego C57Bl/6N) myszy. Na tym etapie niedojrzałe OL stanowią ponad 80% istoty białej gryzoni, zapewniając wysoką wydajność komórkową. Wszystkie kompozycje i odczynników są dostępne na końcu tabeli materiałów.

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (PDL)/lamininą powinny być przygotowane przed izolacją OL.

  1. Umieść niemieckie szklane szkiełka nakrywkowe #1 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 35 ml 70% EtOH, aby je wyczyścić.
  2. Zamknij probówkę, umieść ją w mieszadle nutacyjnym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, delikatnie kołysząc. Szkiełka nakrywkowe można inkubować przez noc.
  3. Wyrzuć 70% EtOH.
  4. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy wodą dejonizowaną, za każdym razem usuwaj wodę przy zasysaniu próżniowym.
  5. Dodaj 30-35 ml PDL 50 μg/ml do szkiełek nakrywkowych w probówce o pojemności 50 ml, wystarczająco dużo, aby przykryć szkiełka nakrywkowe.
  6. Umieścić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą szkiełka nakrywkowe na mieszadle nutującym i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, delikatnie kołysząc.
  7. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy wodą dejonizowaną, usuwając wodę za każdym razem za pomocą zasysania próżniowego.
  8. Przenieść szkiełka nakrywkowe na 60-milimetrowe szalki Petriego zawierające wodę dejonizowaną.
  9. Za pomocą końcówki pipety P200 ułóż szkiełka nakrywkowe jako warstwę pokrywającą całą powierzchnię szalki Petriego.
  10. Ostrożnie usuń wodę z naczyń za pomocą aspiracji próżniowej.
  11. Usuń nadmiar wody wokół szkiełek nakrywkowych i pozostaw je do wyschnięcia na noc przy otwartej pokrywie i pod światłem UV w kapturze.
    UWAGA: Szkiełka nakrywkowe ze szkła powlekanego PDL można przechowywać w temperaturze 4 °C na sterylnych szalkach Petriego przez okres do trzech miesięcy.
  12. Umieść szkiełka nakrywkowe na płytkach 24-dołkowych, po jednej na dołek, za pomocą cienkich kleszczyków.
  13. Przesuń szkiełka nakrywkowe na środek studni, upewniając się, że krawędzie nie dotykają ściany studni.
  14. Dodać 100 μl 10 μg/ml lamininy rozcieńczonej w B27NBMA (patrz tabela materiałów), zaczynając od środka każdego szkiełka nakrywkowego i przesuwając się okrężnie w kierunku krawędzi, aby pokryć całą powierzchnię.
    UWAGA: Ponieważ laminina bierze udział w utrzymaniu OL i sprzyja różnicowaniu się do dojrzałych OL, jest ważnym czynnikiem przeżycia OL w hodowli in vitro41,42,43,44.
  15. Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę lub do momentu, gdy OL będą gotowe do posiewu.

2. Dysocjacja kory mózgowej myszy

  1. Składanie w ofierze 5-7-dniowych szczeniąt myszy C57Bl/6N po urodzeniu przez szybkie ścięcie nożyczkami uprzednio oczyszczonymi w 70% etanolu.
    UWAGA: Do każdego preparatu użyto kory mózgowej od 5-6 nowonarodzonych szczeniąt myszy. Średnio jeden mózg myszy daje 1-1,5 x 106 OL.
  2. Przetnij skórę głowy wzdłuż linii środkowej małymi nożyczkami preparacyjnymi i cofnij się, aby odsłonić czaszkę.
  3. Ostrożnie przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej, zaczynając od otworu w tylnej części czaszki w kierunku obszaru czołowego, podnosząc nożyczkami, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. Następnie, korzystając z otworu w tylnej części czaszki, przeciąć w kierunku każdego oczodołu wzdłuż podstawy czaszki.
  4. Użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie odsunąć korę mózgowia od śródmózgowia i przenieś je do 60-milimetrowej naczynia do hodowli tkankowej zawierającej 7 ml B27NBMA. Powtórz kroki od 2.2 do 2.4 dla każdego mózgu, łącząc wypreparowaną korę mózgową.
  5. Przenieś korę do nowego 60-milimetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 5 ml buforu dysocjacyjnego (B27NBMA, 20-30 U/ml papainy i 2,500 U DNazy I).
  6. Pokrój korę na małe kawałki o wielkości około 1 mm3 za pomocą ostrza skalpela #15 i inkubuj przez 20 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Dodać 1 ml surowicy wzrostu bydła (BGS), aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.
  8. Przenieść korę wraz z pożywką dysocjacyjną do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
  9. Delikatnie rozpocznij dysocjację tkanki mózgowej, powoli pipetując w górę i w dół 6-8 razy za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, zwracając uwagę na zminimalizowanie pęcherzyków.
  10. Pozwól kawałkom tkanki osiąść przez 2-3 minuty i przenieś supernatant do świeżej probówki.
  11. Dodać 3 ml B27NBMA zawierającej 10% BGS/2500 U DNazy I do osadu tkankowego.
  12. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml, aby delikatnie zdysocjować tkankę mózgową podczas pipetowania w górę i w dół 6-8 razy. Uważaj, aby zminimalizować bąbelki.
  13. Pozwól kawałkom tkanki osiąść przez 2-3 minuty.
  14. Przenieść supernatant do świeżej probówki. Dodać 3 ml B27NBMA zawierającej 10% BGS/DNazy I do osadu tkankowego.
  15. Delikatnie rozdzielić tkankę mózgową za pomocą końcówki do pipety P1000, jednocześnie pipetując mieszaninę pożywki i tkanki mózgowej w górę iw dół. Powtarzać kroki 2.13 i 2.14 do momentu, gdy nie pozostaną żadne duże kawałki tkanki lub do wyczerpania B27NBMA zawierających 10% BGS/DNazy I, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Uważaj, aby zminimalizować bąbelki.
  16. Zawiesina komórek basenowych z poprzednimi supernatantami.
  17. Umieść sitko o średnicy 70 μm w probówce o pojemności 50 ml. Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml delikatnie przepuścić zawiesinę komórek zebranych w puli przez sitko o wielkości 70 μm.
  18. Przemyć sitko do komórek, dodając 1 ml B27NBMA zawierającej 10% BGS/DNazy I.
  19. Wyrzuć sitko do komórek. Doprowadzić objętość do 30 ml za pomocą B27NBMA zawierających 10% BGS/DNazy I.
  20. Przenieść zawiesinę komórek do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut przy 200 x g.
  21. Usunąć supernatant bez pozostawiania komórek wystawionych na działanie powietrza. Supernatant będzie mętny z powodu resztek komórkowych. Do granulki dodać 3 ml B27NBMA zawierającego 10% BGS.
  22. Ostrożnie oddzielić osad komórkowy za pomocą pipety P1000. Doprowadzić objętość do 15 ml za pomocą B27NBMA zawierającej 10% BGS.
  23. Przepuścić zawiesinę komórek przez świeże sitko o wielkości 40 μm.
  24. Umyj sitko do komórek, dodając 1 ml B27NBMA zawierającego 10% BGS. Wyrzuć sitko do komórek.
  25. Doprowadzić objętość do 30 ml za pomocą B27NBMA zawierających 10% BGS.
  26. Przenieść zawiesinę komórek do 2 stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórek przez 10 minut przy 200 x g.
  27. Usunąć większość supernatantu, nie pozostawiając komórek wystawionych na działanie powietrza. Ponownie zawiesić granulki komórek w 5 ml lodowatego bufora do magnetycznego sortowania komórek (MCS).

3. Określanie liczby komórek i żywotności

  1. Rozcieńczyć 100 μl zawiesiny komórek w 400 μl roztworu błękitu trypanowego w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać rozcieńczenie 1:5 w 0,4% (w/v).
  2. Wyśrodkuj szklankę nakrywkową nad komorą hemocytometru i napełnij dwie komory 10 μl rozcieńczenia komórek za pomocą pipety P10, unikając przepełnienia. Roztwór przejdzie pod szkłem nakrywkowym przez działanie kapilarne.
  3. Umieść hemocytometr na stoliku mikroskopu i wyreguluj ostrość za pomocą 40-krotnego powiększenia.
    UWAGA: Zliczanie komórek jest rejestrowane za pomocą ręcznego licznika w każdym z pięciu kwadratów (cztery rogi i jeden środek). Tylko komórki niezdolne do życia wchłaniają barwnik i wydają się niebieskie, podczas gdy żywe i zdrowe komórki wydają się okrągłe i załamują i nie wchłaniają barwnika o niebieskim kolorze, co pozwala na określenie liczby żywotnych i całkowitych komórek na mililitr.

4. Izolacja oligodendrocytów O4+

  1. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 10 min.
  2. Ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą aspiracji próżniowej, unikając wystawienia komórek na działanie powietrza.
  3. Zawiesić osad w 90 μl buforu MCS na 1 x10 7 komórek ogółem, a następnie dodać 10 μl kulek anty-O4 na 1 x 107 komórek.
  4. Wymieszaj zawiesinę komórek i kulki, delikatnie przesuwając stożkową probówkę o pojemności 15 ml palcem 4-5 razy.
  5. Inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 4 °C, przesuwając palcem stożkową probówkę o pojemności 15 ml 4-5 razy co 5 minut co 5 minut.
  6. Przemyj mieszankę, delikatnie dodając 2 ml buforu MCS na 1 x 107 komórek do probówki. Odwirować mieszaninę przy 200 x g przez 10 minut.
  7. Odrzucić supernatant ostrożnie za pomocą aspiracji próżniowej, unikając wystawienia komórek na działanie powietrza. Zawiesić osad komórkowy w 500 μl buforu MCS na każde 1 x10 7 komórek.
  8. Przymocuj separator magnetyczny do stojaka separatora magnetycznego. Przymocuj kolumnę selekcyjną do separatora magnetycznego i umieść sitko o pojemności 40 μm na górze kolumny. Umieść dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml lub jedną stożkową o pojemności 50 ml poniżej kolumny separacyjnej, aby zebrać przepływ.
  9. Wstępnie przepłukać sitko komórkowe o średnicy 40 μm i kolumnę separacyjną 3 ml buforu MCS i pozostawić bufor przez kolumnę, nie dopuszczając do jej wyschnięcia.
  10. Dodaj mieszaninę zawiesiny komórek i kulek do sitka do komórek i do kolumny wyboru.
  11. Przemyć sitko o długości 40 μm 1 ml buforu MCS.
  12. Wyrzuć sitko do komórek i pozwól, aby mieszanina komórek, kulek i buforu przepłynęła przez kolumnę, nie dopuszczając do jej wyschnięcia.
  13. Przemyć kolumnę separacyjną 3 razy 3 ml buforu MCS i 1 raz pożywką proliferacyjną OL.
  14. Wyjmij kolumnę separacyjną z separatora magnetycznego, szybko umieść ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i natychmiast dodaj 5 ml pożywki proliferacyjnej OL.
  15. Umieść tłok na górze kolumny i mocno dociśnij, aby wypłukać oznaczone komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  16. Usunąć 100 μl zawiesiny komórek w celu określenia liczby komórek i żywotności za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru, jak wskazano w sekcji 3.
    UWAGA: Żywotność komórek powyżej 80% jest uważana za dopuszczalną do kontynuowania hodowli OL, ale żywotność większa niż 90% jest optymalna.

5. Posiewanie izolowanych oligodendrocytów O4+

  1. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do pożądanej gęstości posiewu (5 x 105 komórek na szkiełko nakrywkowe) za pomocą pożywki do proliferacji OL.
    UWAGA: Gęstość wysiewu OL jest bardzo ważna, dlatego przed przystąpieniem do pracy należy potwierdzić odpowiednią gęstość komórek za pomocą mikroskopu kultur tkankowych. Gęstość wysiewu poniżej 10 000 komórek/szkiełek nakrywkowych może prowadzić do słabej przeżywalności komórek. Przy gęstości posiewu od 10 000 do 25 000 zróżnicowanie morfologiczne OL jest powolne45. Talerzujemy OL z gęstością wysiewu co najmniej 50 000 komórek/szkiełek nakrywkowych, aby zapewnić przeżycie komórek.
  2. Przenieść 24-dołkowe płytki zawierające szkiełka nakrywkowe pokryte lamininą z inkubatora do kaptura do hodowli tkankowych.
  3. Usunąć lamininę z każdego szkiełka nakrywkowego i zastąpić ją 100 μl zawiesiny OL.
  4. Inkubować OL w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 przez maksymalnie 45 minut, aby zwiększyć przyczepność OL do szkiełek nakrywkowych.
  5. Po inkubacji wyjąć 24-dołkowe płytki z inkubatora. Zalać każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 500 μl pożywki proliferacyjnej OL.
  6. Umieścić OL z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 na dodatkowe 24 godziny.
  7. 24 godziny po posianiu OL usunąć pożywki proliferacyjne i zastąpić je pożywkami różnicującymi OL w celu wywołania różnicowania.
  8. Umieść OL z powrotem w inkubatorze i nie usuwaj, dopóki komórki nie będą gotowe do utrwalenia.
    UWAGA: Zmiany pH są szkodliwe dla OL i zmniejszają żywotność komórek, dlatego należy unikać niepotrzebnego usuwania kultur OL z inkubatora.

6. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. W celu wykrycia markerów powierzchniowych komórek (NG2, O1 i O4) należy usunąć pożywkę z dołków.
  2. Dodać 250 μl supernatantów mysiego hybrydoma zawierających pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko O1 (nierozcieńczonemu)13 i O4 (nierozcieńczone)13 i poliklonalnego królika przeciwko NG2 (1:150 rozcieńczony w B27NBMA).
    UWAGA: Jeśli mają być stosowane dostępne na rynku przeciwciała anty-O1 i anty-O4, zaleca się stosowanie rozcieńczeń sugerowanych przez producenta.
  3. Inkubować komórki z przeciwciałem pierwszorzędowym maksymalnie przez 45 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 .
  4. Umyć dwukrotnie 0,05% Tween-20/1X PBS. Utrwal komórki 4% paraformaldehydem (4% PFA) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Umyj trzy razy po 5 minut z 0,05% Tween-20/1X PBS.
  6. Rozcieńczyć Alexa 488-sprzężone z kozią przeciwciałem anty-mysim IgM lub anty-króliczym przeciwciałem drugorzędowym IgG (1:400) w B27NBMA.
  7. Usuń 0,05% Tween-20/1X PBS z szkiełek nakrywkowych. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  8. Umyj trzy razy po 5 minut z 0,05% Tween-20/1X PBS.
  9. W przypadku podwójnego barwienia w celu wykrycia markerów wewnętrznych (GFAP) należy usunąć 0,05% Tween-20/1X PBS i zablokować/przeniknąć komórki buforem blokowym/permeabilizacyjnym przez 15 minut w temperaturze pokojowej. W przeciwnym razie przejdź do kroku 6.17.
  10. Usunąć bufor blokowy/permeabilizacyjny i dodać 250 μl anty-GFAP kurczaka (1:100) rozcieńczonego w buforze blokowym/permeabilizacyjnym.
  11. Inkubować komórki z anty-GFAP przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj trzy razy po 5 minut z 0,05% Tween-20/1X PBS.
  12. Rozcieńczyć sprzężone z Alexa 594 kozie przeciwciało anty-drugorzędowe IgG kurczaka (1:400) w B27NBMA.
  13. Usuń 0,05% Tween-20/1X PBS z szkiełek nakrywkowych. Inkubować komórki z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  14. Umyj trzy razy po 5 minut z 0,05% Tween-20/1X PBS.
  15. Przeciwbarwić 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) i zamontować ogniwa za pomocą pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu zawierającej DAPI.
  16. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze pokojowej.
  17. Zobrazuj barwione komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.
    UWAGA: W tym protokole komórki zostały zobrazowane w 40-krotnym powiększeniu przy użyciu jednolitego czasu ekspozycji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego badania było opracowanie ulepszonej metody izolacji pierwotnych oligodendrocytów myszy O4+, wymagającej jak najmniejszej manipulacji komórkami docelowymi. Cała procedura, od eutanazji szczeniąt do posiewu komórek w szkiełkach nakrywkowych, trwa około 4 godzin, a przedstawione tutaj dane reprezentują trzy niezależne eksperymenty. Po dysocjacji tkanek wyizolowano średnio 4,3 ± 0,46 x 107 komórek w każdym niezależnym eksperymencie, z żywotnością 91% ± 5,6%. P...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym komunikacie przedstawiamy metodę skutecznej izolacji wysoce oczyszczonych, niedojrzałych kultur oligodendrocytów myszy. W porównaniu z poprzednio opublikowanymi protokołami39,40, metoda ta przyniosła wyższą czystość przy znacznie niższym poziomie astrocytów GFAP-dodatnich i bardzo niskim odsetku innych niescharakteryzowanych komórek. Ważne jest, aby podkreślić, że są to niedojrzałe OL już zaangażowane w linię oligodendroglialną. W związku z tym komór...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty z National Multiple Sclerosis Society (RG4591A1/2) i National Institutes of Health (R03NS06740402). Autorzy dziękują dr Ivanowi Hernandezowi i członkom jego laboratorium za udostępnienie przestrzeni laboratoryjnej, sprzętu i porad.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pipety serologiczne 10mlFisher Scientific13-676-10J
Strzykawka 10ml końcówka Luer-LocBD, Becton Dickinson309604
15ml probówki stożkoweFalcon352097
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowychFalcon353935
40µ m sitko do komórekFisher Scientific22368547
Probówki stożkowe 50mlFalcon352098
5ml pipety serologiczneFisher Scientific13-676-10H
Płytki do hodowli tkankowych 60mmFalcon353002
70µ Sitko do komórek mFisher Scientific22363548
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) drugorzędoweInvitrogenA11001
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-królicze IgM (H+L) drugorzędoweInvitrogenA21042
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-królicze IgM (H+L) drugorzędoweInvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-kurze IgG (H + L)wtórne InvitrogenA11042
Koraliki anty-O4 - Anty-O4MicroBeadsMiltenyi Biotec130-094-543
Apo-Transferrin ludzkiSigmaT1147
Autofil kompletny zespół filtra butelkowego, filtr 0,22um, 250mlUSA Scientific6032-1101
Autofil kompletny filtr górny do butelki montaż, filtr 0,22um, 250mlUSA Scientific6032-1102
B27 SuplementInvitrogen17504-044
Kwas borowySigmaB7660
Bydlęca surowica wzrostu (BGS)GE Healthcare Nauki przyrodniczeSH30541.03
BSAFisher ScientificBP-1600-100
CNTFPeprotech450-50
d-BiotynaSigmaB4639
Dezoksyrybonukleaza I (DNAza I)WorthingtonLS002007
EDTAFisher ScientificS311
z kamerą Olympus DP70OlympusBx51
Feather jednorazowe skalpeleAndwin ScientificEF7281C
ForskolinSigmaF6886
Niemieckie szkiełka nakrywkowe, grubość #1, średnica 12mm okrągłeNeuVitroGG-12-oz
Przeciwciało GFAPAvesGFAP
Glukoza Fisher ScientificD16-1
GlutaMAXInvitrogen35050-61
InsulinaInvitrogen12585-014
Stojak separatora magnetycznego - MACS multistandMiltenyi Biotec130-042-303
Separator magnetyczny - separator MiniMACSMiltenyi Biotec130-042-302
Millex PES 0,22µ m jednostka filtrującaMilliporeSLG033RS
Media montażowe- Prolong Gold z DAPIThermo FisherP36930
N-acetylo-cysteina (NAC)SigmaA8199
Naturalna laminina mysiaInvitrogen23017-015
Neurobasal Medium AInvitrogen10888-022
Neurotrofina-3 (NT-3)Peprotech450-03
Przeciwciało NG2MilliporeAB5320
PapainWorthingtonLS003126
PBS bez Ca2+ i Mg2+SigmaD5652
PDGFPeprotech100-13A
szalki PetriegoFalcon351029
Poly-D-LizynaSigmaP6407
PrimocinInvivogenant-pm-2
ProgesteronSigmaP8783
PutrescynaSigmaP5780
Kolumna selekcyjna-Kolumny LSMiltenyi Biotec130-042-401
Selenin soduSigmaS5261
Pierwiastki śladowe BCorning25-000-CI
Trijodotyronina (T3)SigmaT6397
Triton-XSigmaT8787
Roztwór Trypan Blue Corning25-900-CI
Tween 20SigmaP1379
B27NBMA487,75 ml podłoże nerwowo-podstawne A; 10 ml suplementu B27; 1 ml Primocin; 1,25 ml Glutamax; Filtruj, sterylizuj i przechowuj w temperaturze 4 &; C do momentu użycia.
B27NBMA + 10% BGS27 ml B27NBMA; 3 ml Surowica wzrostu bydła
Roztwór roztworu CNTF (10 &mikro; g/ml; 1000X)Zamów w Peprotech (450-50). Uzupełnić w stężeniu 0,1-1 mg/ml zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcja (może się różnić w zależności od partii) w buforze (np. DPBS + 0,2% BSA). Przechowywać w temperaturze -80 °C.
Roztwór roboczy (10 &mikro; g/ml, 1000X)
1. Zrobić na 0,2% BSA (Fisher scientific BP-1600-100) w roztworze DPBS i wysterylizować filtrem.
2. Rozcieńczyć podwielokrotność głównego półproduktu do 10&mikro; g/ml w sterylnym, schłodzonym 0,2% BSA/DPBS.
3. Podwielokrotność (20&mikro; l / rurka) i zatrzaskowe zamrażanie w ciekłym azocie.
4. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
roztwór podstawowy d-biotyny (50 &mikro; g/ml; 5000X)Ponownie zawiesić d-biotynę (Sigma-B4639) w podwójnie destylowanym H2O przy 50 &mikro; g/ml (np. 2,5 mg w 50 ml ddH2O). Ponowne zawieszenie może wymagać sporej ilości wzburzenia/wirowania lub łagodnego ocieplenia w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Jeśli d-biotyna nadal nie ulega rozpuszczeniu, dobrze jest przygotować mniej stężoną (np. 10µ g/ml) i dodać większą objętość do B27NBMA (1/1000) zamiast 1/5000). Przechowywać w temperaturze 4°C.
podstawowy DNazy I1. Rozpuścić w 12 500 j. Deoksyrybonukleaza I / ml w HBSS schłodzony na lodzie.
2. Sterylizuj filtr na lodzie
3. Podwielokrotność przy 200 &mikro; l i zamrozić na noc w temperaturze -20°C.
4. Przechowuj podwielokrotności w temperaturze od -20 do -30°C.
Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (bez Ca2+ i Mg2+)Rozpuść saszetkę w 1 litrze wody, aby uzyskać 1 litr pożywki przy 9,6 grama proszku na litr pożywki. Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni Celsjusza.
Roztwór podstawowy forskoliny (4,2 mg/ml; 1000X)Dodać 1 ml sterylnego DMSO do 50 mg Forskolina w butelce (Sigma-F6886) i pipetować do momentu ponownego zawieszenia. Przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodać 11 ml sterylnego DMSO, aby uzyskać 4,2 mg/ml. Podwielokrotność (np. 20 &mikro; l) i przechowywać w temperaturze -20& stopni C.
Hank' s sole zrównoważone (HBSS) (Sigma1. Odmierz 900 ml wody (temperatura 15-20 ° C) w cylindrze i delikatnie wymieszać.
2. Dodaj moc i mieszaj aż do rozpuszczenia.
3. Wypłucz oryginalne opakowanie niewielką ilością wody, aby usunąć wszelkie ślady proszku.
4. Dodaj do roztworu w kroku 2.
5. Dodaj 0,35 g wodorowęglanu sodu (7,5% w/v) na każdy litr końcowej objętości.
6. Mieszaj, aż się rozpuści.
7. Dostosuj pH buforu, mieszając do 0,1-0,3 jednostki poniżej pH = 7,4, ponieważ może wzrosnąć podczas filtracji. Zaleca się stosowanie 1N HCl lub 1N NaOH w celu dostosowania pH
8. Dodaj więcej wody, aby uzyskać ostateczną objętość do 1 l,
9. Sterylizować przez filtrację przy użyciu membrany o porowatości 0,22 mikrona.
10. Przechowywać w temperaturze 2-8 stopni Celsjusza.
Podstawowy roztwór insuliny (4000 &mikro; g/ml)Rozmrozić butelkę i porcję 25 &mikro; l na probówkę do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze -20°C.
laminyPowoli rozmrażaj lamininę na zimno (2° C do 8° C) aby uniknąć tworzenia się żelu. Następnie podwielokrotność do rurek polipropylenowych. Przechowywać w 5° C do -20° C w podwielokrotnościach (np. 20 &mikro; l) i nie zamrażać/rozmrażać wielokrotnie. Laminina może być przechowywana w tych temperaturach do sześciu miesięcy.
magnetycznego sortowania komórek (MCS)Przygotować roztwór zawierający sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pH 7,2 i 0,5% albuminę surowicy bydlęcej (BSA), 0,5 mM EDTA, 5&mikro; g/ml insuliny, 1 g/l glukozy. Sterylizować i odgazowywać przez filtrację buforu, przepuszczając go przez 0,22 &mikro; m Filtr Millex. Przechowywać bufor w temperaturze 4° C do czasu użycia
roztworu podstawowego N-acetylo-L-cysteiny (NAC) (5 mg/ml; 1000X)Rozpuścić N-acetylo-L-cysteinę (Sigma-A8199) w stężeniu 5 mg/ml w DMEM (np. 50 mg NAC w 10 ml B27NBMA). Filtr sterylizuje i porcjuje (np. 20 &mikro; l). Przechowywać w temperaturze -20°C.
NT3 roztwór podstawowy (1 &mikro; g/ml; 1000X)Główna kolba:
Zamówienie od Peprotech (450-03). Uzupełnić w ilości 0,1 do 1 mg/ml zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje (mogą się różnić w zależności od partii), w buforze (np. DPBS + 0,2% BSA). Przechowywać w temperaturze -80°C.

Zapas roboczy (1µ g/ml; 1000X):
1. Zrobić na 0,2% BSA w roztworze DPBS i wysterylizować filtrem.
2. Rozcieńczyć podwielokrotność głównego podproduktu do 1 &mikro; g/ml w sterylnym, schłodzonym 0,2% BSA/DPBS.
3. Podwielokrotność (np. 20µ l / rurka) i zatrzaskowe zamrażanie w ciekłym azocie.
4. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80°C.
Roztwór podstawowy PDGF (10 &mikro; g/ml; 1000X)Zapas główny:
Zamów w Peprotech (100-13A). Uzupełnić w ilości 0,1 do 1 mg/ml zgodnie z zaleceniami producenta s instrukcje (mogą się różnić w zależności od partii) w buforze (np. DPBS) + 0,2% BSA). Przechowywać w temperaturze -80°C.

Zapas roboczy (1µ g/ml; 1000X):
1. Zrobić na 0,2% BSA w roztworze DPBS i wysterylizować filtrem.
2. Rozcieńczyć podwielokrotność głównego zapasu do 1&mikro; g/ml w sterylnym, schłodzonym 0,2% BSA/DPBS.
3. Podwielokrotność (np. 20µ l / rurka) i zatrzaskowe zamrażanie w ciekłym azocie.
4. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80°C.
Poli-D-lizyna (1 mg / ml; 100X)Zawiesić poli-D-lizynę o masie cząsteczkowej 70-150 kD (Sigma P6407) przy 0,5 mg / ml w 0,15 M kwasie borowym o pH 8,4 (np. 50 mg w 50 ml buforu boranowego). Sterylizacja filtra i podwielokrotność (np. 100&mikro; l/rurka). Przechowywać w temperaturze -20°C. Przed użyciem rozcieńczyć 100X (1mg/ml) do 50 &mikro; g/ml w sterylnej wodzie.
proliferacji oligodendrocytówpatrz Tabela uzupełniająca 1
Pożywkipatrz Tabela uzupełniająca 1
Suplement Sato (100X)patrz Tabela uzupełniająca 1
Bibliografia: lista odczynników i receptur została zaczerpnięta z protokołów opisanych wcześniej przez Emery'ego i in. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Oczyszczanie komórek linii oligodendrocytów z kory myszy przez immunopanning. Protokół Cold Spring Harb. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) oraz Dincman i in. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, SR Izolacja komórek prekursorowych oligodendrocytów myszy korowej. J Metody neurosce. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))
Mikroskop epifluorescencyjny Roztwór Roztwór Bufor do Pożywki do różnicujące oligodendrocyty

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emery, B. Regulation of oligodendrocyte differentiation and myelination. Science. 330 (6005), 779-782 (2010).
  2. Yang, Z., Watanabe, M., Nishiyama, A. Optimization of oligodendrocyte progenitor cell culture method for enhanced survival. J Neurosci Methods. 149 (1), 50-56 (2005).
  3. Niu, J., et al. An efficient and economical culture approach for the enrichment of purified oligodendrocyte progenitor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 241-249 (2012).
  4. Zhang, S. C. Defining glial cells during CNS development. Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).
  5. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3 (6), 191-197 (1993).
  6. Hart, I. K., Richardson, W. D., Heldin, C. H., Westermark, B., Raff, M. C. PDGF receptors on cells of the oligodendrocyte-type-2 astrocyte (O-2A) cell lineage. Development. 105 (3), 595-603 (1989).
  7. Nishiyama, A., Lin, X. H., Giese, N., Heldin, C. H., Stallcup, W. B. Interaction between NG2 proteoglycan and PDGF alpha-receptor on O2A progenitor cells is required for optimal response to PDGF. J Neurosci Res. 43 (3), 315-330 (1996).
  8. Pringle, N. P., Mudhar, H. S., Collarini, E. J., Richardson, W. D. PDGF receptors in the rat CNS: during late neurogenesis, PDGF alpha-receptor expression appears to be restricted to glial cells of the oligodendrocyte lineage. Development. 115 (2), 535-551 (1992).
  9. Grinspan, J. B., Franceschini, B. Platelet-derived growth factor is a survival factor for PSA-NCAM+ oligodendrocyte pre-progenitor cells. J Neurosci Res. 41 (4), 540-551 (1995).
  10. Sharifi, K., et al. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells. Cell Tissue Res. 354 (3), 683-695 (2013).
  11. Chittajallu, R., Aguirre, A., Gallo, V. NG2-positive cells in the mouse white and grey matter display distinct physiological properties. J Physiol. 561 (Pt 1), 109-122 (2004).
  12. Bansal, R., Warrington, A. E., Gard, A. L., Ranscht, B., Pfeiffer, S. E. Multiple and novel specificities of monoclonal antibodies O1, O4, and R-mAb used in the analysis of oligodendrocyte development. J Neurosci Res. 24 (4), 548-557 (1989).
  13. Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Dev Biol. 83 (2), 311-327 (1981).
  14. Boda, E., et al. The GPR17 receptor in NG2 expressing cells: focus on in vivo cell maturation and participation in acute trauma and chronic damage. Glia. 59 (12), 1958-1973 (2011).
  15. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Dev Neurosci. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  16. Yu, W. P., Collarini, E. J., Pringle, N. P., Richardson, W. D. Embryonic expression of myelin genes: evidence for a focal source of oligodendrocyte precursors in the ventricular zone of the neural tube. Neuron. 12 (6), 1353-1362 (1994).
  17. Armstrong, R. C., Dorn, H. H., Kufta, C. V., Friedman, E., Dubois-Dalcq, M. E. Pre-oligodendrocytes from adult human CNS. J Neurosci. 12 (4), 1538-1547 (1992).
  18. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Oligodendrocyte progenitors isolated directly from developing telencephalon at a specific phenotypic stage: myelinogenic potential in a defined environment. Development. 106 (1), 119-132 (1989).
  19. Bjelke, B., Seiger, A. Morphological distribution of MBP-like immunoreactivity in the brain during development. Int J Dev Neurosci. 7 (2), 145-164 (1989).
  20. Hardy, R. J., Friedrich, V. L. Jr Progressive remodeling of the oligodendrocyte process arbor during myelinogenesis. Dev Neurosci. 18 (4), 243-254 (1996).
  21. Hartman, B. K., Agrawal, H. C., Kalmbach, S., Shearer, W. T. A comparative study of the immunohistochemical localization of basic protein to myelin and oligodendrocytes in rat and chicken brain. J Comp Neurol. 188 (2), 273-290 (1979).
  22. Wei, Q., Miskimins, W. K., Miskimins, R. Stage-specific expression of myelin basic protein in oligodendrocytes involves Nkx2.2-mediated repression that is relieved by the Sp1 transcription factor. J Biol Chem. 280 (16), 16284-16294 (2005).
  23. Stolt, C. C., et al. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes Dev. 16 (2), 165-170 (2002).
  24. Emery, B., et al. Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination. Cell. 138 (1), 172-185 (2009).
  25. Reynolds, R., Wilkin, G. P. Development of macroglial cells in rat cerebellum. II. An in situ immunohistochemical study of oligodendroglial lineage from precursor to mature myelinating cell. Development. 102 (2), 409-425 (1988).
  26. Scolding, N. J., et al. Myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG) is a surface marker of oligodendrocyte maturation. J Neuroimmunol. 22 (3), 169-176 (1989).
  27. Fewster, M. E., Scheibel, A. B., Mead, J. F. The preparation of isolated glial cells from rat and bovine white matter. Brain Res. 6 (3), 401-408 (1967).
  28. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev Biol. 167 (2), 596-608 (1995).
  29. Gard, A. L., Pfeiffer, S. E. Glial cell mitogens bFGF and PDGF differentially regulate development of O4+GalC- oligodendrocyte progenitors. Dev Biol. 159 (2), 618-630 (1993).
  30. Barres, B. A., Raff, M. C. Proliferation of oligodendrocyte precursor cells depends on electrical activity in axons. Nature. 361 (6409), 258-260 (1993).
  31. Behar, T., McMorris, F. A., Novotny, E. A., Barker, J. L., Dubois-Dalcq, M. Growth and differentiation properties of O-2A progenitors purified from rat cerebral hemispheres. J Neurosci Res. 21 (2-4), 168-180 (1988).
  32. Vitry, S., Avellana-Adalid, V., Lachapelle, F., Baron-Van Evercooren, A. Migration and multipotentiality of PSA-NCAM+ neural precursors transplanted in the developing brain. Mol Cell Neurosci. 17 (6), 983-1000 (2001).
  33. Duncan, I. D., Paino, C., Archer, D. R., Wood, P. M. Functional capacities of transplanted cell-sorted adult oligodendrocytes. Dev Neurosci. 14 (2), 114-122 (1992).
  34. Goldman, J. E., Geier, S. S., Hirano, M. Differentiation of astrocytes and oligodendrocytes from germinal matrix cells in primary culture. J Neurosci. 6 (1), 52-60 (1986).
  35. Althaus, H. H., Montz, H., Neuhoff, V., Schwartz, P. Isolation and cultivation of mature oligodendroglial cells. Naturwissenschaften. 71 (6), 309-315 (1984).
  36. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).
  37. Szuchet, S., Yim, S. H. Characterization of a subset of oligodendrocytes separated on the basis of selective adherence properties. J Neurosci Res. 11 (2), 131-144 (1984).
  38. Chew, L. J., DeBoy, C. A., Senatorov, V. V. Jr Finding degrees of separation: experimental approaches for astroglial and oligodendroglial cell isolation and genetic targeting. J Neurosci Methods. 236, 125-147 (2014).
  39. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  40. Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J Neurosci Methods. 209 (1), 219-226 (2012).
  41. Buttery, P. C., ffrench-Constant, C. Laminin-2/integrin interactions enhance myelin membrane formation by oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci. 14 (3), 199-212 (1999).
  42. Chun, S. J., Rasband, M. N., Sidman, R. L., Habib, A. A., Vartanian, T. Integrin-linked kinase is required for laminin-2-induced oligodendrocyte cell spreading and CNS myelination. J Cell Biol. 163 (2), 397-408 (2003).
  43. Colognato, H., Ramachandrappa, S., Olsen, I. M., ffrench-Constant, C. Integrins direct Src family kinases to regulate distinct phases of oligodendrocyte development. J Cell Biol. 167 (2), 365-375 (2004).
  44. ffrench-Constant, C., Colognato, H. Integrins: versatile integrators of extracellular signals. Trends Cell Biol. 14 (12), 678-686 (2004).
  45. Oh, L. Y., Yong, V. W. Astrocytes promote process outgrowth by adult human oligodendrocytes in vitro through interaction between bFGF and astrocyte extracellular matrix. Glia. 17 (3), 237-253 (1996).
  46. Besnard, F., Perraud, F., Sensenbrenner, M., Labourdette, G. Effects of acidic and basic fibroblast growth factors on proliferation and maturation of cultured rat oligodendrocytes. Int J Dev Neurosci. 7 (4), 401-409 (1989).
  47. Armstrong, R., Friedrich, V. L., Holmes, K. V., Dubois-Dalcq, M. In vitro analysis of the oligodendrocyte lineage in mice during demyelination and remyelination. J Cell Biol. 111 (3), 1183-1195 (1990).
  48. Grinspan, J. B., Stern, J. L., Franceschini, B., Pleasure, D. Trophic effects of basic fibroblast growth factor (bFGF) on differentiated oligodendroglia: a mechanism for regeneration of the oligodendroglial lineage. J Neurosci Res. 36 (6), 672-680 (1993).
  49. Mason, J. L., Goldman, J. E. A2B5+ and O4+ Cycling progenitors in the adult forebrain white matter respond differentially to PDGF-AA, FGF-2, and IGF-1. Mol Cell Neurosci. 20 (1), 30-42 (2002).
  50. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (71), (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Oligodendrocyte IsolationImmunomagnetic SeparationO4 Positive CellsPrimary OligodendrocytesNeonatal Mouse PupsMagnetic Cell SortingCell Strainer FiltrationCentrifugation ProtocolOligodendrocyte ProliferationImmunofluorescence Staining

Related Articles