Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Identyfikacja miejsc wiązania genomu czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych komórkach PDGFRα+ za pomocą analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57547

⸱

16 kwietnia 2018

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół, który jest przeznaczony do analizy całego genomu wiązania czynnika transkrypcyjnego oligodendrocytów 2 (Olig2) w ostro oczyszczonych komórkach prekursorowych oligodendrocytów mózgu (OPC) poprzez przeprowadzanie niskokomórkowej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), przygotowanie biblioteki, sekwencjonowanie wysokoprzepustowe i analizę danych bioinformatycznych.

Streszczenie

W komórkach ssaków transkrypcja genów jest regulowana w sposób specyficzny dla typu komórki przez interakcje czynników transkrypcyjnych z genomowym DNA. Uważa się, że czynniki transkrypcyjne specyficzne dla linii odgrywają istotną rolę w specyfikacji i różnicowaniu komórek podczas rozwoju. ChIP sprzężony z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem DNA (ChIP-seq) jest szeroko stosowany do analizy miejsc wiązania w całym genomie czynników transkrypcyjnych (lub związanego z nimi kompleksu) z genomowym DNA. Jednak do jednej standardowej reakcji ChIP wymagana jest duża liczba komórek, co utrudnia badanie ograniczonej liczby izolowanych komórek pierwotnych lub rzadkich populacji komórek. W celu zrozumienia mechanizmu regulacyjnego specyficznego dla linii oligodendrocytów czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych mysich OPC, przedstawiono szczegółową metodę wykorzystującą ChIP-seq do identyfikacji miejsc wiązania Olig2 (lub kompleksu Olig2) w całym genomie. Po pierwsze, protokół wyjaśnia, w jaki sposób oczyścić OPC z dodatnim receptorem alfa czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFRα) z mózgów myszy. Następnie przeprowadza się ChIP za pośrednictwem przeciwciała Olig2 i budowę biblioteki. W ostatniej części opisano oprogramowanie i procedury bioinformatyczne wykorzystywane do analizy Olig2 ChIP-seq. Podsumowując, w artykule przedstawiono metodę analizy obejmujących cały genom wiązań czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych OPC mózgu.

Wprowadzenie

Ważne jest badanie białek (lub kompleksów białkowych) powiązań DNA oraz znaczników epigenetycznych, aby zbudować transkrypcyjne sieci regulacyjne zaangażowane w różne procesy biologiczne. W szczególności wiązania czynników transkrypcyjnych z genomowym DNA mogą odgrywać ważną rolę w regulacji genów, różnicowaniu komórek i rozwoju tkanek. Potężnym narzędziem do badania regulacji transkrypcji i mechanizmów epigenetycznych jest immunoprecypitacja chromatyny (ChIP). Ze względu na szybki postęp w technologii sekwencjonowania nowej generacji, ChIP w połączeniu z wysokoprzepustowym sekwencjonowaniem DNA (ChIP-seq) jest używany do analiz wiązań białko-DNA i znaczników epigenetycznych1. Jednak standardowy protokół ChIP-seq wymaga około 20 milionów komórek na reakcję, co utrudnia zastosowanie tej techniki, gdy liczba komórek jest ograniczona, takich jak izolowane komórki pierwotne i rzadkie populacje komórek.

Komórki linii oligodendrocytów, w tym komórki prekursorowe oligodendrocytów (OPC) i oligodendrocyty, są szeroko rozpowszechnione w całym mózgu i są niezbędne dla rozwoju i funkcjonowania mózgu. Jako rodzaj komórek prekursorowych, OPC są zdolne zarówno do samoodnawiania, jak i różnicowania. OPC służą nie tylko jako progenitory dla oligodendrocytów, ale także odgrywają ważną rolę w propagacji sygnalizacji neuronalnej, komunikując się z innymi typami komórek mózgowych2. Wcześniejsze badania sugerowały, że rozwój oligodendrocytów jest regulowany przez czynniki transkrypcyjne specyficzne dla linii, takie jak Olig2 i Sox103,4. Stwierdzono, że te czynniki transkrypcyjne wiążą się z regionami promotora lub wzmacniacza niektórych kluczowych genów, aby wpływać na ich ekspresję podczas specyfikacji i różnicowania oligodendrocytów. Trudno jest jednak zidentyfikować wiązanie DNA białka (lub kompleksu białkowego) będącego przedmiotem zainteresowania w ostro oczyszczonych pierwotnych OPC z bardzo ograniczoną liczbą komórek.

Ten protokół opisuje, jak systematycznie badać genomowe DNA immunoprecypitowane przez Olig2 w oczyszczonych mysich OPC w skali całego genomu przy użyciu techniki ChIP-seq. OPC z mózgów myszy zostały ostro oczyszczone przez immunopanning i użyte w eksperymencie ChIP bez proliferacji in vitro. Ograniczona liczba OPC może być uzyskana przez immunopanning i jest niewystarczająca dla standardowych eksperymentów sekwencyjnych ChIP. W tym artykule opisano niskokomórkowy protokół ChIP-seq z zaledwie 20 tysiącami komórek na reakcję ChIP dla czynników transkrypcyjnych. Krótko mówiąc, usieciowane komórki poddano lizie i sonikacji za pomocą urządzenia sonikacyjnego w celu ścinania chromatyny. Ściętą chromatynę inkubowano z przeciwciałem Olig2, a także kulkami pokrytymi białkiem A w celu wytrącenia genomowego DNA związanego z przeciwciałem Olig2. Po elucji z kulek pokrytych białkiem A i odwrotnym sieciowaniu, genomowe DNA wytrącone przez przeciwciało Olig2 oczyszczono przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową. Otrzymany produkt został określony ilościowo i poddany T-tailingowi, przełączaniu i rozszerzaniu szablonów do wyżarzania podkładowego, dodaniu adapterów i wzmocnieniu, doborze rozmiaru biblioteki i etapach oczyszczania w celu budowy biblioteki ChIP-seq.

Po sekwencjonowaniu, jakość surowych odczytów zarówno z próbki przygotowanej z przeciwciałem czynnika transkrypcyjnego Olig2, jak i próbki kontrolnej została przeanalizowana. Przycięte zostały niskiej jakości pary baz oraz adapter zawierający odczytane fragmenty. Następnie przycięte odczyty zostały wyrównane do genomu referencyjnego myszy. Regiony genomu, które zostały znacznie wzbogacone do odczytów ChIP, w porównaniu z próbką kontrolną, zostały wykryte jako piki. Znaczące piki, reprezentujące potencjalne miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych, przefiltrowano i zwizualizowano w przeglądarce genomu.

Zauważalnie, metoda opisana w tym protokole może być szeroko stosowana do sekwencji ChIP-seq innych czynników transkrypcyjnych z dowolnym typem komórki o ograniczonej liczbie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły użytkowania zwierząt i eksperymentów zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego i Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt w Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w Houston.

1. Oczyszczanie komórek linii oligodendrocytów PDGFRα z mózgu myszy (zmodyfikowane w stosunku do wcześniej opisanych protokołów immunopanningu5,6,7)

  1. Przygotowanie płytki immunologicznej do PDGFRα dodatniej selekcji komórek i 2 płytek do zubożenia komórek śródbłonka i mikrogleju.
    UWAGA: Należy pamiętać, że szalki Petriego, ale nie szalki z kulturami komórkowymi, sprawdzają się w eksperymencie immunopanningowym; Jeżeli oczyszczone komórki będą używane do hodowli, etapy immunopanowania muszą być przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego
    1. Pokryć 10-centymetrową płytkę Petriego 30 μl koziej anty-szczurzej IgG w 10 ml pH 9,5, 50 mM Tris-HCl przez noc w temperaturze 4 °C. Wstrząsnąć płytką, aby upewnić się, że powierzchnie płytek są równomiernie i całkowicie pokryte roztworem powlekającym.
    2. Przygotować roztwór przeciwciała PDGFRα, rozcieńczając 40 μl szczurzego przeciwciała anty-PDGFRα z 12 ml buforowanego fosforanem soli fizjologicznej (DPBS) firmy Dulbecco zawierającego 0,2% BSA.
    3. Po 3 przemyciach płytki pokrytej IgG z 10 ml 1x DPBS każde, inkubować płytkę pokrytą IgG z roztworem przeciwciała PDGFRα w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
    4. Umyć płytkę pokrytą przeciwciałem anty-PDGFRα szczura 3 razy po 10 ml 1x DPBS każda. Delikatnie dodaj roztwór DPBS wzdłuż bocznej ścianki płytki i nie naruszaj powlekanych powierzchni.
    5. Pokryj 2 nowe 15-centymetrowe płytki Petriego do zubożenia komórek śródbłonka i mikrogleju 20 ml DPBS zawierającego 2,3 μg/ml lektyny Banderiaea simplicifolia 1 (BSL-1) przez 2 godziny.
    6. Umyj płytki powlekane BSL-1 3 razy 20 ml 1x DPBS. Delikatnie dodaj roztwór DPBS wzdłuż bocznej ścianki płytek i nie naruszaj powlekanych powierzchni.
  2. Oczyszczanie komórek linii oligodendrocytów PDGFRα dodatnich jest modyfikowane na podstawie wcześniej opublikowanych metod6,7,8.
    1. Przeanalizuj tkanki korowe z 2 mózgów myszy w 7. dniu po urodzeniu (P7) zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami5,6.
    2. Dysocjuj tkanki, aby wytworzyć zawiesinę jednokomórkową za pomocą zestawu do dysocjacji tkanek nerwowych (P) zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami producenta.
    3. Krótko mówiąc, pociąć wypreparowane tkanki korowe na kawałki za pomocą skalpela i poddać je trawieniu enzymatycznemu w temperaturze 37 °C. Po roztrawieniu ręcznie oddzielić kawałki za pomocą pipet Pasteura z polerowanego ogniowo szkła do zawiesiny jednokomórkowej.
    4. Odwirować zawiesinę jednokomórkową o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zawiesić osad komórkowy za pomocą 15 ml buforu do badania immunologicznego (bufor do płukania immunologicznego to DPBS z 0,02% BSA i 5 μg/ml insuliny).
    5. Zawiesinę jednokomórkową z 2 mózgów myszy inkubować sekwencyjnie na 2 płytkach pokrytych BSL-1 przez 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem płytki co 5 minut, aby zapewnić lepsze zubożenie komórek mikrogleju i śródbłonka.
    6. Delikatnie zamieszać płytkę, aby zebrać nieprzylegające komórki w zawiesinie komórkowej i inkubować je na płytce pokrytej przeciwciałem szczura-PDGFRα przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Po inkubacji zawiesiny komórkowej na płytce pokrytej przeciwciałem szczura-PDGFRα, delikatnie zakręć płytką, aby zebrać zawiesinę komórkową, i przepłucz płytkę 8 razy DPBS, aby pozbyć się komórek nieprzylegających. Delikatnie dodaj roztwór myjący wzdłuż bocznej ścianki płytki i kilkakrotnie porusz płytkę, aby pozbyć się nieprzylegających komórek.
    8. Odłączyć komórki od płytki pokrytej przeciwciałem szczura-PDGFRα za pomocą 4 ml roztworu do oddzielania komórek przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Wstrząsnąć płytką w celu usunięcia przylegających komórek.
    9. Zebrać oczyszczone OPC przez odwirowanie przy 300 x g w temperaturze pokojowej, zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml pożywki do hodowli komórek OPC i policzyć komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru (500 ml pożywki do hodowli komórkowych to pożywka DMEM/F12 zawierająca 5 ml roztworu penicyliny i streptomycyny (P/S), 5 ml N2, 10 ml B27, 5 μg/ml insuliny, 0,1% BSA, 20 ng/ml bFGF i 10 ng/ml PDGFRα).
  3. Walidacja czystości OPC po immunopanningu.
    1. W celu oceny wzbogacenia OPC po immunopanningu, należy użyć niektórych z oczyszczonych OPC do ekstrakcji RNA za pomocą ekstrakcji na bazie tiocyjanianu guanidu zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Wykonaj qRT-PCR przy użyciu fluorescencyjnej mieszanki głównej z zielonym barwnikiem, aby sprawdzić wzbogacenie ekspresji PDGFRα w oczyszczonych OPC w porównaniu ze zdysocjowanymi komórkami mózgowymi zgodnie z wcześniej opublikowanymi materiałami4.
    3. Dodatkowo umieść niektóre oczyszczone OPC w 24-dołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną w celu barwienia immunologicznego przeciwciałem anty-NG2 proteoglikanem siarczanu chondroityny (NG2), jak wcześniej opublikowane materiały9.

2. Przygotowanie niskokomórkowego ChIP i budowa biblioteki ChIP dla sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

  1. Olig2 Niskokomórkowy preparat ChIP z dostępnym na rynku systemem sonikacji i dostępnym na rynku zestawem ChIP o niskiej liczbie komórek (patrz Tabela materiałów), postępując zgodnie ze szczegółowymi standardowymi procedurami z instrukcji producenta.
    1. Po odłączeniu od szczura płytki pokrytej przeciwciałem anty-PDGFRα i zliczeniu komórek za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru umieścić 20 000 oczyszczonych OPC w 1 ml pożywki do hodowli komórek OPC dla każdej reakcji ChIP.
    2. Dodaj 27 μl 36,5% formaldehydu, aby utrwalić zawiesinę komórek przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      Uwaga: Należy pamiętać, że ze względów bezpieczeństwa w okapie chemicznym należy stosować formaldehyd.
    3. Zatrzymaj sieciowanie DNA-białko za pomocą 50 μl 2,5 M glicyny na 5 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Od tego momentu wszystkie czynności należy wykonywać na lodzie lub w chłodni o temperaturze 4 °C.
    4. Umyj usieciowane granulki komórkowe 1 ml lodowatego roztworu soli Hanksa (HBSS) z koktajlem inhibitorów proteazy i poddaj komórki granulowaniu za pomocą wstępnie schłodzonej wirówki o temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C.
    5. Lizuj osad komórkowy w 25 μl kompletnego buforu do lizy przez 5 minut na lodzie.
      UWAGA: Zamieszaj probówkę, aby zawiesić komórki w buforze do lizy.
    6. Uzupełnij lizat komórkowy 75 μl lodowatego HBSS zawierającego koktajl inhibitorów proteazy i ścinaj chromatynę lizatu komórkowego za pomocą wstępnie schłodzonego systemu sonikacji z 5 cyklami 30 s ON i 30 s OFF program. Zawsze poddawaj sonifikacji 6 probówek razem i upewnij się, że probówki równoważące zawierają 100 μl wody.
    7. Po ścinaniu odwirować przy 14 000 x g przez 10 minut 4 °C i po odwirowaniu zebrać supernatant do nowej probówki.
    8. Rozcieńczyć 100 μl ściętej chromatyny równą objętością lodowatego kompletnego buforu ChIP z inhibitorem proteazy.
    9. Zaoszczędź 20 μl rozcieńczonej chromatyny ściętej jako wejściową próbkę kontrolną.
      UWAGA: Wprowadzona próbka kontrolna jest również wymagana jako porównanie z próbką immunoprecypitowaną Olig2 w celu identyfikacji DNA immunoprecypitowanego przeciwciała Olig2.
    10. Dodać 1 μl króliczego przeciwciała anty-olig2 do 180 μl rozcieńczonej ściętej chromatyny i inkubować probówkę reakcyjną na obracającym się kole z prędkością 40 obr./min przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wykonaj ten krok w zimnym pomieszczeniu.
    11. Dla każdej reakcji ChIP przemyj 11 μl kulek pokrytych białkiem magnetycznym A za pomocą 55 μl buforu do płukania kulek i umieść granulki w 11 μl buforu do płukania kulek po 2 praniach.
      UWAGA: Wykonaj ten krok w zimnym pomieszczeniu.
    12. Do każdej reakcji ChIP dodać 10 μl wstępnie umytych kulek pokrytych białkiem A do probówki reakcyjnej ChIP. Wykonaj ten krok w zimnym pomieszczeniu.
    13. Inkubować probówkę reakcyjną ChIP w temperaturze 4 °C przez kolejne 2 godziny na obracającym się kole.
    14. Umieść probówkę reakcyjną ChIP na stojaku magnetycznym na 1 min.
      UWAGA: Wykonaj ten krok w zimnym pomieszczeniu.
    15. Usuń supernatant i nie usuwaj granulki kulki.
    16. Przemyć granulkę kulki odpowiednio 100 μl dla każdego z 4 płuczących przez 4 minuty na obracającym się kole w temperaturze 4 °C.
    17. Po przepłukaniu dodać 200 μl buforu elucyjnego do osadu kulkowego i inkubować probówkę reakcyjną ChIP w temperaturze 65 °C przez 4 godziny w celu odwrócenia usieciowania białko-DNA.
    18. Dodatkowo dodać 180 μl buforu elucyjnego do 20 μl wejściowej próbki kontrolnej i inkubować w temperaturze 65 °C przez 4 godziny, aby również odwrócić wiązanie krzyżowe białka-DNA.
    19. Dodać 200 μl mieszaniny fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego 25:24:1 (v/v) do każdej probówki reakcyjnej ChIP.
    20. Wirować energicznie przez 1 minutę i wirować przy 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną fazę do nowej probówki.
    21. Dodać 40 μl 3 M roztworu octanu sodu, 1 000 μl 100% etanolu i 2 μl strącacza glikogenu kowalencyjnie połączonego z niebieskim barwnikiem do każdej probówki reakcyjnej ChIP przez noc w temperaturze -20 °C.
    22. Wirować przy 13 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    23. Odrzucić sklarowany osad, przemyć 500 μl zimnego 70% etanolu i odwirować przy 13 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    24. Wyrzucić supernatant, utrzymywać osad w suchym powietrzu przez 10 minut i rozpuścić osad w 50 μl wody.
  2. Budowa biblioteki ChIP do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości
    1. Oczyść i zagęść DNA ChIP za pomocą zestawu do czyszczenia zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Oznaczyć ilościowo próbkę ChIP za pomocą piko-zielonego koloru, zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Użyj zestawu ChIP-seq do T-tailingu, replikacji i tailingu, przełączania i rozszerzania szablonów, dodawania adapterów i wzmocnienia, wyboru rozmiaru biblioteki i oczyszczania zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Po denaturacji dsDNA, defosforylować koniec 3' ssDNA za pomocą fosfatazy alkalicznej krewetek i dodać ogon poli (T) do ssDNA za pomocą końcowej transferazy deoksynukleotydylu.
      2. Wyżarzać starter DNA Poly (dA) do matrycy ssDNA w celu replikacji DNA i przełączania matrycy.
      3. Po przełączeniu szablonu wzmocnij bibliotekę ChIP-seq metodą PCR ze starterami do przodu i do tyłu do indeksowania.
      4. Wybierz bibliotekę ChIP-seq amplifikowaną do PCR z fragmentami w zakresie od 250 do 500 pz za pomocą kulek paramagnetycznych za pomocą opcji 2 dla wyboru podwójnego rozmiaru.
      5. Zbadaj jakość wybranej biblioteki ChIP-seq za pomocą mikroprzepływowego urządzenia do elektroforezy chipowo-kapilarnej.

3. Analiza danych

  1. Przygotuj strukturę katalogów.
    1. Utwórz katalog do przeprowadzania analizy danych ChIP-seq. W nowo utworzonym katalogu utwórz sześć podkatalogów o następujących nazwach: raw.files, fastqc.output, bowtie.output, homer.output, macs2.output, motif.analysis i reports.
  2. Przygotuj dane i przeprowadź analizę kontroli jakości surowych danych sekwencji.
    1. Przejdź do katalogu "raw.files" i pobierz pliki danych ChIP-seq.
    2. Sprawdź nazwy plików. Jeśli sekwencjonowanie zostało sparowane, będą 4 pliki (dwa dla leczenia i dwa dla wejścia) o podobnych nazwach podstawowych: PDGFRα_Olig2.read1.fastq, PDGFRα_Olig2.read2.fastq, PDGFRα_input.read1.fastq i PDGFRα_input.read2.fastq. Jeśli nazwy plików są różne, zmień ich nazwy za pomocą polecenia "mv".
    3. Przejdź do katalogu "fastqc.output".
    4. Uzyskaj metryki kontroli jakości z surowych odczytów za pomocą oprogramowania do kontroli jakości plików fastq10. Użyj polecenia na rysunku S1A, aby uruchomić proces kontroli jakości oddzielnie dla każdego pliku fastq. Oprogramowanie wyświetli kilka wskaźników kontroli jakości w pliku html.
    5. Otwórz plik kontroli jakości html i sprawdź liczbę odczytów, długość odczytu, jakość sekwencji podstawowej, wyniki jakości sekwencji, zawartość GC sekwencji, poziomy duplikacji sekwencji, zawartość adaptera i zawartość kmer.
  3. Przycinanie końcowych odczytów o niskiej jakości i zawartości adaptera.
    1. Zwróć uwagę na wykresy "Jakość sekwencji podstawowej" i "Zawartość adaptera". Określ długość przycinania zarówno dla głowy, jak i końca każdego odczytu. Odpowiednia długość do przycinania to taka, w której jakość podstawowa spada poniżej 30 i istnieją dowody na zawartość adaptera.
    2. Przejdź do katalogu "raw.files".
    3. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do przycinania reads11. Użyj polecenia na rysunku S1B, aby oddzielnie przyciąć zarówno obróbkę, jak i dane wejściowe. Parametr "CROP" wskazuje pozostałą długość odczytu po przycięciu baz od końca, a parametr "HEADCROP" określa liczbę baz, które mają zostać wyeliminowane od początku odczytu.
    4. Polecenie przycinania zawiera również minimalną długość odczytu, która ma zostać zaakceptowana po przefiltrowaniu w parametrze "MINLEN". Jeśli wartość odczytu wynosi co najmniej 50 punktów bazowych, jako próg długości odczytu należy użyć wartości 35 punktów bazowych.
    5. Przejdź do katalogu "fastqc.output".
    6. Wykonaj analizę kontroli jakości pliku fastq po przycięciu odczytów. Sprawdź, czy problemy z kontrolą jakości zostały rozwiązane. Użyj polecenia na rysunku S1C, aby uzyskać metryki kontroli jakości.
  4. Dopasuj odczyty ChIP-seq z pojedynczym końcem lub sparowanym końcem do genomu referencyjnego myszy.
    1. Przejdź do katalogu "bowtie.output" w celu mapowania.
    2. Pobierz genom referencyjny myszy GENCODE mm10. Zmień nazwę genomu referencyjnego myszy mm10 na "mm10.fa".
    3. Pobierz read mapper12 i zainstaluj go w systemie.
    4. Utwórz plik indeksu pobranego genomu referencyjnego za pomocą polecenia na rysunku S2A. Automatycznie tworzonych jest sześć plików: mm10.1.bt2, mm10.2.bt2, mm10.3.bt2, mm10.4.bt2, mm10.rev.1.bt2 i mm10.rev.2.bt2.
    5. Użyj polecenia na rysunku S2B, aby wykonać wyrównanie i dostosować parametr "-p" do liczby rdzeni przetwarzających zgodnie z ustawieniami systemu. W przypadku pracy w trybie sparowanego końca, parametry "-1" i "-2" wskazują nazwy przyciętych plików fastq.
      UWAGA: Mapowanie jest wykonywane oddzielnie dla próbek uzdatniania i wejściowych, a pliki dziennika metryk wyjściowych są tworzone dla każdej próbki.
    6. Pobierz oprogramowanie do manipulowania plikami w formacie SAM13 i zainstaluj je w systemie. Przekonwertuj wyrównany plik SAM na plik BAM za pomocą polecenia na rysunku S2C.
  5. Uzyskaj metryki kontroli jakości zmapowanych odczytów przed szczytem, wywołując zarówno leczenie sparowanym końcem, jak i próbki kontrolne.
    1. Jednym z najważniejszych wskaźników kontroli jakości, którymi należy się zająć, jest głębokość sekwencjonowania. Otwórz pliki "log.bowtie.PDGFRα_Olig2.txt" i "log.bowtie.PDGFRα_input.txt" w katalogu bowtie.output i sprawdź, czy liczba unikalnie zmapowanych par odczytu w każdej próbce jest większa niż 10 milionów.
    2. Przejdź do katalogu "homer.output".
    3. Pobierz oprogramowanie do wykrywania motywów i analizy sekwencjonowania nowej generacji14 i zainstaluj je w systemie.
    4. Utwórz katalog o nazwie "tagDir".
    5. Aby zweryfikować klonalność tagu, użyj polecenia przedstawionego na rysunku S3A. Polecenie "makeTagDirectory" wygeneruje cztery dane wyjściowe kontroli jakości: files:tagAutocorrelation.txt, tagCountDistribution.txt, tagInfo.txt i tagLengthDistribution.txt.
    6. Przejdź do katalogu "tagDir".
    7. Skopiuj plik "tagCountDistribution.txt" do katalogu "reports".
    8. Przejdź do katalogu "raporty".
    9. Otwórz plik tagCountDistribution.txt za pomocą arkusza kalkulacyjnego i utwórz wykres słupkowy liczby znaczników na pozycję genomową. Zapisz plik histogramu o nazwie "tag.clonality.xlsx".
    10. Zainstaluj język programowania R15 w systemie.
    11. W terminalu wpisz "R" i naciśnij ENTER, aby uzyskać dostęp do środowiska programowania R.
    12. Pobierz pakiet R do przetwarzania danych ChIP-seq 16 i zainstaluj go za pomocą polecenia przedstawionego na rysunku S3B.
    13. Użyj skryptu R na rysunku S3C, aby wykreślić korelację krzyżową nici.
  6. Wykrywanie szczytów za pomocą mapowania pików.
    1. Przejdź do katalogu "macs2.output". Pobierz i zainstaluj mapowanie szczytów 17 w swoim systemie.
    2. Użyj funkcji "callpeak" z plikami BAM leczenia i kontroli wygenerowanymi w kroku 3.4.6.
      UWAGA: Inne parametry to "-f" dla formatu pliku wejściowego, "-g" dla rozmiaru genomu, "-name" dla wskazania podstawowej nazwy wszystkich plików wyjściowych i "-B" dla przechowywania stosu fragmentów w formacie bedgraph. Pełne polecenie wywołania szczytu znajduje się na rysunku S4A. Użyj BEDPE do próbek z parowanymi końcami.
    3. Sprawdź, czy mapowanie pików wygenerowało sześć plików: PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFR α_input_peaks.narrowPeak, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFR α_input_summits.bed, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFR α_input_model.r, PDGFRα_Olig2_vs_PDGFR α_input_control_lambda.bdg i PDGFRα_Olig2_vs_PDGFR α_input_treat_pileup.bdg.
    4. Otwórz PDGFRα_Olig2_vs_PDGFRα_input_peaks.xls pliku, aby wyświetlić wywołane szczyty, lokalizację, długość, pozycję szczytu, pileup i metryki wzbogacania szczytu: -log10 (pvalue), fold enrichment i -log10 (q-value).
  7. Filtrowanie i dodawanie adnotacji nazywanych szczytami.
    1. Korzystając z pliku otwartego w poprzednim kroku, przefiltruj wynikowe piki zgodnie ze wzbogaceniem krotności, wartością p i/lub wartością q. Aby określić odpowiednie progi filtrowania, utwórz wykres histogramu w celu określenia gęstości każdej metryki. Odfiltruj wartości poniżej wybranego progu, aby uzyskać znaczące wartości szczytowe.
    2. Pobierz czarną listę mm10 (regiony są znane z tego, że mają sztucznie wysoki sygnał) i odfiltruj piki ChIP-seq, które znajdują się wewnątrz któregokolwiek z tych regionów artefaktów.
    3. Utwórz plik łóżka z przefiltrowanymi pikami zawierającymi następujące kolumny: chromosom, początek, koniec, peakID, makieta i pasmo. Wypełnij fałszywą kolumnę kropką ".", ponieważ nie jest używana. W kolumnie pasmo ustaw wszystkie wartości na "+". Zapisz plik bed jako "filtered.peakData2.bed".
    4. Skopiuj plik "filtered.peakData2.bed" z katalogu "reports".
    5. Przejdź do katalogu "raporty".
    6. Aby dodać adnotacje do przefiltrowanych pików do określonego regionu genu, użyj funkcji "annotatePeaks" z plikiem łóżka utworzonym w poprzednim kroku. Użyte polecenie pokazano na rysunku S5A.
    7. Otwórz plik "filtered.annotatedPeaks.txt" za pomocą oprogramowania statystycznego.
    8. Przefiltruj wynikowe piki leżące w obszarze międzygenowym w odległości większej niż 5 kb od opisanego TSS. Użyj kolumny "Odległość do TSS" w pliku jako odległości do filtrowania. Przechowuj przefiltrowane piki w pliku Excela o nazwie "5kbup.geneBody.peakData.txt".
    9. Przechowuj wynikowe przefiltrowane piki w pliku bedGraph z kolumnami: chromosom, początek, koniec i -log10 (wartość q). Nazwij plik "5kbup.geneBody.peakData.bedGraph".
  8. Generuj duże pliki do wizualizacji przeglądarki.
    1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do arytmetyki genomu18.
    2. Pobierz narzędzie do konwersji bedgraph na bigwig i zainstaluj w systemie. Pobierz plik "mm10.chrom.sizes".
    3. Użyj polecenia na rysunku S6A, aby wygenerować plik bigwig.
    4. Pobierz i zainstaluj przeglądarkę genomu 19 w systemie.
    5. Otwórz przeglądarkę genomu i załaduj plik "5kbup.geneBody.peakData.bigwig", aby zobrazować przefiltrowane znaczące piki i ich lokalizację w odniesieniu do znanych genów.
  9. Wyszukiwanie motywów.
    1. Przejdź do katalogu "motif.analysis".
    2. Pobierz program do skanowania i wzbogacania motywów de novo i zainstaluj go w swoim systemie20.
    3. Pobierz obszerną bazę motywów, która zawiera motywy Olig2.
    4. Uzyskaj sekwencje genomowe regionów o długości 500 pz wyśrodkowanych na znaczących szczytach szczytowych. Przechowuj sekwencje w peak.sequences.txt. Użyj polecenia na rysunku S7, aby wyszukać motywy Olig2 w każdym z obszarów piku 500 pz.
    5. Przefiltruj powstałe motywy, używając odpowiedniej wartości E (domyślnie = 0,05).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzono ChIP-seq dla małej liczby komórek oraz analizy bioinformatyczne w celu zbadania potencjalnych oddziaływań czynnika transkrypcyjnego Olig2 z genomicznym DNA w świeżo oczyszczonych OPC mózgu. Rycina 1 przedstawia ogólny schemat zarówno procedur eksperymentalnych, jak i analizy danych. W niniejszym protokole mózgi myszy postnatalnych poddano dysocjacji do zawiesiny jednokomórkowej. Po dysocjacji tkanki przeprowadzono immunopanning w celu oczyszcze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sieci regulacji genów ssaków są bardzo złożone. ChIP-seq to potężna metoda badania interakcji białko-DNA w całym genomie. Protokół ten obejmuje sposób wykonywania sekwencji Olig2 ChIP przy użyciu niewielkiej liczby oczyszczonych OPC z mózgów myszy (zaledwie 20 tysięcy komórek na reakcję). Pierwszym kluczowym krokiem dla tego protokołu jest oczyszczenie OPC z mózgów myszy poprzez immunopanowanie za pomocą przeciwciała PDGFRα. W przypadku pozytywnej selekcji OPC z płytkami pokrytymi PDGFRα, OPC często słabo wiążą się z pły...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

JQW, XD, RCDD, i YY były wspierane przez granty z National Institutes of Health R01 NS088353; Grant NIH 1R21AR071583-01; Staman Ogilvie Fund-Memorial Hermann Foundation; Inicjatywa UTHealth BRAIN i CTSA UL1 TR000371; oraz grant z University of Texas System Neuroscience and Neurotechnology Research Institute (Grant #362469).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik/ Sprzęt
Banderiaea simplicifolia lektyna 1Vector Laboratories# L-1100
Szczurze przeciwciało anty-PDGFRaBD Bioscience# 558774
Zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej (P)MACS Miltenyi Biotec# 130-092-628
TechnologieAccutase STEMCELL# 07920
TRIzolThermo Fisher# 15596026
Przeciwciało anty-NG2 Siarczan chondroityny ProteoglikanMillipore# AB5320
Urządzenie do sonikacji Bioruptor PicoDiagenoda# B01060001
Zestaw True MicroChIPDiagenode# C01010130
Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1, v / v)Thermo Fisher# 15593031
Zestaw do czyszczenia żelu NucleoSpin i PCRMACHEREY-NAGEL# 740609
Zestaw do oznaczania Quant-iT PicoGreen dsDNAThermo Fisher# P11496
Zestaw DNA SMART ChIP-SeqClontech Laboratories# 634865
Agencourt AMPure XPBeckman Voulter# A63880
GlycoBlueThermo Fisher# AM9516
pico-greenThermo Fisher# P11496
D-PBSThermo Fisher# 14190-144
SYBR Green master mixBio-Rad Laboratories# 1725124
DMEM/F12Fisher Scientific# 11-320-033
Penicylina-Streptomycyna (P/S)Fisher Scientific# 15140122
N-2 SuplementFisher Scientific# 17502048
B-27 SuplementFisher Scientific# 17504044
insulinaSigma# I6634Przygotować roztwór insuliny o stężeniu 0,5 mg/ml, rozpuszczając 5 mg insuliny w 10 ml wody i 50 μm; l z 1 N HCl.
Albumina surowicy bydlęcej, odpowiednia do hodowli komórkowych (BSA)Sigma# A4161Przygotować 4% roztwór BSA, rozpuszczając 4 g BSA w 100 ml D-PBS i dostosować pH do 7,4
Białko podstawowe czynnika wzrostu fibroblastów, rekombinowane przez człowieka (bFGF)EMD Millipore# GF003
HUMAN PDGF-AAVWR# 102061-188
poli-D-lizynaVWR# IC15017510Przygotować 1 mg/ml roztwór poli-D-lizyny, rozpuszczając 10 mg poli-D-lizyny w 10 ml wody i rozcieńczać 100 razy podczas używania.
Jednorazowe szalki Petriego Falcon, sterylne, Corning, 100x15mmVWR# 25373-100
Jednorazowe szalki Petriego Falcon, sterylne, Corning, 150x15mmVWR#25373-187
HBSS, 10X, bez wapnia, bez magnezu, bez fenolu RedFisher Scientific# 14185-052
Trypan BlueStemcell Technologies# 07050
inhibitorów proteazySigma# 11697498001
Software
FastQC[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Uzyskiwanie wskaźników kontroli jakości odczytów surowych i przyciętych
Trimmomatic 0.33[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomaticPrzycinanie i filtrowanie surowych odczytów
GENCODE mm10ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gzGenom referencyjny myszy
Bowtie2 2.2.4[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtmlWyrównanie odczytuje do genomu referencyjnego
SAMTools 1.5[13] http://samtools.sourceforge.net/Konwersja pliku SAM do formatu BAM
HOMER 4.9.1[14] http://homer.ucsd.edu/homer/Tworzenie katalogu znaczników i opisywanie wzbogaconych regionów genomowych symbolami genów
R 3.2.2[15] https://www.R-project.org/Programowanie skryptów i uruchamianie funkcji
SPP 1.13[16] https://github.com/hms-dbmi/sppTworzenie wykresu korelacji krzyżowej nici
MACS2 2.2.4[17] https://github.com/taoliu/MACSZnajdowanie regionów wzbogacenia ChIP nad kontrolą
BEDTools 2.25[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/Arytmetyka genomu
bedGraphToBigWighttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/Konwertowanie pliku bedGraph na przeglądarkę
bigwig IGV 2.3.58[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/Wizualizacja i przeglądanie znaczące piki ChIP-seq
Microsoft ExcelSpreasheet
KODUJ czarną listę https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklistsFiltrowanie pików
mm10.chrom.sizeshttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.Konwersja pliku bedGraph do
bazy danych motywów bigwig ENCODE[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/Kompleksowa baza danych motywów wymagana do wzbogacania motywów
MEME-ChIP[20] http://meme-suite.org/index.htmlAnaliza wzbogacania motywów i odkrywanie motywów
Nazwy starterów używane do qPCRSekwencje starterów używane do qPCR
Mbp-F:CTATAAATCGGCTCACACAAGG
Mbp-R:AGGCGTTATATTAAGAAGC
Iba1-F:ACTGCCAGTAAGACAACC
Iba1-R:GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC
Mog-F:GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC
Mog-R:TGAATTGTCCTGCATAGCTGC
GAPDH-FATGACATCAAGAAGGTGGTG
GAPDH-RCATACCAGGAATGAGCTTG
Tuj1-FTTTTCGTCTCTAGCCGCGTG
Tuj1-RGATGACCTCCCAGAACTTGGC
PDGFRα-FAGAGTTACACGTTTGAGCTGTC
PDGFRα-RGTCCCTCCACGGTACTCCT
koktajl program

Bibliografia

  1. Wu, J. Q., et al. Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line. PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).
  2. Zuchero, J. B., Barres, B. A. Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development. Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).
  3. Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).
  4. Dong, X., et al. Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination. PLoS Genet. 11 (12), e1005669(2015).
  5. Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures. J Vis Exp. (10), e562(2007).
  6. Emery, B., Dugas, J. C. Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).
  7. Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
  8. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  9. Cheng, X., et al. Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells. Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).
  10. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  11. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  12. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  13. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  15. Team, R. C. A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2015).
  16. Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).
  17. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  18. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Bailey, T. L., et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching. Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).
  21. Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses. Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).
  22. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  23. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  24. Mazzoni, E. O., et al. Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs. Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).
  25. Kheradpour, P., Kellis, M. Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments. Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).
  26. Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation. J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).
  27. Gilfillan, G. D., et al. Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq. BMC Genomics. 13, 645(2012).
  28. Raskatov, J. A., et al. Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).
  29. Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2017).
  30. Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).
  31. Kulakovskiy, I. V., et al. HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).
  32. Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).
  33. Gerstein, M. B., et al. Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data. Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

ChIP seq dla Olig2kom rki dodatnie dla PDGFR alfakom rki prekursorowe oligodendrocyt wprocedura immunopanningufragmentacja chromatynyanaliza bioinformatycznamiejsca wi zania w ca ej skali genomuanaliza czynnik w transkrypcyjnychoczyszczanie pierwotnych kom rek
Identyfikacja miejsc wiązania genomu czynnika transkrypcyjnego Olig2 w ostro oczyszczonych komórkach PDGFRα+ za pomocą analizy sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny niskokomórkowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.