Artykuł metodologiczny

Rodzinny model myszy chimerycznej wątroby hipercholesterolemii przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych

DOI:

10.3791/57556

⸱

15 września 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Hong Kong-Shenzhen Hospital, 2The Cardiology Division, Department of Medicine, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, 3School of Biomedical Sciences, Institute of Vascular Medicine, Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Chinese University of Hong Kong, 4Key Laboratory of Regenerative Biology of the Chinese Academy of Sciences, Joint School of Life Sciences, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health and Guangzhou Medical University, 5Laboratory of RNA, Chromatin, and Human Disease, CAS Key Laboratory of Regenerative Biology and Guangdong Provincial Key Laboratory of Stem Cells and Regenerative Medicine, Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health, Chinese Academy of Sciences, 6Research Centre of Heart, Brain, Hormone, and Healthy Ageing, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, 7Hong Kong-Guangdong Stem Cell and Regenerative Medicine Research Centre, University of Hong Kong and Guangzhou Institutes of Biomedicine and Health

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół generowania ludzkiego chimerycznego mysiego modelu hipercholesterolemii rodzinnej wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hepatocytów. Jest to cenny model do testowania nowych terapii hipercholesterolemii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hipercholesterolemia rodzinna (FH) jest głównie spowodowana mutacjami receptora lipoprotein o niskiej gęstości (LDLR) i powoduje zwiększone ryzyko chorób sercowo-naczyniowych o wczesnym początku z powodu znacznego wzrostu poziomu cholesterolu LDL (LDL-C) we krwi. Statyny są pierwszą linią leków obniżających stężenie lipidów w leczeniu FH i innych rodzajów hipercholesterolemii, ale pojawiają się nowe podejścia, w szczególności przeciwciała PCSK9, które są obecnie testowane w badaniach klinicznych. Aby zbadać nowe podejścia terapeutyczne do FH, zarówno nowe leki, jak i nowe preparaty, potrzebujemy odpowiednich modeli in vivo. Jednak różnice w profilach metabolicznych lipidów w porównaniu z ludźmi są kluczowym problemem dostępnych modeli zwierzęcych FH. Aby rozwiązać ten problem, stworzyliśmy ludzki chimeryczny mysi model wątroby przy użyciu indukowanych przez FH pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) (iHeps). Użyliśmy myszy Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG), aby uniknąć odrzucenia immunologicznego przeszczepionych komórek ludzkich i ocenić wpływ iHeps z niedoborem LDLR na tle zerowym LDLR. Przeszczepiony FH iHeps może ponownie zasiedlić 5-10% wątroby myszy LRG w oparciu o barwienie albuminą ludzką. Co więcej, wszczepione iHeps zareagowały na leki obniżające poziom lipidów i podsumowały obserwacje kliniczne zwiększonej skuteczności przeciwciał PCSK9 w porównaniu ze statynami. Nasz chimeryczny model ludzkiej wątroby może być zatem przydatny w testach przedklinicznych nowych terapii FH. Korzystając z tego samego protokołu, można również wygenerować podobne ludzkie chimeryczne myszy wątroby dla innych wariantów genetycznych FH lub mutacji odpowiadających innym dziedzicznym chorobom wątroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptor lipoprotein o niskiej gęstości (LDLR) wychwytuje cholesterol LDL (LDL-C) we krwi, aby modulować syntezę cholesterolu w wątrobie. Mutacje w genie LDLR są najczęstszą przyczyną hipercholesterolemii rodzinnej (FH)1. Statyny są tradycyjnie pierwszą linią leków stosowanych w leczeniu FH i innych rodzajów hipercholesterolemii (dziedzicznej lub nabytej). Statyny hamują reduktazę 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A w celu obniżenia syntezy cholesterolu w wątrobie2. Dodatkowo statyny zwiększają poziom LDLR na powierzchni hepatocytów, aby promować klirens LDL-C z osocza. Jednak głównym zastrzeżeniem związanym z leczeniem statynami jest to, że jednocześnie indukują one ekspresję konwertazy proproteinowej subtylizyny/heksyny 9 (PCSK9), enzymu, który wiąże się z LDLR, aby promować jego degradację3. Efekt ten jest odpowiedzialny za niewystarczającą lub nawet zerową odpowiedź na statyny obserwowaną u wielu pacjentów. Badanie tego mechanizmu nieoczekiwanie doprowadziło do odkrycia alternatywnego sposobu leczenia hipercholesterolemii. Przeciwciała PCSK9 niedawno zatwierdzone przez FDA są obecnie stosowane w badaniach klinicznych i wykazują wyższą skuteczność i lepszą tolerancję niż statyny4. Sukces przeciwciał przeciwko PCSK9 sugeruje również, że mogą istnieć inne możliwości terapeutyczne modulowania szlaku degradacji LDLR (oprócz PCSK9) u pacjentów z hipercholesterolemią. Podobnie, istnieje zainteresowanie opracowaniem nowych inhibitorów PCSK9 innych niż przeciwciała, na przykład siRNA oligos5.

Aby przetestować nowe terapie dla FH i ogólnie każdego innego rodzaju hipercholesterolemii, konieczne są odpowiednie modele in vivo. Głównym problemem obecnych modeli in vivo, głównie myszy6 i królików7, są ich fizjologiczne różnice w stosunku do ludzi. Co istotne, problemy te obejmują inny lipidowy profil metaboliczny. Pokolenie ludzkich zwierząt chimerycznych wątroby8 może pomóc przezwyciężyć to zastrzeżenie. Ludzka chimeryczna mysz wątrobowa jest typem "humanizowanej" myszy, której wątroba jest ponownie zasiedlona ludzkimi hepatocytami, na przykład pierwotnymi ludzkimi hepatocytami (pHH)9. Problem z pHH polega na tym, że nie mogą one być rozwijane ex vivo, szybko tracą swoją funkcję po izolacji i są ograniczonym źródłem. Alternatywą dla pHH jest zastosowanie hepatocytów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) (iHeps)10. Warto zauważyć, że iPSC są specyficzne dla pacjenta i mogą być uprawiane w nieskończoność, więc iHeps może być produkowany na żądanie, co stanowi istotną przewagę nad świeżym pHH. Co więcej, iPSC mogą być również łatwo modyfikowane genetycznie za pomocą zaprojektowanych nukleaz w celu skorygowania lub wprowadzenia mutacji na tle izogenicznym, aby umożliwić bardziej wierne porównania11.

Ludzka chimeryczna mysz wątroby z wszczepionym pH wykazuje podobieństwa do ludzi w profilach metabolicznych wątroby, reakcjach na leki i podatności na zakażenie wirusem zapalenia wątroby12. To sprawia, że są dobrym modelem do badania hiperlipidemii in vivo. Najczęściej używane modele myszy są oparte na Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (FRG) mouse13 oraz transgenicznej klasie myszy8, w której do 95% wątroby myszy może zostać zastąpione przez pHH. Co ciekawe, niedawny raport opisywał ludzką chimeryczną mysz wątroby FH (opartą na myszy FRG) z pHH od pacjenta z homozygotyczną mutacją LDLR14. W tym modelu ponownie zasiedlone ludzkie hepatocyty nie miały funkcjonalnego LDLR, ale pozostałe hepatocyty myszy miały, zmniejszając w ten sposób użyteczność wykonywania testów in vivo leków opartych na szlaku LDLR.

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół oparty na naszym niedawno opublikowanym work15 do wszczepienia FH iHeps do wątroby myszy Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG). Ta ludzka chimeryczna mysz wątroby jest przydatna do modelowania FH i wykonywania testów leków in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody, które obejmują wykorzystanie zwierząt, zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystania Żywych Zwierząt w Nauczaniu i Badaniach (CULATR) Uniwersytetu w Hongkongu.

1. Przygotowanie myszy i testy fenotypowe

  1. Pokolenie myszy z nokautem Ldlr (KO) z niedoborem odporności.
    1. Użyj szczepów myszy Ldlr-/-, Rag2-/- i Il2rg-/- (patrz tabela materiałów).
    2. Skrzyżuj myszy Rag2-/- z myszami Il2rg-//, aby wygenerować myszy Rag2-/-/ Il2rg-//-, a następnie skrzyżuj myszy Ldlr-/- z myszami Rag2-/-/ Il2rg-//-, aby wygenerować myszy Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG)15. W wieku od 3 do 4 tygodni należy pobrać genomowe DNA z ucha, aby określić genotyp metodą PCR i sekwencjonowania.
    3. W wieku od 8 do 12 tygodni użyj samców myszy LRG jako biorców iHeps do wytworzenia ludzkich myszy chimerycznych
      4. wątroby.
  2. Nakarm myszy dietą wysokotłuszczową i wysokocholesterolową (HFHC) na 7 dni przed przeszczepem iHep, aby pomóc im rozwinąć hipercholesterolemię.
  3. Aby wywołać uszkodzenie wątroby, które ułatwia namnażanie się wszczepionych iHeps w wątrobie, umieść myszy w sterylnym pojemniku i naświetl je za pomocą promiennika gamma promieniami γ w dawce 3 Gy 24 godziny przed wszczepieniem. Następnie umieść myszy z powrotem w ich klatkach. Stan zdrowia tych napromieniowanych myszy można monitorować, mierząc ich wagę. Myszy z 20% lub większą utratą masy ciała zostaną poddane eutanazji.

2. Różnicowanie i dysocjacja iHep

LDLR heterozygotyczne KO (+/-) lub homozygotyczne KO (-/-) ludzkie iPSC, lub FH pacjent-iPSC z heterozygoycznymi mutacjami w LDLR (FH iPSC) są używane do produkcji iHeps. Generowanie LDLR +/- lub -/- iPSC i FH iPSC jest opisane w naszym poprzednim raporcie15.

  1. Ukierunkowane różnicowanie iPSC na iHeps
    UWAGA: Metoda różnicowania ludzkich iPSC na iHeps została zmodyfikowana w stosunku do poprzedniego raportu16.
    1. Trzy dni przed różnicowaniem (dzień -3) wysiewaj iPSC na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzą zewnątrzkomórkową (patrz Tabela materiałów) o gęstości 300 000 komórek/basenik w 1,5 ml (również dalej) ludzkiej pożywki podtrzymującej iPSC (patrz Tabela materiałów) uzupełnionej inhibitorem 5 μM ROCK (Y27632). Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 . Zwykle iHeps z płytki 6-dołkowej wystarcza do wszczepienia 5 myszy.
    2. 24 godziny później (dzień -2) i 48 godzin później (dzień -1) zmienić pożywkę na świeżą pożywkę podtrzymującą iPSC dla ludzi bez inhibitora ROCK.
      UWAGA: iPSC przed różnicowaniem powinny wyrażać wysokie poziomy OCT4 i NANOG, które można zbadać za pomocą ilościowego RT-PCR, immunofluorescencji lub cytometrii przepływowej.
    3. W dniu 0 różnicowania przemyj komórki raz RPMI 1640, a następnie dodaj RPMI 1640 uzupełniony 100 ng/ml aktywiny A i 25 ng/ml WNT3a.
    4. W 1. i 2. dniu różnicowania zmień pożywkę dla RPMI 1640 uzupełnioną 100 ng/ml Activin A.
      UWAGA: Jeśli na tym etapie (dni 0-3) następuje zbyt duża śmierć komórek, do pożywki można dodać do 0,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby poprawić żywotność komórek. Sugerujemy jednak przetestowanie minimalnej ilości FBS, która ma zostać dodana dla każdej konkretnej linii iPSC, ponieważ nadmiar FBS może również wpływać na różnicowanie.
    5. W dniu 3 przemyj komórki DMEM raz, a następnie przełącz się na pożywkę 2 etapu (20% wymiany surowicy, 1x aminokwasy endogenne, 2 M L-glutamina, 0,1 M beta-merkaptoetanol i 1% sulfotlenek dimetylu w pożywce DMEM). Zmieniaj podłoże co drugi dzień do 10,
      UWAGA: W dniu 7 komórki powinny osiągnąć konfluencję i mieć wyraźne krawędzie. Na tym etapie mogą pojawić się pewne niezróżnicowane obszary; Zignoruj je, jeśli procent tych obszarów jest mały. Jeśli odsetek ten jest wysoki, należy zmniejszyć zbieg iPSC w dniu 0 i zmniejszyć ilość FBS stosowanych w pierwszym etapie różnicowania.
    6. W dniu 10 należy raz przepłukać komórki pożywką podstawową hepatocytów, a następnie przejść na pożywkę do hodowli hepatocytów uzupełnioną ludzkim czynnikiem wzrostu wątroby o stężeniu 20 ng / ml i onkostatyną M o stężeniu 20 ng / ml w celu przyspieszenia dojrzewania iHep. Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
      UWAGA: Na tym etapie >90% komórek powinno być dodatnich na obecność HNF4A, zgodnie z barwieniem immunofluorescencyjnym lub cytometrią przepływową.
    7. W 15–17 dniu komórki są gotowe do wszczepienia. Fakultatywnie można pobrać i przechowywać supernatant z hodowli komórkowej w temperaturze -80 °C w celu ilościowego określenia wydzielanej albuminy (ALB) za pomocą iHeps.
      UWAGA: Na tym etapie >80% iHeps powinno być dodatnie dla HNF4A, ALB i α1-antytrypsyny (AAT) zgodnie z barwieniem immunofluorescencyjnym. Około 60–70% dni 17 iHeps powinno być dodatnie dla ASGPR, jak wykazano za pomocą cytometrii przepływowej. W naszych rękach iHeps w tym okresie mają optymalną zdolność do ponownego zasiedlania wątroby myszy; iHeps może wydzielać wyższe poziomy ALB in vitro, ale także starzeć się, jeśli wszczepienie jest opóźnione.
  2. Dysocjacja i ładowanie iHeps do strzykawki insulinowej
    1. Przygotuj wymagane odczynniki i materiały:
      1. 24 godziny przed wszczepieniem rozmrozić wymaganą ilość (V = 40 μL * liczba myszy) macierzy zewnątrzkomórkowej w pojemniku na lód w chłodni, a następnie umieścić strzykawkę insulinową i pudełko z końcówkami o pojemności 200 μl w lodówce o temperaturze 4 °C.
      2. Na godzinę przed wszczepieniem ogrzej enzym dysocjacji komórek uzupełniony 50 μg/ml DNazy I do temperatury pokojowej i umieść pożywkę RPMI 1640 uzupełnioną 20% substytucją surowicy na lodzie.
    2. Wykonaj obrazy kontrastu fazowego (100X i 200X) iHeps, aby zarejestrować ich stan, w tym morfologię komórek, wzrost i gęstość komórek.
    3. Przemyć iHeps 2 ml / studzienkę o temperaturze pokojowej Ca2+ i Mg2+ wolnego od PBS dwukrotnie, a następnie dodać 1 ml enzymu dysocjacji komórek uzupełnionego 50 μg / ml DNazy I do każdej studzienki. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze na 8–10 min.
      UWAGA: Aby poprawić dysocjację komórek za pomocą enzymu dysocjacji komórek, umyj komórki PBS wolnym od Ca2+ i Mg2+. Aby zmaksymalizować żywotność komórek, sugerujemy dysocjację nie więcej niż 6 studzienek na partię na raz. Ponadto sugerujemy ograniczenie leczenia enzymem dysocjacji komórek do mniej niż 10 minut.
    4. Monitoruj morfologię komórek pod mikroskopem. Gdy większość komórek stanie się okrągła, dodaj równą objętość zimnego RPMI 1640 uzupełnionego 20% zamiennikiem surowicy do każdej studzienki, delikatnie odpipetuj komórki, aby oderwały się od płytki, i przenieś zawiesinę komórek do nowej probówki o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Ten etap ma kluczowe znaczenie dla żywotności pobranych komórek. Jeśli komórki są trudne do odłączenia od płytki, nie ma znaczenia, czy część komórek pozostała. Jeśli komórki odczepiają się jako duże kwadraty jednowarstwy, po odwirowaniu delikatnie pipetować, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
    5. Powtórz krok 2.2.4 dla każdej studzienki, aż zostaną zebrane prawie wszystkie przyłączone komórki. Wirować przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml zimnego PBS w probówce o pojemności 15 ml. Delikatnie odpipetować komórki, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową, a następnie dodać zimny PBS do końcowej objętości 1 ml * liczba zdysocjowanych studzienek. Na koniec przepuść komórki przez sitko o wielkości 40 μm, aby usunąć agregaty.
      UWAGA: Zwykle 1-2 x 106 komórek/studzienkę można zebrać po przefiltrowaniu.
    7. Podać 20 μl zawiesiny komórek i dodać 20 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego, następnie policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i zapisać stężenie zawiesiny komórek jako "C". Obliczyć wymaganą objętość (V1 = [106 * (n+1)]/C, gdzie n to liczba myszy do wszczepienia) zawiesiny komórkowej (1 milion/mysz) do wstrzyknięcia dośledzionowego.
    8. Porcję wymaganej objętości zawiesiny komórek rozmieścić w probówkach o pojemności 15 ml i odwirować przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
    9. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości zimnego PBS, aby uzyskać objętość zawiesiny komórek (n + 1) * 55/2 μL (n = liczba myszy), a następnie dodać równą objętość macierzy zewnątrzkomórkowej, aby uzyskać ostateczną objętość zawiesiny komórek (n + 1) * 55 μL.
    10. Umieść zimną strzykawkę z insuliną na lodzie, odłącz tłok, przenieś 55 μl zawiesiny komórek do strzykawki, a następnie włóż tłok z powrotem. Ostrożnie wypuścić bąbelki i umieścić strzykawkę z powrotem na lodzie.
    11. Powtarzać czynności ppkt 2.3.10 do momentu, aż wszystkie strzykawki zostaną załadowane komórkami. Strzykawki są teraz gotowe do wstrzyknięcia.
      UWAGA: Aby zmaksymalizować żywotność komórek, zalecamy trzymanie komórek na lodzie po dysocjacji. W przypadku powyższych kroków 2.2.4–2.2.11 upewnij się, że wszystkie odczynniki są przechowywane w temperaturze 2–8 °C przed użyciem.

3. Wstrzyknięcie iHeps do śledziony

  1. Znieczulić myszy ketaminą (100 mg / kg) i ksylazyną (10 mg / kg) wstrzykiwanymi dootrzewnowo. Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu znieczulenia i monitoruj ich odruchy mięśniowe, aby obserwować efekt znieczulenia i ocenić ból.
  2. Gdy myszy stracą odruch mięśniowy na stymulację, umieść je w prawej bocznej pozycji odleżynowa. Nałóż grubą warstwę kremu do depilacji na miejsce nacięcia w lewym boku na 5–8 minut. Następnie usuń krem do depilacji i włosy, przecierając obszar gazikiem zwilżonym wodą.
  3. Wyszoruj lewą flankę powidonem lub alternatywnie 70% etanolem 3 razy, a następnie namocz go w jodowidonie w celu dezynfekcji.
  4. W komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2 zlokalizuj położenie śledziony, którą można uwidocznić w sposób przezroczysty na lewym boku, a następnie naciąć skórę i ścianę brzucha na 0,5–1 cm. Zewnętrz śledzionę, delikatnie wyciągając tkankę tłuszczową w jej pobliżu za pomocą spiczastych kleszczy. Delikatnie ustabilizuj śledzionę za pomocą wacika.
  5. Wprowadzić igłę strzykawki insulinowej na 3–4 mm do miąższu śledziony i delikatnie wstrzyknąć około 50 μl zawiesiny komórek. Wycofać igłę i umieścić bawełniany wacik w miejscu wstrzyknięcia na 1 minutę, aby zapobiec krwawieniu i rozlaniu materiału.
  6. Przywróć śledzionę do otrzewnej i zamknij ranę nylonowymi szwami 5-0. Następnie trzymaj myszy w ciepłej komorze/inkubatorze przez 3–16 godzin, aby przywrócić im normalną temperaturę ciała i ożywić. Myszy, które przeszły operację, nie wracają do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostaną w pełni wyleczone.
  7. Dodać meloksykam (26 μg/ml) do wody pitnej i wstrzyknąć domięśniowo buprenorfinę (50 μg/kg) jako lek przeciwzapalny i przeciwbólowy. Codziennie monitoruj rany pooperacyjne, aby zapobiec wszelkim stanom zapalnym.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie instrumenty i materiały użyte w krokach 4-7 są sterylne.

4. Test poziomu LDL-C w osoczu

  1. W dniach 0, 7, 14, 21 i 28 po wszczepieniu mocno przytrzymuj myszy LRG, aby zminimalizować ruchy głowy na boki, stosując metodę krępowania oburęcznego, a następnie nakłuj żyłę twarzową za pomocą lancetu. Krew zacznie płynąć po usunięciu lancetu. Zebrać około 50 μl krwi do probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 1 μl EDTA.
    UWAGA: Jeśli chwyt jest zbyt mocny, pobrana objętość krwi może zostać zmniejszona, a myszy mogą umrzeć z powodu trudności w oddychaniu.
  2. Delikatnie wymieszać krew, kilkakrotnie odwracając probówki, a następnie odwirować przy 950 x g przez 15 minut. Zebrać supernatanty i natychmiast przechowywać je w temperaturze -80 °C.
  3. Po pobraniu wszystkich próbek rozmrozić osocze w temperaturze pokojowej i przetestować poziom LDL-C za pomocą zestawu do wykrywania LDL-C zgodnie z instrukcją producenta.

5. Testy in vivo na chimerycznych myszach z wszczepionymi LDLR +/- i FH iHeps

  1. Aby wywołać hipercholesterolemię, należy karmić myszy dietą HFHC na 7 dni przed wszczepieniem.
  2. Po 7 dniach od wszczepienia należy podawać każdej grupie myszy podłoże (PBS, wstrzykiwane podskórnie), przeciwciała PCSK9 w dawce 10 mg/kg mc./tydzień (preparat przeciwciał monoklonalnych PCSK9 klasy klinicznej, wstrzyknięty również podskórnie), symwastatynę w dawce 10 mg/kg mc./dobę (40 mg/l mg/ml w wodzie do picia) lub skojarzone przeciwciała PCSK9 i symwastatynę.
  3. Zbierz osocze myszy w dniach 0 (dzień wszczepienia), 14, 21 i 28 po wszczepieniu. Próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Gdy wszystkie próbki będą dostępne, przetestuj poziom LDL w osoczu za pomocą zestawu do wykrywania LDL-C, zgodnie z instrukcją producenta.

6. Test funkcji śródbłonka

Funkcja śródbłonka jest zaburzona we wczesnym okresie FH i może być testowana w naszym modelu mysim jako wskaźnik ciężkości choroby lub w celu oceny poprawy za pomocą różnych metod leczenia. Do tego celu potrzebna jest stereomikroskopia, kleszcze preparacyjne, nożyczki, miograf druciany, sprzęt do akwizycji (patrz tabela materiałów) i komputer.

  1. Uśmierc myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/kg fenobarbitalu. Usuń narządy wewnętrzne tak, aby aorta zstępująca równolegle do kręgosłupa była widoczna i mogła zostać wycięta nożyczkami wraz z sąsiednimi tkankami i sercem. Wypreparuj aortę cienkimi nożyczkami i umieść je w zimnym, natlenionym roztworze Krebsa (mM: 119 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1 MgCl2, 25 NaHCO3, 1,2 KH2PO4 i 11 D-glukozy).
  2. Przenieść aortę w roztworze Krebsa na pokrytą silikonem płytkę Petriego. Przypnij tkankę łączną, aby ustalić pozycję aorty bez jej rozciągania. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj cienkich kleszczyków, aby wyciąć nożyczki i wypreparować aortę z otaczającego tłuszczu i tkanki przybyszowej, nie uszkadzając ściany naczynia, a następnie pociąć ją na segmenty o długości od 1,5 do 2 mm.
  3. Wytnij drut nierdzewny o długości około 2 cm i grubości 40 μm i delikatnie przełóż przez światło aorty. Przenieś segment do komory miografu drutowego wypełnionej natlenionym roztworem Krebsa, trzymając drut.
  4. Aby zmierzyć długość segmentów aorty podczas badania kurczliwości, umieść każdy segment prostopadle między szczękami i zapisz odczyt (D1) na mikrometrze. Wyjmij segment i przesuń szczęki razem i zapisz odczyt (D0). Długość segmentu wynosiłaby L = D1-D 0.
  5. Postępuj zgodnie z instrukcją obsługi, aby clamp drut i zabezpiecz go śrubokrętem, umieszczając segment między szczękami, ale pozostaw go nierozciągniętym.
  6. W celu normalizacji przed eksperymentem ustaw miograf na zero w pozycji nierozciągniętej. Następnie powoli rozsuń szczękę i obserwuj, jak zmienia się napięcie aorty, aż osiągnie 3 mN. Po 15 minutach spuścić roztwór z komory miografu i zastąpić go świeżym roztworem Krebsa, odczekać 15 minut i ponownie dostosować napięcie do 3 mN.
  7. Zmień standardowy roztwór Krebsa na 60 mM roztwór Krebsa zawierający KCl, aby wywołać skurcz przez co najmniej 15 minut. Spłukać świeżym roztworem Krebsa 3 razy.
  8. Dodać zwiększające się stężenie fenylefryny (Phe; np. od 10 nM do 100 μM). Przemyć standardowym roztworem Krebsa i dodać pojedyncze stężenie Phe na poziomie ~70% maksymalnego skurczu z poprzedniego skurczu. Gdy skurcz jest stabilny, dodaj rosnące stężenie acetylocholiny (ACh; np. od 1 lub 3 nM do 10 lub 30 μM) w celu wywołania rozszerzenia naczyń krwionośnych. ACh jest dodawany w odstępie około 2 minut.
    UWAGA: W niektórych segmentach aorty z małym skurczem wywołanym przez Phe, na przykład mniejszym niż 30% skurczu wywołanego przez KCl, U46619 (inny środek zwężający naczynia krwionośne) w stężeniu od 1 nM do 30 nM może być użyty do wywołania stabilnego skurczu, który jest większy niż 70% skurczu wywołanego przez KCl.
  9. Wyczyść miograf zgodnie z instrukcją producenta.
  10. Korzystając z oprogramowania do analizy danych (patrz tabela materiałów), zapisz siłę (F) po każdym dodaniu leków. Narysuj znacznik do napięcia podstawowego (Fbasal) dla względnego pomiaru, przesuń strzałkę do najwyższego punktu po Phe jako FPhe, a następnie przejdź do najniższego punktu po każdym dodaniu ACh jako FACh. Obliczyć rozszerzenie naczyń krwionośnych zależne od śródbłonka (EDV) wywołane ACh przez % relaksacji = (FACh-F podstawa)/(FPhe-F podstawa) na osi Y. Przygotować krzywą stężenie-odpowiedź w oprogramowaniu statystycznym, używając wartości log10 stężenia w M na osi X.
  11. Aby przeanalizować różnicę statystyczną, użyj obszaru pod krzywą każdego segmentu z jednej myszy i przeanalizuj różnicę obszaru pod krzywą między grupami przy użyciu jednokierunkowej ANOVA. W razie potrzeby można również analizować poszczególne punkty.

7. Dowody na ponowne zasiedlenie iHep w wątrobie myszy

  1. Na końcu należy poskładać myszy, wstrzykując dootrzewnowo 100 mg/kg fenobarbitalu.
  2. Pobrać osocze przez nakłucie serca. Wypreparuj płaty wątroby za pomocą nożyczek okulistycznych, a następnie włóż wątrobę do 10-centymetrowego naczynia i dwukrotnie przemyj solą fizjologiczną. Usuń sól fizjologiczną z powierzchni wątroby za pomocą chłonnego papieru, a następnie pokrój płatki na kawałki o długości około 0,6 cm. Napraw płaty wątroby w 10% formalinie.
  3. Osadzone wątroby należy zatopić w parafinie i wyciąć za pomocą odpowiednio systemu przetwarzania tkanek i przesuwnego mikrotomu, zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Podgrzewać szkiełka do temperatury 60 °C przez 1 godzinę, aby wosk się rozpuścił. Następnie zanurz szkiełka w ksylenie na 5 minut dwukrotnie i ponownie nawodnij tkankę kolejno 100%, 90% i 70% etanolem.
  5. Zanurzyć szkiełka w komorze szkiełkowej zawierającej około 50 ml roztworu do pobierania antygenu, a następnie umieścić komorę w szybkowarze o temperaturze 120 °C na 1,5 minuty. Delikatnie myć szkiełka wodą z rurki przez 5 minut.
  6. Wybarwić skrawki pierwszorzędowymi przeciwciałami (około 100 μl/sekcję) skierowanymi przeciwko ludzkiemu ALB (hALB) i ludzkiemu antygenowi jądrowemu (hNA). Następnie wybarwić przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi ze znacznikiem fluorescencyjnym lub peroksydazą chrzanową (która reaguje z zestawem do wykrywania DAB).
  7. Aby obliczyć procent obszarów hALB+ i komórek hNA+, zeskanuj szkiełka zabarwione anty-hALB i anty-hNA i przereagowały DAB za pomocą automatycznego systemu skanowania slajdów, aby uzyskać obrazy całych przekrojów.
    UWAGA: Obrazy zeskanowane całym przekrojem są pomocne w obliczaniu wydajności ponownego zasiedlenia w bezstronny sposób na podstawie obszarów hALB+ lub komórek hNA+ w wątrobach barwionych immunohistochemicznie. Jako alternatywną metodę monitorowania skuteczności ponownego zasiedlania iHep, poziom albuminy ludzkiej w osoczu można badać przy użyciu zestawu ELISA ALB specyficznego dla człowieka.
  8. Rób migawki, aby pokryć cały slajd, korzystając z powiązanego oprogramowania do przeglądania slajdów cyfrowych w widoku 5X. Aby określić procentowo procentową zawartość obszarów hALB+, dla każdego obrazu migawki należy użyć oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, aby zakwalifikować obszar dodatni (P) i obszar całkowity (T) obrazu, a następnie użyć obrazu J, aby zakwalifikować pusty obszar (B). Odsetek obszarów hALB+ jest wyrażony jako P/(T-B) *100%. Do każdej grupy należy wybrać co najmniej 3 myszy. Dla każdej myszy należy wybrać co najmniej 4 sekcje z różnych pozycji wątroby.
  9. Aby określić ilościowo procent komórek hNA+, dla każdego obrazu migawki losowo wybierz 1/16 obszaru za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu, a następnie ręcznie policz liczbę całkowitych jąder (T) i jąder hNA+ (N). Zawartość procentowa hNA+ jest wyrażona jako N/T *100%. Do każdej grupy należy wybrać co najmniej 3 myszy. Dla każdej myszy należy wybrać co najmniej 4 sekcje z różnych pozycji wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukierunkowane różnicowanie ludzkich iPSC na iHeps
Po osiągnięciu 70% konfluencji, ludzkie iPSC są różnicowane w iHeps za pomocą 3-etapowego protokołu16 (Rysunek 1 górny panel). Po 3 dniach różnicowania endodermy kolonie iPSC rozluźniają się i rozprzestrzeniają do pełnej konfluencji (Rysunek 1 dolny panel). Następnie, z pożywką 2. stopnia, pojawiają się i proliferują hepatoblasty. Komórki te są ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wcześniejsze badania z użyciem iHeps u gryzoni potwierdziły, że jest to skuteczny sposób badania dziedzicznych chorób wątroby17. Aby jeszcze bardziej rozszerzyć zastosowanie tej technologii i ponieważ obecne modele zwierzęce FH są nieoptymalne, wszczepiliśmy FH iHeps myszom LRG i wykazaliśmy, że wszczepiony LDLR +/- lub heterozygotyczny FH iHeps z mutacją LDLR może obniżać poziom LDL-C w osoczu myszy i reagować na leki obniżające poziom lipidów in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

H.-F.T. jest krajowym koordynatorem i badaczem badania ODYSSEY OUTCOMES sponsorowanego przez Sanofi i Regeneron Pharmaceuticals.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Program Badań Podstawowych Rady Nauki i Technologii Shenzhen (JCYJ20150331142757383), Strategiczny Priorytetowy Program Badawczy Chińskiej Akademii Nauk (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Council Tematyczny Program Badawczy (T12-705/11), Program Współpracy Rady ds. Grantów Badawczych Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkongu oraz Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (N-HKU730/12 i 81261160506), Projekt zespołu badawczego Fundacji Nauk Przyrodniczych Guangdong (2014A030312001), Programu Nauki i Technologii Guangzhou (201607010086) oraz Programu Nauki i Technologii Prowincji Guangdong (2016B030229007 i 2017B050506007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały
40 i mikro; m Sitko do komórekBDB4-VW-352340
Płytka 6-dołkowaThermofisher140675Powłoka z matrycą zewnątrzkomórkową
AccutaseMilliporeSCR005
AcetylocholinaSigma AldrichA6625Rozpuścić w wodzie
Roztwór do odzyskiwania antygenuIHC WorldIW-1100-1L
Chlorek wapniaSigma AldrichC8106CaCl2
Enzym dysocjacji komórekThermofisher12604-013TrypLE
D-glukozaSigma AldrichD8270
DimetylosulfotlenekSigma AldrichD5879DMSO
DMEMThermofisher10829Nokaut DMEM
DNase IRoche11284932001
EDTAUSB156940,5 M, PH=8,0
Macierz zewnątrzkomórkowa (do zawieszenia komórek)Corning354234Matrigel Macierz
zewnątrzkomórkowa (do różnicowania iHep)Corning354230Matrigel
Pożywka podstawowa hepatocytówLonzaCC-3199
Pożywka do hodowli hepatocytówLonzaCC-3198
Dieta wysokotłuszczowa i wysokocholesterolowaDieta badawczaD12079B
Ludzka aktywina APeprotech120-14E
Ludzki czynnik wzrostu hepatocytówPeprotech100-39
Ludzka pożywka podtrzymująca iPSCSTEMCELL Technologies5850mTeSR1
Ludzka onkostatyna MPeprotech300-10
Ketamina 10%AlfasanN/A
L-glutaminaThermofisher35050
Zestaw do wykrywania LDL-CWAKO993-00404 i 993-00504
Magnez  chlorekVWRP25108MgCl2
MeloxicamBoehringer IngelheimNADA 141-213
Fosforan monopotasowyUSBS20227KH2PO4
Aminokwasy endogenneThermofisher11140
PBSGESH30256.02Nie zawiera
wapnia i magnezuPrzeciwciała PCSK9Sanofi i Regeneron PharmaceuticalsSAR236553/REGN727Alirocumab
FenobarbitalFirma Alfamedic 013003
FenylefrynaRBIP-133Rozpuścić w wodzie
Chlorek potasuSigma AldrichP9333KCl
Powidon-jodMundipharmaBetadine
Mysz rekombinowana Wnt3aR& D Systems1324-WN-500/CF
Inhibitor ROCK Y27632Sigma AldrichY0503-5MG
RPMI 1640Thermofisher21875
Zamiennik surowicyThermofisher10828
Powlekana silikonem szalka Petriegosilikonowych Dow CorningSylgard 184
SimvastatinMerck Sharp & DohmeZOCOR
Wodorowęglan soduSigma AldrichS6297NaHCO3
Chlorek soduSigma AldrichS7653NaCl
Trypan niebieski roztwór 0,4%Thermofisher15250061
U-46619Cayman16450Rozpuścić w DMSO
Ksylazyna 2%AlfasanN/A
β -merkaptoetanolThermofisher31350
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
>Przeciwciała
AATDAKOA00121:400
ALBBethyl LaboratoriesA80-1291:200
ASGPRSanta CruzSc-289771:100
HNF4ASanta CruzSc-65571:35
NANOGStemgent09-00201:200
Oct4Stemgent09-00231:200
NazwaCompany<strong>Catalog NumerKomentarze
Mice
Il2rg-/- Jacson lab003174
Ldlr-/- Jacson lab002077
Rag2-/- Jacson lab008449
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Equipments
Automatyczny licznik komórekInvitrogenCountess
Gamma irradiatorMDS NordionGammacell 3000 Elan II
Strzykawka insulinowaBD324911
PowerlabADInstrumentsModel 8/30
System skanowania slajdówLeica biosystemsSystem Aperio scanScope
Przesuwny mikrotomLeica biosystemsRM2125RT
StereomicrocopeNikonSMZ800
System przetwarzania tkanekLeica biosystemsASP200S
Wire miografDMT610M
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Softwares
Cyfrowe przeglądanie slajdów oprogramowanieLeicaAperio ImageScope Wersja 12.3.2
Image JNIHWersja 1.51e
Oprogramowanie do przetwarzania obrazówAdobePhotoshop CC Wersja 2015
Oprogramowanie do obrazowania mikroskopowegoCarl ZeissAxioVision LE Wersja 4.7
Zestaw elastomerów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
  2. Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
  3. Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
  4. Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
  5. Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
  6. Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
  7. Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
  8. Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
  9. Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
  10. Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
  11. Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
  12. Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
  13. Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
  14. Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339(2015).
  15. Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
  16. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  17. Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
  18. Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
  19. Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

hepatocyty pochodz ce z iPSCiHeps z niedoborem LDLRmyszy LRGfrakcja naczyniowo stromalnaizolacja kom rekcytometria przep ywowaWestern blotmikroskopia konfokalna

Powiązane artykuły