Artykuł metodologiczny

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

17.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57566

⸱

19 października 2018

 ,  ,  , 
1Institut für Molekulare Zellbiologie

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Streszczenie

Fagocytoza odgrywa kluczową rolę w obronie gospodarza, jak również w rozwoju i utrzymaniu tkanek, i polega na szybkich, zapośredniczonych przez receptory rearanżacjach cytoszkieletu aktynowego w celu wychwytywania, otaczania i pochłaniania dużych cząstek. Chociaż zidentyfikowano receptory fagocytarne, dalsze szlaki sygnałowe i efektory, takie jak GTPazy Rho, dynamiczne przebudowywanie cytoszkieletu określonych zdarzeń fagocytarnych za pośrednictwem receptorów pozostaje niejasne. Czterdzieści lat temu za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej zidentyfikowano dwa odrębne mechanizmy fagocytozy, których przykładem jest fagocytoza za pośrednictwem receptora Fcγ (FcγR) i receptora dopełniacza (CR). Wiązanie cząstek opsonizowanych immunoglobuliną G (IgG) z FcγR powoduje wysunięcie cienkich przedłużeń błony, które początkowo tworzą tak zwaną miseczkę fagocytarną wokół cząstki, zanim zostanie ona całkowicie zamknięta i wycofana do komórki. W przeciwieństwie do tego, opsonizowane cząstki dopełniacza wydają się zatapiać w fagocytach po związaniu się z receptorami dopełniacza. Te dwa tryby fagocytozy, tworzenie miseczek fagocytarnych i zapadanie się, stały się dobrze ugruntowane w literaturze. Jednak różnice między tymi dwoma trybami zostały zatarte przez doniesienia, że fagocytoza za pośrednictwem receptora dopełniacza może indukować różne wypukłości błony. Ze względu na dostępność technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości wymagane są testy fagocytozy, które umożliwiają wizualizację 3D (trójwymiarową) w czasie rzeczywistym tego, w jaki sposób określone receptory fagocytarne pośredniczą w wychwytywaniu poszczególnych cząstek. Częściej stosowane podejścia do badania fagocytozy, takie jak testy punktu końcowego, tracą możliwość zrozumienia, co dzieje się na granicy cząstek i fagocytów. Tutaj opisujemy testy fagocytarne, wykorzystujące poklatkową mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, które umożliwiają obrazowanie 3D pojedynczych zdarzeń fagocytarnych. Ponadto opisujemy testy, aby jednoznacznie zobrazować fagocytozę za pośrednictwem receptora Fcγ lub receptora dopełniacza.

Wprowadzenie

Dwadzieścia lat przed obserwacją przez Metchnikoffa fagocytarnych komórek mezenchymy u larw rozgwiazd, w 1882 roku, i późniejszym rozwinięciem jego teorii fagocytozy1, Ernest Haeckel opisał w 1862 roku pochłanianie nierozpuszczalnych cząsteczek barwnika przez komórki krwi Thetis fimbris (Tethys fimbria)), gatunek drapieżnego ślimaka morskiego (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin 1862). Wyraźnie opisał wypukłości błonowe otaczające cząsteczki, które następnie były pobierane do cytoplazmy i gromadzone wokół jądra komórkowego. Ponad 100 lat później pionierskie badania przeprowadzone przez Kaplana zasugerowały, że istnieją co najmniej dwa morfologicznie odrębne mechanizmy fagocytozy2. Kaplan wykazał za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, że makrofagi otrzewnowej myszy połykały czerwone krwinki owcze opsonizowane IgG za pomocą cienkich przedłużeń błony, które sięgały do góry i szczelnie otaczały cząstkę, początkowo powodując powstanie struktury przypominającej miseczkę. Tworzenie miseczek fagocytarnych wymagało polimeryzacji aktyny, ponieważ zostało zniesione przez przepuszczalną dla komórek toksynę grzybową cytochalazynę B, o której wiadomo, że blokuje dynamikę aktyny3. W przeciwieństwie do tego, czerwone krwinki owcze opsonizowane dopełniaczem wydawały się zatapiać bezpośrednio w makrofagach bez generowania rozszerzeń błony, chociaż na niektórych obrazach można zobaczyć zmarszczki błony w natychmiastowej pustce tonących cząstek. W przeciwieństwie do tworzenia miseczki fagocytarnej, zapadanie się za pośrednictwem receptora dopełniacza było niewrażliwe na leczenie cytochalazyną B2. W eksperymentach opisanych przez Kaplana opsonizację dopełniacza przeprowadzono przez inkubację krwinek czerwonych owiec znakowanych immunoglobuliną M (IgM) z surowicą myszy z niedoborem dopełniacza C5, która omija hemolizę przez końcowy kompleks dopełniacza C5 zależny od dopełniacza

.

Dwa tryby fagocytozy, formowanie miseczki fagocytarnej i zapadanie się, zidentyfikowane przez Kaplana, stały się utrwaloną opinią w branży4,5,6,7,8,9. Jednak obrazy o ultrawysokiej rozdzielczości użyte w oryginalnym badaniu przez Kaplan2, a także w podobnym badaniu przeprowadzonym przez Munthe-Kaas i wsp.10, udostępniaj tylko migawki zdarzeń fagocytarnych. W niedawnym przeglądzie Rougerie i wsp.11 podkreślił, że różnice morfologiczne między fagocytozą za pośrednictwem FcγR i CR pozostają do wyjaśnienia, a ponadto zaobserwowano zmarszczki błony podczas wychwytu cząstek za pośrednictwem receptora dopełniacza2. Obrazowanie na żywych komórkach pojedynczych fagocytarnych zdarzeń rozciągających się od wychwytywania cząstek do internalizacji, w połączeniu z genetycznie zmodyfikowanymi modelami myszy, może znacznie poprawić nasze zrozumienie, w jaki sposób fagocyty wychwytują i połykają cząsteczki. Jednym z podejść może być zastosowanie szybkiej mikroskopii sił atomowych (AFM), która umożliwia obrazowanie topograficzne żywych komórek w ultrawysokiej rozdzielczości (10–20 nm). Ostatnio opracowano szybki system AFM12, który nadaje się do szybkiego obrazowania powierzchni komórek przy niskim poziomie szumów. Technika ta ma tę zaletę, że parametry topograficzne i mechaniczne żywych komórek o wysokiej rozdzielczości mogą być mierzone w krótkich odstępach czasu (sekundach), w przeciwieństwie do skaningowej mikroskopii elektronowej, która wymaga utrwalenia i wysuszenia komórek w punkcie krytycznym. Innym podejściem jest poklatkowa mikroskopia konfokalna 3D, która jest powszechnie dostępna, chociaż fototoksyczność i bielenie są czynnikami ograniczającymi podczas nagrań. Podejście to jest bardzo wszechstronne i umożliwia sekcję optyczną o wysokiej rozdzielczości przestrzennej oraz zapewnia niezwykłą elastyczność w znakowaniu za pomocą oszałamiającej gamy sond fluorescencyjnych, w tym genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych. Tutaj opisujemy testy fagocytozy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem, która pozwala na wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną określonych zdarzeń fagocytarnych, w których pośredniczy receptor

.

Protokół

Protokoły są zgodne z wytycznymi naszej lokalnej komisji etycznej ds. badań na ludziach, jak również z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Izolacja makrofagów otrzewnowych myszy

rezydentnych
  1. Poświęć mysz (w wieku 3–4 miesięcy (dowolnej płci); Na przykład. C57BL/6) przy użyciu przedawkowania lotnego środka znieczulającego izofluranu (>5% w powietrzu) lub dwutlenku węgla13, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Indukcję znieczulenia można łatwo ocenić na podstawie utraty odruchu prostowania14, a także na podstawie utraty odruchu wycofania łapy.
  2. Po oczyszczeniu brzucha myszy 80% etanolem w wodzie, wykonaj nacięcie skóry w linii środkowej i odsłoń leżącą pod spodem ścianę brzucha.
  3. Umieść plastikowy cewnik 24 G w otrzewnej i przepłucz jamę 2x 4,5 ml lodowatego roztworu soli buforowej Hanka (HBSS), bez Ca2+ i Mg2+ za pomocą plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml. Podczas wstrzykiwania należy pozostawić około 0,5 ml resztkowego HBSS (5–4,5 ml (wstrzyknięty) = 0,5 ml) w strzykawce na wypadek, gdyby tkanka została zassana do końcówki cewnika i musiała zostać wydalona. Przenieść zasysaną zawiesinę do 14 ml polipropylenowej probówki okrągłodennej i odwirować przy 300 x g przez 6,5 minuty w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Końcówka plastikowego cewnika jest, co w porównaniu z igłą minimalizuje uszkodzenia treści brzusznej. Zazwyczaj po delikatnym masażu brzucha z jamy otrzewnej można pobrać 8 ml zawiesiny komórek otrzewnej.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki otrzewnej w 1 ml pożywki RPMI 1640 bez wodorowęglanów zawierającej 20 mM Hepes, 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i antybiotyków, takich jak penicylina (100 jednostek/ml) i streptomycyna (100 μg/ml), przygotowanych przez rozcieńczenie 100x penicylina/streptomycyna 1:100. Zazwyczaj daje to stężenie około 6 x 106 komórek/ml.
    UWAGA: Około 30% izolowanych komórek otrzewnej to makrofagi, podczas gdy pozostałe (mniejsze) komórki to limfocyty, głównie limfocyty B.

2. Wysiewanie komórek otrzewnowej w szkiełkach kanałowych

  1. Po pipetowaniu zawiesiny komórek w górę i w dół w celu zmniejszenia zbrylania, należy odpipetować 100 μl zawiesiny do wstępnie napełnionego kanału (objętość, 100 μl) szkiełka kanałowego pokrytego fibronektyną (kanał 100 μl ma wymiary (długość x szerokość x wysokość): 50 mm x 5 mm 0,4 mm).
    1. Wstępnie napełnij komorę, dodając 1 ml pożywki RPMI 1640 (Hepes) uzupełnionej surowicą do jednego z dwóch zbiorników zjeżdżalni kanałowej, przechylając szkiełko, a następnie zasysając pożywkę z dolnego zbiornika (Rysunek 1).
      1. Usuń niechciane pęcherzyki powietrza lub długie paski powietrza z kanału, dodając 1–2 ml pożywki do jednego z dwóch zbiorników, szczelnie nakładając korek zbiornika, a następnie wypompowując powietrze poprzez rytmiczny nacisk kciuka na nasadkę i, w razie potrzeby, przechylając szkiełko. Po wydaleniu powietrza przechyl suwak z niezakorkowanym zbiornikiem (i zawierającym medium) w dół przed zdjęciem korka, aby uniknąć zasysania powietrza z powrotem do kanału.
  2. Inkubować szkiełko kanałowe, wysiane komórkami, w wilgotnej komorze przez 2 godziny w temperaturze 37 °C przy braku CO2 (CO2 nie jest wymagane, ponieważ system buforowy HCO3-/CO2 został zastąpiony przez Hepes). Prowadnice kanałowe można wygodnie umieścić na stojaku, który mieści osiem prowadnic. Zazwyczaj z jednej myszy przygotowuje się 6–8 slajdów, chociaż możliwe jest do 10 lub więcej.
  3. Zdjąć stojak i wymienić pożywkę RPMI 1640 (Hepes) w każdym szkiełku na pożywkę RPMI 1640 zawierającą wodorowęglan, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, a także penicyliną/streptomycyną.
    1. Przechylić suwak i zassać medium najpierw z dolnego zbiornika, a następnie z górnego zbiornika. Następnie dodaj 1 ml nowej pożywki do jednego ze zbiorników, przechyl szkiełko i zassaj pożywkę z dolnego zbiornika, po jej przepłynięciu przez kanał.
    2. Po tym etapie płukania (wymiany medium) napełnij szkiełko kanałowe, dodając 1 ml pożywki do jednego ze zbiorników.
      UWAGA: Etapy mycia za pomocą szkiełek kanałowych są bardzo proste i skuteczne pod względem wymiany roztworu i usuwania nieprzylegających komórek. Należy pamiętać, że pożywka RPMI 1640 (wodorowęglanowa) jest zwykle wstępnie inkubowana z 5% CO2 przez noc, aby zapewnić równowagę termiczną i pH.
  4. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 . Wykonaj eksperymenty następnego dnia.

3. Izolacja ludzkich czerwonych krwinek

  1. W 2 dniu (drugi dzień eksperymentów; po całonocnej inkubacji izolowanych makrofagów otrzewnowych) należy pobrać 1-2 ml krwi żylnej obwodowej od zdrowego dawcy do probówki z heparyną. Przenieść 1 ml do okrągłej probówki wirówkowej o pojemności 2,0 ml (polipropylenu), odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 18 °C (ustawienie empiryczne) i usunąć supernatant (osocze i kożuch).
  2. Delikatnie odessać 100 μl osadzonych krwinek czerwonych i wymieszać tę objętość 1:1 ze zmodyfikowaną pożywką RPMI 1640 (Hepes) (opisaną poniżej) w probówce mikrowirówkowej o okrągłym dnie 2,0 ml. Oznacz rurkę "1:1".
    UWAGA: Pożywka RPMI 1640 (Hepes) stosowana w dniu 2 (do testów) po wyizolowaniu komórek zawiera, oprócz 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, penicylinę (100 jednostek/ml), streptomycynę (100 μg/ml) i 1 mM N-(2-merkaptopropionylo)glicynę (w celu zmniejszenia fototoksyczności). W dalszej części tego medium określa się mianem "zmodyfikowanego" medium RPMI 1640 (Hepes).
  3. Odpipetować 4 μl rozcieńczonej w stosunku 1:1 zawiesiny krwinek czerwonych do 2 ml zmodyfikowanego podłoża RPMI 1640 (Hepes), wstępnie odpipetowanego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml (powtórzyć ten krok, tj. przygotować 2 probówki). Oznacz każdą probówkę jako "4:2000". Umieść probówki "1:1" i "4:2000" na lodzie.

4. Etykietowanie błony plazmatycznej makrofagów

  1. Wyjmij szkiełka kanałowe z nasionami z inkubatora CO2 i wymień pożywkę RPMI 1640 (wodorowęglan) w każdym szkiełku na zmodyfikowaną pożywkę RPMI 1640 (Hepes). Następnie umieścić komórki w wilgotnej komorze o temperaturze 37 °C pod nieobecność CO2,
    UWAGA: Po całonocnej inkubacji i umyciu większość limfocytów jest usuwana z kanału. Większość pozostałych przylegających komórek to makrofagi, które można zidentyfikować morfologicznie lub przez barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu przeciwciała anty-F4/80. Około 95% makrofagów otrzewnowych rezydujących u myszy jest F4/80 dodatnich.
  2. Rozcieńczyć fluorescencyjnie zielone znakowane przeciwciało anty-mysie F4/80 (przechowywane w temperaturze 4 °C) w stosunku 1:40 w zmodyfikowanym pożywce RPMI 1640 (Hepes). Weź szkiełko, przechyl je i odpipetuj (kropla po kropli) 100 μl mieszaniny przeciwciał do otworu kanału 100 μl szkiełka (patrz Rysunek 1). Zassać pożywkę, która wpływa do zbiornika znajdującego się za nim. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C (wilgotne środowisko, bez CO2 ). W okresie inkubacji oznaczyć ludzkie krwinki czerwone (patrz punkt 5).
    UWAGA: Jak wspomniano powyżej, CO2 nie jest wymagany, ponieważ system buforowy HCO3-/CO2 został zastąpiony przez Hepes.
  3. Po 20 minutach inkubacji (podczas których ludzkie krwinki czerwone są barwione i opsonizowane), umyj szkiełko, dodając 1 ml zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 (Hepes) do jednego ze zbiorników i zasysając pożywkę po jej przepłynięciu przez kanał, co jest możliwe dzięki przechyleniu szkiełka. Dodać 1 ml pożywki do krótkotrwałego przechowywania lub przystąpić do eksperymentu (tj. pipetowania cząstek (opsonizowanych czerwonych krwinek) i obrazowania fagocytozy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem).

5. Oznaczanie błony plazmatycznej ludzkich czerwonych krwinek

  1. Znakowanie ludzkich krwinek czerwonych należy rozpocząć natychmiast po inkubacji szkiełka z makrofagów zielonym fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem anty-F4/80 (po sekcji 4.2). Po delikatnym wymieszaniu pobrać 400 μl z jednej z probówek "4:2000" (patrz sekcja 3.3) i przelać je do (okrągłego dna) probówki wirówkowej o pojemności 2,0 ml. Odczekać, aż zawiesina ogrzeje się do temperatury około 37 °C (patrz akapit poniżej). Dodać 0,4 μl pomarańczowego/czerwonego fluorescencyjnego barwnika plazmatycznego (podwielokrotności przechowywane w temperaturze -20 °C), wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min.
    UWAGA: Podgrzewany blok aluminiowy, umieszczony wewnątrz okapu z przepływem laminarnym, jest przydatny do minimalizowania strat ciepła podczas przygotowywania szkiełek. Rury można umieszczać w studzienkach wiertniczych bloku grzewczego, a oddzielna lub zintegrowana podgrzewana płyta aluminiowa może służyć jako przestrzeń robocza.
  2. Po 5-minutowym okresie inkubacji należy przygotować pierwszy etap płukania, dodając 1600 μl zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 (Hepes) (w celu napełnienia probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml).
  3. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 18 °C (ustawienie empiryczne). Zwarta czerwona granulka powinna być widoczna na ścianie (tj. poza środkiem) na dnie tuby. Obrócić probówkę tak, aby osad był skierowany do góry i ostrożnie usunąć kolejno (w dwóch etapach) cały supernatant za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1–1,5 ml.
  4. Po zassaniu supernatantu dodać 2 000 μl zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 (Hepes), wymieszać (w celu ponownego zawieszenia komórek) i powtórzyć powyższe etapy wirowania i aspiracji supernatantu.
  5. Zawiesić osad (z błony plazmatycznej barwionej i 2x przemyte czerwone krwinki) z 400 μl zmodyfikowanego podłoża RPMI 1640 (Hepes). Oznacz probówkę PMS (skrót od barwienia błony plazmatycznej).
    UWAGA: Alternatywnie, ester sukcynimidylowy wrażliwej na pH pochodnej rodaminy, który staje się silniej fluorescencyjny przy kwaśnym pH, może być użyty do znakowania ludzkich czerwonych krwinek. W tym przypadku intensywność fluorescencji służy dodatkowo jako miara dojrzewania fagosomu po internalizacji cząstek.

6. Opsonizacja (znakowanie) ludzkich czerwonych krwinek za pomocą mysiej immunoglobuliny G (IgG)

  1. Dodać 1 μl mysiego (IgG2b) monoklonalnego (klon HIR2) przeciwciała anty-ludzkiego CD235a (1 mg/ml) (przechowywanego w temperaturze -20 °C) do probówki z napisem PMS (patrz punkty 5.2–5.5), zawierającej barwione błoną plazmatyczną ludzkie krwinki czerwone zawieszone w pożywce o objętości 400 μl. CD235a (znana również jako glikoforyna A) jest błonową sialoglykoproteiną specyficzną dla linii erytroidalnej.
  2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 minut. Należy pamiętać, że opsonizacja ludzkich krwinek czerwonych za pomocą IgG powoduje aglutynację (zlepianie się komórek). Chociaż aglutynacja może służyć jako wizualny wskaźnik opsonizacji, jest niepożądana w przypadku obrazowania pojedynczych efektów fagocytarnych. Aby obejść aglutynację, należy wielokrotnie mieszać zawiesinę komórek (co 1 minutę), używając na przykład pipety o zmiennej objętości 20–200 μl ustawionej na 200 μl.
    1. Pod koniec 8-minutowego okresu inkubacji, jeśli jest to pożądane, umyć szkiełko makrofagowe, inkubowane z zielonym fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem anty-F4/80, z 1 ml zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 (Hepes). Upewnij się, że oba zbiorniki zjeżdżalni kanałowej są wolne od medium po etapach mycia.

7. Obrazowanie fagocytozy ludzkich krwinek czerwonych barwionych błoną plazmatyczną i pokrytych IgG

  1. Po 8 minutowej inkubacji z przeciwciałem anty-CD235a (sekcja 6.2), odpipetować 100 μl zawiesiny zawierającej barwione błoną plazmatyczną i IgG-opsonizowane ludzkie krwinki czerwone do kanału szkiełka zawierającego makrofagi znakowane zielonym fluorescencyjnym przeciwciałem anty-F4/80 (etap 4). W ten sposób czerwone fluorescencyjne, opsonizowane IgG ludzkie krwinki czerwone są dodawane do zielonych fluorescencyjnych fagocytów (makrofagów).
  2. Jak tylko ludzkie krwinki czerwone zostaną dodane, zamontuj szkiełko kanałowe na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem (z inkubatorem stage ustawionym na 37 °C) w celu obrazowania, na przykład przez soczewkę obiektywową 60X/1,49 zanurzoną w olejku. Rozpocznij obrazowanie tak szybko, jak to możliwe, ponieważ cząstki zaczynają osiadać w ciągu 1 minuty.
    UWAGA: Za pomocą koralików fluorescencyjnych o średnicy 100 nm zmierzyliśmy, poprzez analizę funkcji rozrzutu punktowego, rozdzielczości XY x = 0,22 μm, y = 0,23 μm (laser 488 nm) i x = 0,27 μm, y = 0,27 μm (laser 561 nm). Jednak, aby zmniejszyć fotobielenie i fototoksyczność podczas poklatkowego obrazowania 3D żywych komórek, obniżyliśmy rozdzielczość przestrzenną za pomocą binningu 2 x 2. Binning zwiększa czułość (poprawia stosunek sygnału do szumu) i dopuszczalną liczbę klatek na sekundę, ale kosztem rozdzielczości przestrzennej.
  3. Użyj idealnego systemu ustawiania ostrości (lub podobnego), aby zapobiec dryfowaniu ostrości podczas nagrywania. Po aktywacji systemu idealnego ustawiania ostrości użyj kontrolki przesunięcia, aby ustawić ostrość na blaszkowatych występach makrofagów bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym (patrz uwaga poniżej) szkiełka kanałowego. Ten poziom ostrości odpowiada Z = 0 μm. Uzysk stosy Z od -1 μm do +16 μm w krokach co 0,8 μm, co daje 22 warstwy Z. Stosy Z można na przykład uzyskać w tempie 1 stosu (na każdy kanał) co 15 s, co daje w sumie 16 min.
    UWAGA: Dłuższe okresy nagrywania powodują utratę jakości obrazu, głównie z powodu fotowybielania. Stosy Z są rejestrowane dla każdego z dwóch kanałów: makrofagi są obrazowane za pomocą lasera o długości fali 488 nm (kanał zielony), a ludzkie krwinki czerwone są obrazowane za pomocą lasera o długości fali 561 nm (kanał czerwony). Stosując to podejście, można uzyskać różne widoki makrofagów spożywających ludzkie krwinki czerwone opsonizowane IgG w różnych punktach czasowych (na przykład patrz Rysunek 2).
    UWAGA: Typowe ustawienia systemu (z binningiem 2 x 2) to: kanał zielony (moc lasera 20,5% (50 mW; 488 nm), czułość 101 (zakres, 0–255) i czas naświetlania 200 ms); kanał czerwony (moc lasera 10,5% (50 mW; 561 nm), czułość 101 (zakres, 0-255) i czas naświetlania 98 ms).
    UWAGA: Dno szkiełka kanałowego jest wykonane z polimeru o tej samej grubości co szkiełko nakrywkowe #1,5 i tych samych właściwościach optycznych szkła, ale warto zauważyć, że materiał ma tę zaletę, że zapewnia przepuszczalność gazu.

8. Obrazowanie fagocytozy ludzkich czerwonych krwinek barwionych błoną plazmatyczną i pokrytych dopełniaczem

  1. Krwinki czerwone ludzkie barwione błoną plazmatyczną i opsonizowane IgG metodą IgG, podobnie jak w sekcjach 5 i 6, z wyjątkiem, że zamiast pipetować 4 μl zawiesiny krwinek czerwonych rozcieńczonej w stosunku 1:1 do 2 ml zmodyfikowanej pożywki RPMI 1640 (Hepes), jak opisano w sekcji 3.3, pipetować 4 μl do 1 ml zmodyfikowanego podłoża RPMI 1640 (Hepes), i odpowiednio oznacz rurkę 4:1,000. W ten sposób ludzkie czerwone krwinki są 2x bardziej skoncentrowane.
  2. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w sekcjach 4 i 5, ale zaczynając od rozcieńczonego zapasu ludzkich krwinek czerwonych w proporcji 4:1000, a nie 4:2000 (4:1000 i 4:2000 odnoszą się do kolejnych rozcieńczeń początkowo rozcieńczonych ludzkich krwinek czerwonych w stosunku 1:1 opisanych w sekcjach 3.1 i 3.2).
  3. Poświęć mysz o zerowej wartości C5 (np. B10. D2-Hc0 H2d H2-T18 c/oSnJ; Jackson Laboratory) przez (> 5% w powietrzu) wdychanie izofluranu, a następnie dekapitację i pobieranie krwi. Zwykle wlewamy około 0,8 ml krwi do plastikowej probówki o okrągłym dnie i pojemności 14 ml natychmiast po inhalacji izofluranu i dekapitacji.
  4. Po 1 godzinie, gdy krew jest w pełni skrzepnięta, przenieść pozostały płyn do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml i wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie ostrożnie zbierz żółtawe surowicę. Zazwyczaj odzyskujemy co najmniej 200 μl C5 zerowej surowicy. Umieść serum C5 null na lodzie.
  5. Po 4 minutach inkubacji ludzkich krwinek czerwonych barwionych błoną plazmatyczną z IgG, dodać kolejny 1 μl przeciwciała anty-CD235a (dając 2x stężone), a następnie pobrać 50 μl zawiesiny komórkowej i wymieszać ją w oddzielnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml zawierającej 50 μl C5 surowicy zerowej. Kontynuować wielokrotne mieszanie (co 1 minutę), pipetując w górę i w dół, jak w sekcji 6.2, przez kolejne 4 minuty. Tak więc, po tym etapie, ludzkie czerwone krwinki inkubowano z przeciwciałem anty-CD235a przez łącznie 8 min.
    UWAGA: 4-minutowy okres inkubacji z surowicą zerową C5 jest wystarczający do aktywacji klasycznej kaskady dopełniacza i opsonizacji ludzkich krwinek czerwonych za pomocą C3b, który jest rozszczepiany przez czynnik I do iC3b.

9. Potwierdzenie opsonizacji IgG i C3b ludzkich krwinek czerwonych

  1. Potwierdzić opsonizację ludzkich krwinek czerwonych mysim przeciwciałem anty-CD235a IgG (IgG2b; patrz punkt 6.1) poprzez inkubację komórek z kozim przeciwciałem anty-mysim (wtórnym) IgG sprzężonym z zielonym lub czerwonym fluoroforem.
    1. Dodać 1 μl mysiego przeciwciała anty-CD235a IgG i 1 μl znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowego anty-mysiego do 400 μl zawiesiny ludzkich krwinek czerwonych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 min. Następnie umyć dwukrotnie (jak w punktach 5.2–5.5).
    2. Zawiesić osad komórkowy za pomocą 400 μl modyfikowanego podłoża RPMI 1640 (Hepes) i odpipetować 100 μl zawiesiny do szkiełka kanałowego (patrz rysunek 1C) w celu konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego.
      UWAGA: Komórki będą się zlepiać (aglutynować) po umyciu i ponownym wymieszaniu, ale płukanie jest konieczne w celu zmniejszenia fluorescencji tła z powodu niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego.
  2. Potwierdź opsonizację ludzkich krwinek czerwonych, wstępnie znakowanych mysią IgG i inkubowanych z pustą mysią surowicą C5, z C3b / iC3b przy użyciu, na przykład, szczurzego przeciwciała anty-mysiego C3b / iC3b / C3c i przeciwciała drugorzędowego, na przykład koziego przeciwciała IgG przeciwko szczurom sprzężonego z zielonym fluorescencyjnym fluoroforem.
    1. Powtórzyć czynności opisane w punkcie 8 przy użyciu niebarwionych ludzkich krwinek czerwonych.
    2. Dodać 0,25 μl znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała anty-mysiego C3b/iC3b/C3c do mieszaniny 100 μl (50 μl znakowanych IgG ludzkich krwinek czerwonych + 50 μl C5 zerowej surowicy mysie) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 min.
    3. Przemyć dwukrotnie, ponownie zawiesić osad w zmodyfikowanym roztworze RPMI 1640 (Hepes) o pojemności 100 μl i odpipetować zawiesinę do szkiełka kanałowego (patrz rysunek 1C) w celu konfokalnego obrazowania fluorescencyjnego.

Wyniki

Schematyczny rysunek płytki kanałowej użytej do obrazowania fagocytozy za pomocą konfokalnej mikroskopii spinning-disk w trybie time-lapse przedstawiono na Rysunku 1. Ludzkie erytrocyty (hRBCs) są barwione czerwonym fluorescencyjnym markerem błony plazmatycznej CellMask Orange, natomiast izolowane mysie makrofagi otrzewnowe (Ms) są znakowane zielonym fluorescencyjnym przeciwciałem anty-F4/80 sprzężonym z Alexa Fluor 488 (Rysunek 2), które służy zarówno jako specyficzny marker makrofagów mysich, jak i znacznik błony plazmatycznej. Ludzkie erytrocyty można opsonizować mysim IgG (mIgG) lub mysim IgM (mIgM) poprzez inkubację komórek z przeciwciałem anty-CD235a IgG (lub IgM) (CD235a, znane również jako glikoforyna A, jest białkiem specyficznie eksprymowanym na ludzkich erytrocytach). Obrazowanie 3D w trybie time-lapse zielonych fluorescencyjnych makrofagów w obecności czerwonych fluorescencyjnych ludzkich erytrocytów umożliwia wizualizację pojedynczych zdarzeń fagocytozy cząstek (Rysunek 2). Wnikliwa obserwacja pojedynczych zdarzeń fagocytycznych pozwala na szczegółowe opisanie procesu wychwytu i wchłaniania cząstek. Na przykład można zaobserwować wychwyt ludzkiego erytrocyta opsonizowanego mIgG przez filopodium makrofaga, czyli cienką, palcowatą wypustkę (Rysunek 3A; patrz również Horsthemke et al.15). Ponadto można zaobserwować ściskanie ludzkiego erytrocyta podczas formowania się pucharka fagocytowego (Rysunek 3A). Po wprowadzeniu świeżego surowicy mysiej, ludzkie erytrocyty opsonizowane mIgG lub mIgM uruchamiają klasyczną kaskadę dopełniacza, która kończy się powstaniem hemolitycznego kompleksu atakującego błonę. Kinetykę hemolizy zależnej od dopełniacza można zmierzyć poprzez obrazowanie komórek podwójnie barwionych CellMask Orange i kalceiną. Zielona fluorescencyjna cytosolowa kalceina jest szybko uwalniana z komórek podczas hemolizy (Rysunek 3B).

Schemat podciągania kapilarnego w różnych konfiguracjach, pasek papieru, wznoszenie się cieczy, ilustracja procesu.
Rysunek 1: Obsługa szkiełek z kanałami powleczonymi fibronektyną. (A) Szkiełko z kanałem składa się z dwóch zbiorników połączonych kanałem o wymiarach 50 mm x 5 mm x 0,4 mm. Szkiełka z kanałami są wstępnie napełniane poprzez naniesienie 1-2 mL medium do jednego z dwóch zbiorników i przechylenie szkiełka. (B) Przed inkubacją na zbiornikach można umieścić zakrętki. Zakrętki mogą być wygodnie wykorzystane do wypompowania niepożądanych pęcherzyków powietrza przed zasianiem kanału komórkami. (C) Wolny od pęcherzyków powietrza kanał o pojemności 100 µL można napełnić, pipetując medium bezpośrednio do wlotu kanału. Krok ten jest stosowany na przykład w celu zasiania makrofagów w szkiełku lub dodania przeciwciała anty-F4/80 sprzężonego z gfluorophorem (zielonym fluorophorem), który służy jako znacznik błony oraz marker makrofagów mysich. (D) Po wpipetowaniu cząstek, takich jak opsonizowane ludzkie erytrocyty, do kanału zasianego makrofagami zabarwionymi fluorescencyjnie, szkiełko można umieścić na stole mikroskopu odwróconego i przeprowadzić mikroskopię konfokalną z dyskiem obrotowym w trybie time-lapse. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Interakcja makrofagów z RBC; schemat i mikroskopia fluorescencyjna, obrazowanie 3D fagocytozy.
Rysunek 2: Obrazowanie 3D fagocytozy w czasie (time-lapse). (A) Schemat przedstawiający opsonizację ludzkich erytrocytów (hRBCs) z barwioną błoną plazmatyczną (czerwona fluorescencja) za pomocą mysiej (m) przeciwciała immunoglobulin G anty-CD235a (mIgG) oraz prezentację znakowanych hRBCs mysim makrofagom (Ms), znakowanym (zielona fluorescencja) przeciwciałem anty-F4/80 sprzężonym z zielonym fluorophorem. (B) Obrazy time-lapse (rzuty XZ), uzyskane za pomocą konfokalnej mikroskopii dyskowej, pokazujące tworzenie się pucharów fagocytarnych i pochłanianie opsonizowanych mIgG hRBCs. Pasek skali = 10 µm. (C) Rekonstrukcje 3D pokazujące makrofagi pochłaniające opsonizowane mIgG hRBCs. Odpowiadające im rzuty XZ (dla 3 punktów czasowych) przedstawiono w B. Odstępy siatki wynoszą 5,07 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia time-lapse, CellMask Orange, AF488-F4/80, proces fagocytozy makrofagów.
Rysunek 3: Chwytanie cząsteczki przez filopodium. Obrazy time-lapse, uzyskane za pomocą konfokalnej mikroskopii dyskowej, przedstawiające makrofag mysi chwytający opsonizowany immunoglobuliną G mysią (mIgG) ludzki erytrocyt (hRBC) za pomocą filopodium (strzałki w górnym panelu), czyli wypustki przypominającej palec. Należy zauważyć, że erytrocyt traci swoje kremnacje wczesnym etapie formowania się pucharka fagocytarnego. Ponadto pucharzek fagocytarny zdaje się ściskać otoczony erytrocyt (wskazano strzałkami w dolnym panelu). Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Zdecydowana większość testów fagocytozy, zwłaszcza testów punktu końcowego i testów wysokoprzepustowych, nie zapewnia wizualizacji tego, w jaki sposób cząstki są faktycznie wychwytywane, otaczane i spożywane. Pionierskie badania Munthe-Kaas i wsp.10 i Kaplan2 w latach siedemdziesiątych XX wieku sugerowali, że uderzająco różne reorganizacje cytoszkieletu były zaangażowane w fagocytozę cząstek opsonizowanych IgG w porównaniu z opsonizowanymi dopełniaczami (czerwone krwinki owiec). Tutaj opisujemy testy fagocytozy za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem, która umożliwia obrazowanie pojedynczych zdarzeń fagocytarnych w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości. Nasz modelowy fagocyt to makrofag otrzewnowy rezydujący u myszy, który można wyizolować przy minimalnej obsłudze, a jako cząsteczki używamy świeżo izolowanych ludzkich czerwonych krwinek. Jednak testy fagocytozy można zastosować do innych fagocytów, takich jak makrofagi lub neutrofile pochodzące ze szpiku kostnego myszy, linie komórkowe makrofagów myszy, makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów lub neutrofile ludzkiej krwi obwodowej. W przypadku ludzkich fagocytów lub mysich neutrofili wymagane byłyby alternatywne przeciwciała znakowane fluorescencyjnie, takie jak znakowane fluorescencyjnie przeciwciała anty-CD14 (ludzkie monocyty/makrofagi)16 lub przeciwciała anty-Gr-1 (Ly-6G) (neutrofile mysie).

Nieopsonizowane ludzkie krwinki czerwone, podobnie jak tradycyjnie używane czerwone krwinki owcze, są obojętne w tym sensie, że komórki te nie są (lub przynajmniej bardzo rzadko) spożywane przez makrofagi otrzewnowej myszy. Zapewnia to, w przeciwieństwie do kulek polistyrenowych, niską aktywność tła. Ludzkie krwinki czerwone mogą być wygodnie opsonizowane immunoglobulinami przy użyciu mysich przeciwciał monoklonalnych IgG lub IgM przeciwko CD235a (glikoforynie A), specyficznemu markerowi ludzkich erytrocytów (czerwonych krwinek) i prekursorów erytroidalnych17,18. W testach równoległych można zastosować znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe anty-mysie IgG lub IgM w celu potwierdzenia opsonizacji. Klasy przeciwciał IgG i IgM to hemaglutyniny, substancje (przeciwciała), które powodują aglutynację czerwonych krwinek. Aby uniknąć aglutynacji, przerywanie mieszamy zawiesinę komórkową podczas 8-minutowego okresu inkubacji z przeciwciałem anty-CD235a, a następnie dodajemy zmieszaną zawiesinę bezpośrednio do szkiełka kanałowego zawierającego makrofagi (szkiełko pokryte fibronektyną) bez etapu płukania. Etapy płukania polegają na sedymentacji czerwonych krwinek przez wirowanie, co silnie sprzyja aglutynacji. Przed opsonizacją ludzkich czerwonych krwinek oznaczamy błonę plazmatyczną lipofilową pomarańczowo-czerwoną sondą fluorescencyjną. Sonda ta jest jaskrawo fluorescencyjna na początku nagrań poklatkowych, ale sygnał stopniowo zanika, prawdopodobnie głównie z powodu fotowybielania19. Ponadto makrofagi i powłoka fibronektyny szkiełka mogą stać się słabo pomarańczowo-czerwone fluorescencyjne podczas nagrań. Problem ten jest prawdopodobnie spowodowany niewystarczającym myciem ludzkich czerwonych krwinek po oznakowaniu. Zamiast używać lipofilowego fluorescencyjnego markera błony plazmatycznej, ludzkie czerwone krwinki można znakować wrażliwą na pH pochodną rodaminy przy użyciu jej reaktywnego aminowego estru sukcynimidylu15,20. Ma to tę zaletę, że umożliwia wizualizację dojrzewania fagosomów, ponieważ intensywność fluorescencji wzrasta wraz ze spadkiem pH15,20, ale takie podejście ma tę wadę, że reaktywne preparaty estrowe są obecnie drogie i niestabilne po rozpuszczeniu w środowisku wodnym.

Ludzkie krwinki czerwone z opsonizacją IgG są spożywane za pośrednictwem FcγR, co można potwierdzić za pomocą makrofagów otrzewnowych wyizolowanych od myszy NOTAM21 lub Fcer1g-/- (nokaut Fcer1g). Makrofagi NOTAM wiążą ludzkie krwinki czerwone opsonizowane IgG, ale brakuje im sygnalizacji za pośrednictwem ITAM (immunoreceptor tyrozynowy oparty na motywie aktywacji), wymaganej do indukcji fagocytozy, podczas gdy makrofagi nokautujące Fcer1g nie wyrażają powierzchniowych FcγR. IgG- lub IgM-opsonizowane ludzkie krwinki czerwone mogą być dodatkowo opsonizowane C3b (który jest rozszczepiony do iC3b) poprzez inkubację komórek ze świeżo wyizolowaną surowicą od myszy o zerowym dopełniaczu C5 (surowica typu dzikiego powoduje hemolizę). Opsoniny IgG i IgM aktywują klasyczną kaskadę dopełniacza, co prowadzi do powstawania porów (kompleksów atakujących błony) i lizy komórek. U myszy pozbawionych dopełniacza C5 kaskada dopełniacza przechodzi do rozszczepienia dopełniacza C3, ale konwertazie C5 brakuje substratu wymaganego do katalizowania szlaku końcowego. Opracowaliśmy proste testy do pomiaru kinetyki kaskady dopełniacza. Krótko mówiąc, ludzkie czerwone krwinki mogą być znakowane za pomocą czerwonego fluorescencyjnego markera błony plazmatycznej i zielonego fluorescencyjnego, cytozolowego fluoroforu. Po utworzeniu kompleksu atakującego błonę, utworzonego przez składniki dopełniacza C5-C9, cytozolowy fluorofor jest szybko (w ciągu kilku sekund) tracony z cytozolu. Wizualizacja funkcji efektora końcowego (cytolizy) kaskady dopełniacza wykazała, że 4 minuty czasu inkubacji są wystarczające do opsonizacji C3b/iC3b ludzkich krwinek czerwonych. W testach równoległych powłokę C3b/iC3b ludzkich krwinek czerwonych można łatwo ocenić po zastosowaniu mieszaniny przeciwciał anty-mysich C3b i fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał drugorzędowych. W takim przypadku wymagany jest etap płukania w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał fluorescencyjnych. Chociaż etap płukania obejmuje sedymentację komórek przez wirowanie, co sprzyja aglutynacji, udaną opsonizację można łatwo ocenić za pomocą mikroskopii konfokalnej. Fagocytozę za pośrednictwem receptora dopełniacza można obrazować, stosując IgG-/iC3b-opsonizowane ludzkie krwinki czerwone do makrofagów NOTAM lub Fcer1g-/- lub wprowadzając opsonizowane ludzkie krwinki czerwone IgM-/iC3b do makrofagów typu dzikiego. Opsonizowane IgM komórki krwi nie są rozpoznawane przez FcγR zawierające ITAM (FcγRI, FcγRIII i FcγRIV) wymagane do fagocytozy cząstek IgG-opsonizowanych22.

Aby zobrazować zdarzenia fagocytarne, błonę plazmatyczną makrofagów można znakować zielonym fluorescencyjnym przeciwciałem anty-F4 / 80 sprzężonym z fluoroforem, które służy również jako specyficzny marker makrofagów myszy. Ludzkie krwinki czerwone mogą być przewodzone na czerwono fluorescencyjne przez inkubację z pomarańczowo-czerwonym fluorescencyjnym markerem błony plazmatycznej, jak omówiono powyżej. Ten lipofilowy marker błony plazmatycznej pozwala uniknąć potencjalnych mylących skutków etykiet opartych na przeciwciałach. Czerwone fluorescencyjne ludzkie krwinki czerwone, z opsonizacją lub bez, mogą być bezpośrednio pipetowane do kanału 100 μl szkiełka kanałowego i poklatkowego obrazu 3D za pomocą soczewki obiektywowej 60X/1,49 zanurzeniowej (lub podobnej) wykonanej przy użyciu linii laserowych odpowiednio 488 nm i 561 nm mikroskopu konfokalnego (lub podobnego) z wirującym dyskiem. Kuszące jest zoptymalizowanie systemu pod kątem obrazowania w wysokiej rozdzielczości, ale pozyskiwanie powtarzających się stosów Z w ciągu około 16 minut może spowodować znaczne fotowybielanie i fototoksyczność. Zdecydowaliśmy się na użycie binningu 2x2, aby promować dobry stosunek sygnału do szumu i umożliwić zmniejszenie intensywności wzbudzenia i/lub czasów ekspozycji, ale kosztem rozdzielczości optycznej. Ponadto, aby zmniejszyć fototoksyczność, do pożywki dodajemy pochłaniacz reaktywnych form tlenu. W przyszłych badaniach testy mogą zostać zmodyfikowane w celu zobrazowania fagocytozy apoptotycznych ludzkich krwinek czerwonych. Zastosowanie jonoforu Ca2 +, takiego jak A23187, może być wykorzystane do indukowania eksternalizacji fosfatydyloseryny23, sygnału "zjedz mnie" i cechy charakterystycznej wczesnej apoptozy24,25.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty HA 3271/4-1 i HA 3271/4-2 z DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft), oraz grant FF-2016-05 z EXC 1003 (Cluster of Excellence 1003), Cells in Motion (CiM), DFG.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Cewnik plastikowy 24 GB Braun Mesungen AG, Niemcy4254503-01Używany do płukania otrzewnej
Hank' s buforowany roztwór soli bez Ca2+ i Mg2+Thermo Fisher Scientific14170120Stosowany do płukania otrzewnowego
14 mL polipropylenowe probówki okrągłodenneBD Falcon352059Służy do pobierania komórek otrzewnej
RPMI 1640 pożywka zawierająca 20 mM HepesSigma-AldrichR7388Pożywka bazowa do testów
Bydło inaktywowane termicznie surowicaThermo Fisher Scientific10082139Stosowana jako suplement do pożywki RPMI 1640
100x penicylina/streptomycynaThermo Fisher Scientific15140122Stosowana jako suplement do pożywki RPMI 1640
Pokryta fibronektyną µ-Slide  I komoryIbidi, Martinsried, Niemcy80102Szkiełka kanałowe używane do testów
&mikro;-Stojak na szkiełka (anodowane aluminium)Ibidi, Martinsried, Niemcy80003Autoklawowalny stojak do układania w stosy do prowadnic kanałowych
RPMI 1640 zawierający wodorowęglanSigma-AldrichR8758Pożywka do hodowli nocnej
N-(2-merkaptopropionylo)glicynaSigma-AldrichM6635Wymiatacz reaktywnych form tlenu
Alexa Fluor 488-sprzężone przeciwciało monoklonalne (klon BM8) przeciw mysim F4/80 szczurzemu (IgG2a)Thermo Fisher ScientificMF48020Mysi marker makrofagowy i etykieta błony plazmatycznej
CellMask OrangeThermo Fisher ScientificC10045Czerwona fluorescencyjna plama błony plazmatycznej
Ester sukcynimidylowy pHrodoThermo Fisher ScientificP36600Aminowo-reaktywny ester sukcynimidylowy mysiego pHrodo
(IgG2b) monoklonalnego (klon HIR2) anty-ludzkiego CD235a Thermo Fisher ScientificMA1-20893Służy do opsonizacji ludzkich czerwonych krwinek za pomocą IgG
Alexa Fluor 594-sprzężone  kozie przeciwciało anty-mysie (wtórne) IgGAbcamAb150116Służy do potwierdzania opsonizacji ludzkich czerwonych krwinek za pomocą mysiego przeciwciała IgG
Rat anty-mysie C3b/iC3b/C3cHycult BiotechHM1065Służy do potwierdzania opsonizacji C3b/iC3b ludzkich czerwonych krwinek
Alexa Fluor 488-sprzężone kozie przeciwciało anty-szczurze IgGThermo Fisher ScientificA-11006Stosowane jako przeciwciało wtórne w celu potwierdzenia opsonizacji C3b/iC3b
Calceina/AMThermo Fisher ScientificC3100MPSłuży do ładowania ludzkich krwinek czerwonych za pomocą
systemu obrazowania żywych komórek Calcein UltraVIEW Vox 3D Perkin Elmer, Rodgau, NiemcySystem mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem
Mikroskop odwrotny Nikon Eclipse TiNikon, JaponiaMikroskop odwrócony
Skaner krążków CSU-X1Yokogawa Electric Corporation, JaponiaJednostka wirującego dysku Nipkow
14-bitowa Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) Aparat chłodzony ogniwemHamamatsu Photonics Inc., JaponiaKamera EM-CCD systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem 
Laser na ciele stałym 488 nm, 50 mWPerkin Elmer, Rodgau, NiemcyLaser (488 nm) źródło systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem
Laser na ciele stałym 561 nm, 50 mWPerkin Elmer, Rodgau, NiemcyLaser (561 nm) źródło systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem

Bibliografia

  1. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature reviews. Molecular cell biology. 4, 897-901 (2003).
  2. Kaplan, G. Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages. Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).
  3. Cooper, J. A. Effects of cytochalasin and phalloidin on actin. The journal of cell biology. 105, 1473-1478 (1987).
  4. Caron, E., Hall, A. Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science. 282, 1717-1721 (1998).
  5. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual review of immunology. 17, 593-623 (1999).
  6. Chimini, G., Chavrier, P. Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment. Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).
  7. Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. Actin dynamics during phagocytosis. Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).
  8. Swanson, J. A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).
  9. Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).
  10. Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro. Experimental cell research. , 201-212 (1976).
  11. Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton. Immunological reviews. , 222-239 (2013).
  12. Liu, Z., et al. Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells. Nature. 13, 143-146 (2016).
  13. Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).
  14. McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention. Journal of visualized experiments. (80), e51079(2013).
  15. Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
  16. Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho. Scientific reports. 6, 25016(2016).
  17. Poole, J. Red cell antigens on band 3 and glycophorin A. Blood reviews. 14, 31-43 (2000).
  18. Aoki, T. A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins. Membranes. 7, (2017).
  19. Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).
  20. Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).
  21. Boross, P., et al. FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).
  22. Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator. Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).
  23. Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium. British journal of haematology. , 300-302 (1999).
  24. Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. The "phagocytic synapse" and clearance of apoptotic cells. Frontiers in immunology. 8, 1708(2017).
  25. Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview. Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Analiza fagocytozykonfokalna mikroskopia z wirującym dyskiemzależna od receptorów Fczależna od receptorów dopełniaczaizolacja makrofagów otrzewnowychopsonizowane erytrocytyfluorescencyjne znakowanie komórekobrazowanie w czasie rzeczywistym
Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.