Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Leczenie śródmózgowo-komorowe resynitrotoksyną i testy bólu u myszy

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57570

⸱

2 września 2020

 ,  , 
1Laboratory of Clinical Pharmacy and Pharmacology, Musashino University, 2Research Institute of Pharmaceutical Sciences, Musashino University

W tym artykule

Podsumowanie

Sugeruje się, że przejściowy potencjał receptora waniloidowego typu 1 (TRPV1) w okolicy nadrdzeniowej odgrywa pewne role w funkcjonowaniu mózgu. Opisano tutaj protokół wstrzykiwania domózgowo-komorowego resyferatoksyny w celu odczulania TRPV1 nadrdzeniowego u myszy. Przedstawiono również procedury niektórych testów bólowych.

Streszczenie

Wiadomo, że przejściowy potencjał receptora waniloidowego typu 1 (TRPV1), termoczuły kanał kationowy, wywołuje ból w nerwach obwodowych. Oprócz funkcji obwodowej sugeruje się również jego udział w funkcjach mózgu. Wiadomo, że resyferatoksyna (RTX), ultrapotencjalny agonista TRPV1, indukuje długotrwałą desensytyzację TRPV1, a ta desensytyzacja była alternatywnym podejściem do badania fizjologicznego znaczenia komórek wykazujących ekspresję TRPV1. Tutaj opisujemy protokół leczenia śródmózgowo-komorowego (i.c.v.) za pomocą RTX u myszy. Opisano procedury testowania nocycepcji do obwodowej stymulacji TRPV1 (test RTX) i stymulacji mechanicznej (test nacisku na ogon), a następnie następują. Chociaż reakcje nocyceptywne myszy, którym podano RTX i.c.v., były porównywalne z tymi w grupach kontrolnych, myszy podawane przez RTX-i.c.v. były niewrażliwe na przeciwbólowe działanie paracetamolu, co sugeruje, że leczenie i.c.v. RTX może indukować nadrdzeniowo-selektywne odczulanie TRPV1. Ten mysi model może być używany jako wygodny system eksperymentalny do badania roli TRPV1 w funkcji mózgu/nadrdzeniowej. Techniki te mogą być również stosowane do badań nad centralnym działaniem innych leków.

Wprowadzenie

Zwierzęta otrzymują różne bodźce fizyczne i chemiczne ze swojego otoczenia za pośrednictwem czujników na nerwach obwodowych. Przejściowy potencjał receptora waniloidowego typu 1 (TRPV1) jest jednym z termoczułych, nieselektywnych kanałów kationowych, które działają jak czujniki ciepła1,2, a aktywacja i/lub modulacja TRPV1 jest znana jako kluczowy krok dla nocycepcji zarówno w kontekście normalnym, jak i zapalnym3. Chociaż ogólny wzorzec ekspresji jest kontrowersyjny, ekspresja TRPV1 została również zasugerowana w regionach nadrdzeniowych, biorąc udział w różnych czynnościach mózgu (w tym nocycepcji4, termoregulacja5, anxiety6, zespół nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi7 i epilepsy8). Co więcej, ostatnio zasugerowano, że paracetamol, szeroko stosowany środek przeciwbólowy, pośredniczy w aktywacji centralnego TRPV1 w celu wywołania jego działania przeciwbólowego9,10.

Podawanie zwierzętom nadmiaru agonisty TRPV1, w tym kapsaicyny i żywicyferatoksyny (RTX), prowadzi do śmierci neuronów TRPV1-dodatnich i długotrwałego odczulenia na agonistów TRPV111,12. W połączeniu z aplikacją lokalną (intrathecal13,14, intracisternal15,16,17 i intraganglional18), to podejście do ablacji chemicznej zapewniło alternatywny sposób badania fizjologicznych funkcji TRPV1. Niedawno informowaliśmy, że wstrzyknięcie RTX do komór mózgowych (i.c.v.) hamuje przeciwbólowe działanie paracetamolu u myszy, co sugeruje nadrdzeniowo-selektywne odczulanie TRPV119. W tym manuskrypcie przedstawiamy dokładny protokół iniekcji i.c.v. i późniejszych testów przeciwbólowych.

Bezpośrednie wstrzykiwanie leków do komór mózgu umożliwia badanie ich centralnego efektu, jednocześnie minimalizując wszelkie efekty obwodowe. Przedstawiona tutaj procedura iniekcji dożylnej jest modyfikacją metody opisanej przez Haleya i McCormick20. Metoda ta jest prosta, polega na wprowadzeniu igły iniekcyjnej do komór bocznych przez szew koronalny i nie wymaga specjalnego sprzętu ani zabiegów chirurgicznych do kaniulacji.

Obwodowe miejscowe stosowanie agonistów TRPV1 wywołuje uczucie palącego bólu i neurogenne zapalenie. Myszy, które są ogólnoustrojowo leczone RTX i myszy TRPV1-KO, są niewrażliwe na tę stymulację13. Przeprowadziliśmy iniekcję doplantacyjną RTX (test RTX), aby potwierdzić zachowanie obwodowego TRPV1 w RTX-i.c.v. Myszy. Ta metoda jest modyfikacją konwencjonalnego formaliny test21.

Doniesiono, że myszy leczone systemowo RTX i TRPV1-KO wykazują normalny próg bodźców mechanicznych11,13,22. W tym miejscu przedstawiamy procedurę próby ciśnienia w ogonie w celu zbadania zmian w działaniu przeciwbólowym paracetamolu.

Wszystkie te procedury są ortodoksyjne i wszechstronne, i mogą być stosowane do badań nad innymi lekami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne użyte tutaj zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Musashino. Samce myszy ddY (SLC, Shizuoka, Japonia) były trzymane przez co najmniej 7 dni w 12-godzinnym cyklu światła / ciemności przed eksperymentami z wodą i jedzeniem ad libitum. Do eksperymentów wykorzystano 5- lub 6-tygodniowe myszy.

1. Przygotowanie leków

  1. RTX
    UWAGA: Alkoholowy roztwór RTX może spowodować poważne oparzenia skóry i uszkodzenie oczu. Upewnij się, że używasz gumowych rękawic i okularów w celu ochrony podczas obsługi. Ten roztwór podstawowy może być używany przez 6 miesięcy.
    1. Dodaj 500 μl etanolu do 1 mg RTX.
    2. Dodać 500 μl monooleinianu polioksyetylenosorbitolu (20) do roztworu powyżej i dobrze odwirować.
    3. Dodaj 4 ml soli fizjologicznej do mieszaniny i dobrze odwiruj.
    4. Porcję 40 μl roztworu rozlać do probówek z nakrętką o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -40 °C.
  2. Paracetamol
    1. Dodać 20% w/v roztworu glikolu propylenowego do paracetamolu o stężeniu 30 mg/ml i rozpuścić za pomocą sonikatora. Ponieważ paracetamol może wytrącać się w temperaturze pokojowej kilka godzin po rozpuszczeniu, należy przygotować go tuż przed użyciem lub utrzymywać roztwór w cieple do momentu użycia.

2. Podskórne lub domózgowo-komorowe wstrzyknięcie RTX

  1. Rozmrozić podstawowy roztwór przygotowany w ppkt. 1.1 powyżej i rozcieńczyć go do 20 μg/ml w roztworze soli fizjologicznej lub sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (ACSF) składającym się z (w mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 11 glukozy, 1,3MgSO4, 2,5 CaCl2 w równowadze z 95%O2 i 5% CO2 (pH 7,2).
  2. Znieczulić myszy solą sodową pentobarbitalu (60 mg/kg, dootrzewnowo) i sprawdzić, czy nie ma utraty odruchu prostowania.
  3. W leczeniu domięśniowym należy wstrzyknąć RTX (20 μg/ml) w tylną część szyi w objętości 0,1 ml/10 g masy ciała. W przypadku grupy kontrolnej wstrzyknąć nośnik (10% etanolu, 10% monooleinianu polioksyetylenu (20) sorbitolu i 80% soli fizjologicznej) w ten sam sposób.
  4. W przypadku leczenia dożylnego należy wstrzyknąć 5 μl RTX (20 μg/ml) do prawej komory bocznej. W przypadku grupy kontrolnej wstrzyknąć nośnik (10% etanolu, 10% monooleinianu polioksyetylenu (20) sorbitanu i 80% ACSF) w ten sam sposób.
    1. Przełóż jednorazową igłę 27-G przez metalową rurkę (średnica wewnętrzna 0,8 mm), aby odsłonić końcówkę igły o średnicy 3,0-3,5 mm (Rysunek 1A).
    2. Zdezynfekuj głowę myszy 70% alkoholem i mocno przytrzymaj kości łuskowe myszy palcami (Rysunek 1B).
      UWAGA: Zwróć uwagę na położenie występów łuskowych, ponieważ te występy będą służyć jako punkty orientacyjne do wstrzyknięcia.
    3. Przesuń igłę na boki skóry głowy i znajdź szew strzałkowy, gdy końcówka igły jest zaczepiona o szew.
    4. Przesunąć końcówkę o około 1 mm w prawo, a następnie przesunąć końcówkę w kierunku obrotowym i znaleźć szew koronalny, jak w 2.4.3. (Rysunek 1B).
    5. Wprowadź igłę powoli i pionowo, wstrzyknij roztwór RTX w około 10 sekund i przytrzymaj go przez około 10 sekund.
    6. Powoli wyjmij igłę i umieść mysz z powrotem w klatce domowej. Krwawienie jest zwykle minimalne lub nie ma go wcale. Jeśli wystąpi poważne krwawienie, należy rozważyć użycie innej myszy.
  5. Przypisz wstępnie leczone myszy jako obiekty do testu RTX lub testu nacisku na ogon (odpowiednio krok 3 i 4).

3. Test RTX

UWAGA: Testy są przeprowadzane między 10:00 a 17:00. W pomieszczeniu testowym utrzymuje się natężenie 200 luksów i temperaturę 24-26 °C.

  1. Tydzień po wstępnym leczeniu RTX (Krok 2.) przenieś myszy do pokoju testowego co najmniej 60 minut przed rozpoczęciem testu.
  2. Zważ i umieść każdą mysz indywidualnie w klatce z pleksiglasu (29,5 × 17,5 × 13,5 cm3 wysokość) co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem testu, aby umożliwić jej aklimatyzację w środowisku.
    UWAGA: Kolejność testów powinna być zrównoważona we wszystkich grupach przed leczeniem.
  3. Paracetamol (300 mg/kg) należy podać myszy dootrzewnowo 20 minut przed badaniem.
  4. Trzymaj mysz luźno w małej płóciennej torbie i włóż igłę o rozmiarze 30 w piętę prawej tylnej łapy. Przesunąć igłę podskórnie w pobliże podkładek do chodzenia i wstrzyknąć 20 μl roztworu RTX (0,05 μg/ml).
  5. Zmierz okres lizania/gryzienia w nagim obszarze dotkniętej łapy w każdym 5-minutowym bloku.

4. Test ciśnienia w ogonie

UWAGA: Miernik ciśnienia typu Randall-Selitto służy do oceny progu ostrej mechanicznej nocycepcji. Testy wykonywane są w godzinach od 10:00 do 17:00. W pomieszczeniu testowym utrzymuje się natężenie 200 luksów i temperaturę 24-26 °C.

  1. Tydzień po wstępnym leczeniu RTX (krok 2) przenieś myszy do pokoju testowego, a następnie zważ i umieść każdą mysz indywidualnie w klatce z pleksiglasu.
  2. Zaznacz plamki w odległości 1,5 i 2,5 cm od podstawy ogona.
  3. Trzymaj mysz luźno w małej płóciennej torbie i dociśnij miejsca sondą.
    UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia tkanki, narzuca się ciśnienie graniczne 250 g.
  4. Określ ciśnienie wymagane do wywołania zachowania ucieczki (trzepanie ogonem, skręcanie i piszczenie) i oblicz próg nocyceptywny, uśredniając ciśnienie określone w dwóch miejscach.
  5. Kroki od 4.3 do 4.4 powtarzać co 15 minut.
  6. Po uzyskaniu wartości wyjściowej należy podać myszowi paracetamol (300 mg/kg) dootrzewnowo. Po podaniu należy powtórzyć kroki 4.3. i 4,4 co 15 min.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Myszy poddane podaniu i.c.v. nie wykazują widocznych nieprawidłowości w wyglądzie, aktywności spontanicznej, masie ciała19 oraz temperaturze wewnętrznej ciała (grupa traktowana wehikułem, 38,4 ± 0,3 °C, n = 6; grupa traktowana RTX, 38,7 ± 0,2 °C, n = 6).

Rysunek 2A-B przedstawia reakcję myszy traktowanych s.c. lub i.c.v. na wewnątrzplantarne wstrzyknięcie RTX...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszym krokiem w tych eksperymentach jest powodzenie wstrzyknięcia dożylnego. Zastosowana tutaj technika iniekcji dożylnej jest dość prosta, ale wymaga pewnej wprawy. Przed eksperymentami zaleca się praktykę z barwnikami (np. 0,5% błękitu trypanowego w soli fizjologicznej). Jeśli wstrzyknięcie zostanie wykonane prawidłowo, na szwie koronalnym powinien być widoczny ślad po igle, a wstrzyknięty barwnik powinien być obecny w komorze przeciwległej i trzeciej komorze. Ponadto podczas wstrzykiwania należy unikać wprowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ŻywicaLKT LaboratoriesR1774stosowana do wstępnej obróbki s.c./i.c.v. i testu RTX
ParacetamolIWAKI SEIYAKUpodarowany przez IWAKI SEIYAKU
Sól sodowa pentobarbitaluTokyo Chemical IndustryP0776używany do znieczulenia
Etanol (99,5)Wako Pure Chemical Industries057-00456używany do rozpuszczania RTX
Polioksyetylen(20) Monooleinian SorbitanuWako Pure Chemical Industries161-21621stosowany do rozpuszczania RTX
25 i #956; L mikrostrzykawkaHamilton1702LTużywana do iniekcji dożylnych
100 μ L mikrostrzykawkaHamilton1710LTużywana do iniekcji wewnątrzpodeszwowej
Jednorazowa igła o rozmiarze 26TERUMONN-2613Sużywana do iniekcji dożylnej
Igła jednorazowa 30 GNIPRO01134używana do iniekcji wewnątrzzakładowej
Miernik ciśnieniaUgo BasileAnalges-Meter Typ 7200używany do próby ciśnienia ogonowego

Bibliografia

  1. Cavanaugh, D. J., Chesler, A. T., Braz, J. M., Shah, N. M., Julius, D., Basbaum, A. I. Restriction of transient receptor potential vanilloid-1 to the peptidergic subset of primary afferent neurons follows its developmental downregulation in nonpeptidergic neurons. J Neurosci. 31 (28), 10119-10127 (2011).
  2. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
  3. Caterina, M. J., et al. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science. 288 (5464), New York, N.Y. 306-313 (2000).
  4. Starowicz, K., et al. Tonic endovanilloid facilitation of glutamate release in brainstem descending antinociceptive pathways. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (50), 13739-13749 (2007).
  5. Gavva, N. R., et al. The vanilloid receptor TRPV1 is tonically activated in vivo and involved in body temperature regulation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (13), 3366-3374 (2007).
  6. Marsch, R., et al. Reduced anxiety, conditioned fear, and hippocampal long-term potentiation in transient receptor potential vanilloid type 1 receptor-deficient mice. Journal of Neuroscience. 27 (4), 832-839 (2007).
  7. Tzavara, E. T., et al. Endocannabinoids activate transient receptor potential vanilloid 1 receptors to reduce hyperdopaminergia-related hyperactivity: Therapeutic implications. Biological Psychiatry. 59 (6), 508-515 (2006).
  8. Nazıroğlu, M., Övey, İS. Involvement of apoptosis and calcium accumulation through TRPV1 channels in neurobiology of epilepsy. Neuroscience. 293, 55-66 (2015).
  9. Mallet, C., et al. TRPV1 in brain is involved in acetaminophen-induced antinociception. PloS one. 5 (9), 1-11 (2010).
  10. Barrière, D. A., et al. Fatty acid amide hydrolase-dependent generation of antinociceptive drug metabolites acting on TRPV1 in the brain. PloS one. 8 (8), e70690(2013).
  11. Jancsó, G., Kiraly, E., Jancsó-Gábor, A. Pharmacologically induced selective degeneration of chemosensitive primary sensory neurones. Nature. 270 (5639), 741-743 (1977).
  12. Szallasi, A., Blumberg, P. M. Vanilloid receptor loss in rat sensory ganglia associated with long term desensitization to resiniferatoxin. Neuroscience Letters. 140 (1), 51-54 (1992).
  13. Cavanaugh, D. J., et al. Distinct subsets of unmyelinated primary sensory fibers mediate behavioral responses to noxious thermal and mechanical stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (22), 9075-9080 (2009).
  14. Jeffry, J. A., Yu, S. Q., Sikand, P., Parihar, A., Evans, M. S., Premkumar, L. S. Selective targeting of TRPV1 expressing sensory nerve terminals in the spinal cord for long lasting analgesia. PLoS ONE. 4 (9), e7021(2009).
  15. Jancsó, G. Intracisternal capsaicin: selective degeneration of chemosensitive primary sensory afferents in the adult rat. Neuroscience letters. 27 (1), 41-45 (1981).
  16. Gamse, R., Saria, A., Lundberg, J. M., Theodorsson-Norheim, E. Behavioral and neurochemical changes after intracisternal capsaicin treatment of the guinea pig. Neuroscience Letters. 64 (3), 287-292 (1986).
  17. Neubert, J. K., et al. Characterization of mouse orofacial pain and the effects of lesioning TRPV1-expressing neurons on operant behavior. Molecular pain. 4, 43(2008).
  18. Karai, L., et al. Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control. The Journal of clinical investigation. 113 (9), 1344-1352 (2004).
  19. Fukushima, A., Mamada, K., Iimura, A., Ono, H. Supraspinal-selective TRPV1 desensitization induced by intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin. Scientific reports. 7 (1), 12452(2017).
  20. Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British journal of pharmacology and chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
  21. Tjølsen, A., Berge, O. G., Hunskaar, S., Rosland, J. H., Hole, K. The formalin test: an evaluation of the method. Pain. 51 (1), 5-17 (1992).
  22. Ohsawa, M., Miyabe, Y., Katsu, H., Yamamoto, S., Ono, H. Identification of the sensory nerve fiber responsible for lysophosphatidic acid-induced allodynia in mice. Neuroscience. 247, 65-74 (2013).
  23. Tanabe, M., Tokuda, Y., Takasu, K., Ono, K., Honda, M., Ono, H. The synthetic TRH analogue taltirelin exerts modality-specific antinociceptive effects via distinct descending monoaminergic systems. British journal of pharmacology. 150 (4), 403-414 (2007).
  24. Ono, H., et al. Reduction in sympathetic nerve activity as a possible mechanism for the hypothermic effect of oseltamivir, an anti-influenza virus drug, in normal mice. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 113 (1), 25-30 (2013).
  25. Kauer, J. A., Gibson, H. E. Hot flash: TRPV channels in the brain. Trends in neurosciences. 32 (4), 215-224 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wstrzyknięcie do komór mózgowiczegoleczenie rezyniferatoksynądesensytyzacja TRPV1testy bólową u myszytest nacisku na ogontest nocyceptywny RTXanalgezja paracetamolemselektywność nadkręgowaneurofarmakologia myszyagonista TRPV1
Leczenie śródmózgowo-komorowe resynitrotoksyną i testy bólu u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.