Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bispecyficzne przeciwciało ukierunkowane na GPC3, GPC3-S-Fab, o silnej cytotoksyczności

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57588

⸱

12 lipca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-Sen University, 2Center for Cellular & Structural Biology, Sun Yat-Sen University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji bispecyficznego przeciwciała GPC3-S-Fab w Escherichia coli. Oczyszczony GPC3-S-Fab ma silną cytotoksyczność wobec komórek raka wątroby GPC3-dodatnich.

Streszczenie

Ten protokół opisuje budowę i badania funkcjonalne bispecyficznego przeciwciała (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAb mogą rozpoznać dwa różne epitopy poprzez ich dwa różne ramiona. bsAbs były aktywnie badane pod kątem ich zdolności do bezpośredniej rekrutacji komórek odpornościowych do zabijania komórek nowotworowych. Obecnie większość bsAb jest wytwarzana w postaci rekombinowanych białek, albo jako bsAb zawierające Fc, albo jako mniejsze pochodne bsAb bez regionu Fc. W tym badaniu GPC3-S-Fab, bispecyficzne przeciwciało oparte na fragmencie przeciwciała (Fab), zostało zaprojektowane poprzez połączenie Fab przeciwciała anty-GPC3 GC33 z przeciwciałem anty-CD16 z pojedynczą domeną anty-CD16. GPC3-S-Fab może być wyrażany w Escherichia coli i oczyszczany za pomocą dwóch chromatografii powinowactwa. Oczyszczony GPC3-S-Fab może specyficznie wiązać się i zabijać komórki raka wątroby GPC3 dodatnie poprzez rekrutację komórek NK, co sugeruje potencjalne zastosowanie GPC3-S-Fab w terapii raka wątroby.

Wprowadzenie

Przeciwciała monoklonalne są obecnie powszechnie stosowane w leczeniu raka1. Ze względu na elastyczność przeciwciał aktywnie badano różne formaty oparte na przeciwciałach. W porównaniu z przeciwciałami monoklonalnymi, bsAb mają dwa różne moduły wiążące antygen, co umożliwia im jednoczesne rozpoznawanie dwóch różnych celów i skuteczne wyzwalanie rekrutacji komórek efektorowych układu odpornościowego do namierzania i zabijania komórek nowotworowych2.

Obecne formaty rekombinowanych bsAb można ogólnie przypisać do dwóch klas: bsAbs zawierających Fc i bsAbs bez regionu Fc. W porównaniu z formatami zawierającymi Fc, które są głównie wytwarzane w komórkach ssaków, bsAb bez regionu Fc mają zalety mniejszych rozmiarów, są łatwiej wytwarzane w systemach ekspresji mikroorganizmów i mogą skuteczniej przenikać do tkanek nowotworowych3.

bsAbs bez regionu Fc są często tworzone przez łączenie indywidualnych elementów wiążących, takich jak jednołańcuchowe fragmenty zmiennych (scFvs) lub Fabs3. Bez domen stabilizujących, bsAb oparte na fragmentach scFv często mają obniżoną stabilność termiczną, niską rozpuszczalność lub zwiększony potencjał agregacji4,5. W przeciwieństwie do tego, bsAb oparte na Fab są bardziej stabilne ze względu na heterodimeryzację CH1 i CL w natywnym ugrupowaniu Fab 4,6.

Zmienna domena z przeciwciał zawierających tylko łańcuchy ciężkie (VHH, określane również jako przeciwciała jednodomenowe) są aktywnym fragmentem wiążącym antygen naturalnych przeciwciał o łańcuchu ciężkim7. VHH charakteryzują się wysokim powinowactwem, swoistością konwencjonalnych IgGs8, niską immunogennością i wysoką wydajnością w ekspresji bakterii9. W porównaniu z fragmentami Fv, VHH mają wyższą stabilność termiczną10. W porównaniu z ugrupowaniami Fab, VHH mają mniejsze rozmiary ze względu na brak CH1 i CL. Tak więc S-Fab, format bsAb uzyskany przez połączenie Fab z przeciwciałem jednodomenowym, VHH, został zaprojektowany i przebadany pod kątem jego działania przeciwnowotworowego11,12.

W tym badaniu opisano budowę GPC3-S-Fab poprzez połączenie Fab klasy hGC3313 z anty-CD16a VHH14. GPC3-S-Fab może być efektywnie wytwarzany przez peryplazmatyczną ekspresję w Escherichia coli (E. coli). Badania funkcjonalne GPC3-S-Fab sugerują, że GPC3-S-Fab jest obiecującą strategią leczenia raka wątroby. Tak więc zalety GPC3-S-Fab w porównaniu z alternatywnymi technikami z odpowiednimi odniesieniami do poprzednich badań obejmują łatwą produkcję i oczyszczanie oraz bardziej stabilne bsAbs.

Systemy ekspresji ssaków i prokariotyczne systemy ekspresji były używane do wyrażania różnych formatów BsAbs. W przeciwieństwie do systemów ekspresji ssaków, systemy ekspresji białek oparte na E. coli mają wiele zalet, w tym wysoką wydajność, niskie koszty i oszczędność pracy, łatwość manipulacji genetycznych i wysoką wydajność transformacji15. Dla ekspresji bsAbs u E. coli istnieją dwie podstawowe strategie: ekspresja w cytoplazmie i ekspresja w peryplazmie między cytoplazmą a zewnętrznymi błonami komórkowymi15. W porównaniu ze środowiskiem redukującym cytoplazmę, peryplazma jest środowiskiem bardziej utleniającym, co sprzyja prawidłowemu fałdowaniu i koekspresji białek16. Prawidłowe składanie odgrywa kluczową rolę w rozpuszczalności, stabilności i generowaniu funkcji bsAbs. W związku z tym sekwencja sygnałowa pelB została dodana do N-końca S-Fab, aby skierować wydzielanie do peryplazmy E. coli17. Aby zapewnić prawidłowe fałdowanie, rozpuszczalność, stabilność termiczną i stabilność konformacyjną, często stosuje się zmniejszanie złożoności i rozmiaru przeciwciała16. Format S-Fab składa się z jednego Fab i jednego VHH, który jest bardzo dobrze wyrażany w systemach bakteryjnych, prawdopodobnie ze względu na prostą strukturę i niewielkie rozmiary.

GPC3 został wybrany w tym formacie bispecyficznego przeciwciała GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) należy do rodziny proteoglikanów siarczanu heparyny (HS), który jest zakotwiczony na powierzchni komórki za pomocą glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI)18. GPC3 ulega nadekspresji w 70% przypadków raka wątrobowokomórkowego (HCC), które odpowiadają za większość nowotworów wątroby19,20,21,22. Ponieważ GPC3 rzadko ulega ekspresji w normalnych tkankach, GPC3 został zaproponowany jako potencjalny cel dla HCC. Wyprodukowano wiele mysich mAb przeciwko GPC3. Jednak tylko GC33 wykazywał ograniczoną aktywność przeciwnowotworową 22 i nie wykazywał skuteczności klinicznej u pacjentów. W tym badaniu wykazano, że GPC3-S-Fab jest w stanie rekrutować komórki NK do zabijania komórek nowotworowych GPC314.

Do rekrutacji komórek NK użyto anty-CD16 VHH. CD16a jest receptorem IgG o niskim powinowactwie, ulegającym ekspresji głównie na komórkach NK (natural killer), makrofagach, monocytach i niektórych podtypach limfocytów T. Bierze udział w cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) przez komórki NK23. Ludzkie komórki NK można podzielić na dwa typy, CD56-CD16+ i CD56+CD16-. W przeciwieństwie do komórek NK CD56 + CD16, komórki NK CD56-CD16 + mogą uwalniać wyższe poziomy perforyny i granzymu B, a tym samym wykazywać silną cytotoksyczność24. Komórki Kupffera (KC), wyrażające CD16a, są makrofagami rezydującymi w wątrobie. Komórki Kupffera odgrywają ważną rolę w tłumieniu raka wątroby25. Tak więc bsAb ukierunkowane na CD16a może być bardziej obiecującą strategią niż angażowanie limfocytów T przeciwko rakowi wątroby.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury, w tym pobieranie ludzkiej krwi, zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Uniwersytetu Sun Yat-Sen.

1. Strategia projektowania GPC3-S-Fab

  1. Zaprojektuj GPC3-S-Fab, łącząc Fab anty-GPC3 (humanizowany GC3313) z anty-CD16 VHH14 (Rysunek 1).
  2. Zsyntetyzuj i sklonuj VH-CH1-CD16-VHH i VL-CL do wektorów pET26b i pET21a, jak wcześniej zgłoszono12.

2. Transformacja i kultura

  1. Dodaj 100 ng pET26b zawierającego VH-CH1-CD16 ( Rysunek 1A) i 100 ng pET21a zawierającego VL-CL (Rysunek 1A) do 100 μL kompetentnych komórek BL21 (DE3). Dobrze wymieszaj i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 - 90 s, przenieść i inkubować na lodzie przez 3 - 5 minut.
  2. Dodać 500 μl pożywki bulionu lizogenicznego (LB) do probówki zawierającej komórki BL21 (DE3), a następnie inkubować w temperaturze 37 °C, 150 obr./min przez 45 - 60 min. Rozprowadzić 100 μl komórek BL21 (DE3) na płytkach LB-agar zawierających 50 μg/ml kanamycyny i 100 μg/ml ampicyliny, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 - 16 godzin.
    1. Przygotować bulion lizogeniczny (LB): 1% wag./obj. trypton, 0,5% wag./obj. ekstrakt drożdżowy, 1% wt/obj. NaCl.
  3. Zaszczepić komórki z pojedynczej kolonii w 5 ml pożywki super bulionowej (SB) zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i 100 μg/ml ampicyliny i hodować w temperaturze 37 °C, 220 obr./min, przez noc. Następnie zaszczepić 1 ml kultury w 100 ml pożywki SB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i 100 μg/ml ampicyliny i hodować w temperaturze 37 °C, 220 obr./min przez 4 godziny. Następnie przenieść 10 ml kultury do 1 l pożywki SB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny i 100 μg/ml ampicyliny i wyhodować w temperaturze 37 °C, 220 obr./min.
    1. Przygotuj super pożywkę bulionową: 3,2% wag./obj. trypton, 2% wag./obj. ekstrakt drożdżowy, 0,5% wag./obj. NaCl.
  4. Gdy OD600 osiągnie 0,6 - 0,8, dodać izopropylo-b-D-tio-galaktopyranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 0,2 mM. Hodowla w temperaturze 16 °C, 180 obr./min przez 36 - 48 godzin w celu ekspresji peryplazmatycznej.

3. GPC3-S-Fab Oczyszczanie peryplazmatyczne

  1. Przygotowanie frakcji peryplazmatycznej
    1. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 4 000 x g, w temperaturze 4 °C przez 30 minut, odrzucić pożywkę i zważyć komórki.
    2. Ponownie dokładnie zawiesić komórki w 4 ml lodowatego roztworu sacharozy (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 25% (wag./obj.) sacharozy i 1 mM EDTA) na gram komórek i inkubować na lodzie przez 15 minut.
    3. Odwirować przy 8 500 x g (wirówka stołowa, rotor o stałym kącie nachylenia), 4 °C przez 20 min. Usunąć supernatant (frakcję sacharozy) i zachować go na lodzie.
    4. Ponownie zawiesić granulki w mieszance lodowato zimnych 5 mM MgCl2 i 1 mM PMSF (4 ml na gram komórek). Dodać 40 μl wywaru lizozymu (15 mg/ml) na gram i inkubować na lodzie przez 30 minut.
    5. Wirować przy 8 500 x g (wirówka stołowa, rotor o stałym kącie nachylenia), 4 °C przez 20 min. Przenieść supernatant (frakcję peryplazmatyczną) i zapisać go na lodzie.
    6. Połączyć frakcję sacharozy z frakcją peryplazmatyczną i odwirować w temperaturze 30 000 x g, 4 °C przez 30 min. Usunąć supernatant i zachować go w stożkowej probówce o pojemności 50 ml na lodzie.
  2. Oczyszczanie powinowactwa Ni-NTA
    1. Ponownie zawiesić 1 ml agarozy Ni-NTA, dokładnie mieszając w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny, usunąć 1 ml agarozy Ni-NTA do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać bufor równoważący 10 objętości kolumny (CV) (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl) w celu zrównoważenia.
    2. Wirować przy 400 x g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant. Następnie dodaj agarozę Ni-NTA do probówki o pojemności 50 ml zawierającej frakcję sacharozy i frakcję peryplazmatyczną. Skała w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
    3. Odwirować mieszaninę w temperaturze 400 x g, 4 °C przez 5 minut. Ostrożnie przenieść supernatant do innej świeżej, lodowatej probówki jako frakcję niezwiązaną. Przenieś agarozę Ni-NTA do kolumny grawitacyjnej.
    4. Dodać 10 CV buforu płuczącego (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 20 mM, 30 mM lub 40 mM imidazolu) do kolumny i zebrać elucję jako frakcję przemywającą.
      UWAGA: Roztwory te należy dodawać w kolejności wzrastania stężeń imidazolu.
    5. Dodać 3 CV buforu elucyjnego (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 mM lub 400 mM imidazolu) do kolumny i zebrać elucję jako frakcję elucji 1, 2, 3 i 4,
      UWAGA: Roztwory te należy dodawać w kolejności wzrastania stężeń imidazolu.
    6. Dializować eluowane frakcje w 2 L PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) za pomocą rurki dializacyjnej (12,4 kDa) w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. Sprawdź obecność GPC3-S-Fab za pomocą 12% SDS-PAGE, a następnie za pomocą barwienia na niebiesko Coomassie.
  3. Oczyszczanie powinowactwa IgG-CH1
    1. Przenieś 1 ml żywicy powinowactwa IgG-CH1 do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i najpierw umyj kulki PBS. Następnie dodaj dializowany roztwór zawierający GPC3-S-Fab po kroku 3.2.6. Skała w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
    2. Wirować przy 400 x g przez 5 minut, 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant do innej świeżej, lodowatej probówki i przenieść żywicę do kolumny grawitacyjnej.
    3. Dodać 10 CV buforu płuczącego (PBS) do kolumny i zebrać elucję jako frakcję płuczącą.
    4. Przygotować probówki zbiorcze, dodając 1 M Tris pH 9,0 (0,1 ml na ml każdej eluowanej frakcji). Eluować za pomocą buforu elucyjnego 3 CV (0,1 M glicyny-HCl, pH 2,7) i zebrać eluowaną frakcję; Powtórz 3 razy.
    5. Frakcje eluowane w 2 l PBS należy dializować za pomocą rurki dializacyjnej (12,4 kDa) w temperaturze 4 °C przez 2 godziny. Powtórzyć dwukrotnie.
    6. Oznaczyć stężenie białka za pomocą ultramikrospektrofotometru (współczynnik ekstynkcji molowej: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).

4. SDS-PAGE i analiza Western-blotting

  1. Pobrać 10 μl próbki do buforu ładującego 5x SDS i dobrze wymieszać. Gotować mieszaninę białek w temperaturze 100 °C przez 5 minut.
    1. Przygotuj 5x bufor ładujący SDS: 250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% wt/vol SDS, 0,5% wt/vol błękit bromofenolowy, 50% vol/vol glicerol, 5% vol/vol beta-merkaptoetanol.
  2. Przygotuj żel SDS-PAGE z żelem ładującym (5%) i żelem separacyjnym (12%) zgodnie z wcześniejszym opisem26,27,28.
  3. Załaduj 10 μl mieszanki gotowanych białek i markera białkowego, a następnie uruchom SDS-PAGE.
  4. Zabarwić żel, wstrząsając przez 20 minut roztworem błękitu brylantowego Coomassie, a następnie przeprowadzić odbarwienie.
  5. W przypadku western blotting, po przeniesieniu na membranę PVDF, zablokuj membranę TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% obj./obj. Tween 20) + 5% wag./obj. odtłuszczonego mleka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej podczas wstrząsania.
  6. Inkubować błonę z pierwszorzędowymi przeciwciałami (anty-His lub anty-Flag) rozcieńczonymi w stosunku 1:2,000 w TBST + 5% odtłuszczonym mleku przez 1 godzinę.
  7. Myć TBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej i powtórzyć 3 razy.
  8. Inkubować błonę w przeciwciałie drugorzędowym (mysie przeciwciało Fc sprzężone z HRP) rozcieńczonym w stosunku 1:2,000 w TBST + 5% odtłuszczonym mleku przez 1 godzinę.
  9. Myć TBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej i powtórzyć 3 razy.
  10. Dodaj 1 ml substratu HPR na film, wywołaj i zrób zdjęcia.

5. Analiza filtracji żelowej

  1. Użyj następującej kolumny: Objętość kolumny 24 ml; Bufor równowagowy PBS o pH 7,4; Natężenie przepływu 0,5 ml/min w temperaturze umiarkowanej; Objętość próbki 200 μl.
  2. Użyj następującej objętości i stężenia białka: 500 μL 1,2 mg/ml GPC3-S-Fab. Wirować przy 20 000 x g przez 30 minut i załadować 200 μl.
  3. Aby uzyskać objętość i stężenie markera białkowego, należy pobrać 100 μl cytochromu C (2 mg/ml, 12,4 kDa), 140 μl anhydrazy (3 mg/ml, 29 kDa), 140 μl albuminy (10 mg/mL, 66 kDa) i 200 μl dehydrogenazy alkoholowej (5 mg/mL, 150 kDa) do jednej probówki. Wirować przy 20 000 x g przez 30 minut i załadować 200 μl.
  4. Przed każdym cyklem przemyć co najmniej 2 CV wody destylowanej o natężeniu przepływu 0,5 ml/min.
  5. Zrównoważyć kolumnę z co najmniej 2 CV buforu równowagowego (PBS, pH 7,4) przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min.
  6. Automatycznie wstrzyknij próbkę z prędkością 0,5 ml/min, aby załadować próbkę.
  7. Eluować buforem równowagi w stężeniu 0,5 ml/min i wykrywać przy 280 i 215 nm.

6. Analiza cytometrii przepływowej

  1. Hodowla komórek HepG2 (GPC3 dodatnia), Hep3B (GPC3 dodatnia), Huh7 (GPC3 dodatnia) i MHCC-97H (GPC3 ujemna) w plastikowych naczyniach o wymiarach 100 mm x 20 mm zawierających pożywkę DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną (100 μg / ml) i streptomycyną (50 μg / ml) w temperaturze 37 °C, 5% CO2.
  2. Hodowla komórek CHO (GPC3 ujemnych) i komórek CHO/GPC3 zawierających ludzkiej gDNA GPC3 o pełnej długości (GPC3 dodatnie) w plastikowych naczyniach o wymiarach 100 mm x 20 mm zawierających pożywkę RPMI 1640 z 10% FBS, penicylinę (100 μg/ml) i streptomycynę (50 μg/ml) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Hodowla NK92/CD16 zawierającego ludzki cDNA CD16 o pełnej długości (CD16 dodatni) w kolbie o średnicy 25 cm2 zawierającej pożywkę RPMI 1640 z 10% FBS, penicylinę (100 μg/ml) i streptomycynę (50 μg/ml) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Gdy komórki zlewają się w 70 - 90%, wyrzuć pożywkę i umyj komórki 2 ml PBS. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 - 3 minuty (lub do momentu, gdy komórki zaczną odrywać się od powierzchni). Dodaj 1 ml kompletnej pożywki wzrostowej, aby zneutralizować trypsynę i ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół.
  5. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru Neubauera i wykryj żywotność komórek za pomocą błękitu trypanowego.
  6. Zbierz 3 x 106 komórek dla każdej linii komórkowej. Dodaj 1 ml PBS + 0,2% BSA, aby ponownie zawiesić komórki. Wirować w temperaturze 200 x g, 4 °C przez 5 min. Powtórzyć dwukrotnie.
  7. Dodaj 0,3 ml PBS + 0,2% BSA, aby ponownie zawiesić komórki i przenieś 100 μl (około 1 milion) do każdej probówki okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie kroki od tego miejsca do rur powinny być przechowywane w chłodzie na lodzie. Kiedy przeciwciało wiąże się z antygenem powierzchniowym komórki, kompleks zacznie się internalizować. Utrzymując go w niskiej temperaturze, proces ten jest znacznie spowolniony.
  8. Dodać 10 μl przeciwciał pierwszorzędowych (GPC3-S-Fab lub ludzka IgG1, końcowe stężenie 5 μg/ml) do każdej probówki i inkubować na lodzie przez 1 godzinę.
  9. Dodać 1 ml PBS + 0,2% BSA do przemycia i odwirować w temperaturze 200 x g, 4 °C przez 5 minut. Powtórzyć trzy razy.
  10. Ponownie zawiesić w 100 μl PBS + 0,2% BSA, a następnie dodać 0,5 μl przeciwciała drugorzędowego (anty-ludzkie IgG(H+L)-488, końcowe stężenie 10 μg/ml) i inkubować na lodzie przez 1 godzinę. UWAGA: Na tym etapie należy trzymać komórki z dala od światła.
  11. Dodać 1 ml PBS + 0,2% BSA do przemycia i odwirować w temperaturze 200 x g, 4 °C przez 5 minut. Powtórzyć trzy razy.
  12. Przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego zgodnie ze standardowym protokołem29. Pozyskaj komórki za pomocą lasera o długości fali 488 nm w celu wzbudzenia.

7. Testy cytotoksyczne

  1. Przygotuj komórki nowotworowe.
    1. Hodowla linii komórkowych HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC-97H i CHO zgodnie z opisem w krokach 6.1 - 6.5.
    2. Rozcieńczyć komórki do 0,5 × 105 / ml i umieścić 100 μl komórek (5 000 komórek na dołek) na 96-dołkowych płytkach. Hodowla 6 - 8 godzin, aby umożliwić komórkom przyczepienie się.
  2. Przygotować ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC).
    1. Rozcieńczyć świeżo przygotowaną krew równą objętością PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Na przykład rozcieńczyć 10 ml krwi 10 ml PBS.
    2. Weź 15 ml pożywki do separacji limfocytów do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Powoli przenieść rozcieńczoną krew na pożywkę do separacji limfocytów wzdłuż boku probówki.
      UWAGA: Trzymaj rurkę w pozycji pionowej. Nie należy łamać powierzchni podłoża do separacji limfocytów.
    3. Wirować przy 400 x g przez 35 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym hamulcu.
    4. Powoli usuń górną warstwę osocza i weź białą warstwę krwi zawierającą PBMC na granicy faz osoczo-pożywka separacyjnego limfocytów.
    5. Rozcieńczyć PBMC podwójną objętością PBS + 2% FBS. Wirować przy 400 x g przez 5 min.
    6. Umyj komórki dwukrotnie PBS + 2% FBS. Wirować przy 400 x g przez 5 min. Policz numery komórek zgodnie z opisem w kroku 6.5.
  3. Przygotuj komórki NK.
    1. Przygotować zawiesinę PBMC o stężeniu 5 x 107 komórek/ml w PBS + 2% FBS i umieścić je w probówce okrągłodennej z polistyrenu o pojemności 5 ml.
    2. Dodaj Koktajl Wzbogacający Ludzkie Komórki NK na 50 μL/ml komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    3. Ponownie zawiesić cząstki magnetyczne z zestawu do wzbogacania komórek NK i dobrze wymieszać, aby zapewnić ich równomierne zawieszenie poprzez energiczne pipetowanie w górę iw dół więcej niż 5 razy. Przenieś zawieszone cząstki magnetyczne w stężeniu 100 μl/ml do zawiesiny komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Doprowadzić zawiesinę komórek do całkowitej objętości 2,5 ml, dodając PBS + 2% FBS. Wymieszaj komórki w probówce, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Umieść rurkę (bez nasadki) w magnesie. Pozwól kulkom magnetycznym osiąść na 2,5 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Usuń magnes. Jednym ciągłym ruchem odwróć rurkę, wylewając wzbogaconą zawiesinę komórek do nowej probówki.
    6. Policz numery komórek zgodnie z opisem w kroku 6.5.
  4. Ustaw reakcję cytotoksyczną.
    1. Rozcieńczyć komórki NK do 5 × 105 komórek/ml przy użyciu odpowiedniej pożywki hodowlanej. Dodaj 100 μl zawiesiny komórek NK do komórek nowotworowych posianych na 96-dołkowej płytce.
    2. Dodać 10 μl GPC3-S-Fab w różnych stężeniach, z najwyższą dawką przy końcowym stężeniu 30 μg/ml, 3-krotne rozcieńczenie, 9 punktów (trzy kontrpróby).
    3. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 72 godziny.
    4. Po 72 godzinach inkubacji usunąć pożywkę i dodać 100 μl pożywki DMEM zawierającej 10 μl odczynnika CCK8 do każdej studzienki na 96-dołkowych płytkach, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C.
    5. Odczytać płytkę przy długości fali 450 nm po 1, 2, 3 i 4 godzinach po dodaniu odczynnika CCK8.
    6. Przeanalizuj dane. Oblicz wskaźnik przeżycia jako (OD450 GPC3-S-Fab + Effector + guz - pożywka OD450)/(Guz OD450 - pożywka OD450) × 100% i (OD450 GPC3-S-Fab + guz - OD450 średni)/(OD450 guz - OD450 średni) × 100%. Komórki efektorowe to komórki NK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oczyszczanie GPC3-S-Fab

GPC3-S-Fab oczyszczono z E. coli za pomocą dwuetapowej oczyszczania powinowactwem, najpierw przy użyciu Ni-NTA-agarozy, a następnie oczyszczania powinowactwem IgG-CH1. Po dwuetapowym oczyszczaniu powinowactwem uzyskano homogenny GPC3-S-Fab z obiema łańcuchami w stosunku bliskim 1:1 (Rysunek 2A). Obecność polipeptydów VH-CH1-CD16 VHH oraz VL-CL można...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu przedstawiamy strategię konstruowania nowego formatu bsAbs, GPC3-S-Fab, który może rekrutować komórki NK ukierunkowane na komórki nowotworowe GPC3-dodatnie. S-Fab jest oparty na naturalnym formacie Fab poprzez dodanie anty-CD16 VHH11,12. W porównaniu z bsAbs zawierającymi region Fc, GPC3-S-Fab może być łatwo wytwarzany w peryplazmie bakterii na dużą skalę.

Stosując opisaną w protokole strategię ekspresji i oczyszczania, u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca została finansowo wsparta przez Plan Badawczo-Rozwojowy Prowincji Guangdong (PR Chiny) (2016A050503028).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Inkubator z wytrząsaniemThermo FisherMAXQ 4000
Inkubator z wytrząsaniemZhichengZWYR-D2402
WirówkaCenceGL-10MD
Redlica BeckmanAvanti j-26S XPI
Wirówkaeppendorf5810R
Spektrofotometr ultrafioletowyThermo FisherNanodrop
Analityczny aparat do elektroforezy w żelu poliakrylowo-policylamidowymMini-PROTEAN® Aparat TetraBio-rad
Trans-blotKryteriumBio-rad Bio-rad
chemidoc tm XRS+
Fast Protein Chromatogram cieczowyGE HealthcareAKTA avant
GF kolumnaGE Healthcare28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Cytometr przepływowyBeckmanFC500
Wirówkaeppendorf5702R
Envision czytnik płytekTECANInfinite F50
Anti His-tageBioscience14-6657-82
anti-Flag-tagSigmaF1804
anty-human(H& L)-488A11013Invitrogen
Przeciwciało przeciw mysim IgG sprzężone z HRPSygnalizacja komórkowa7076S
Ni-NTA-AgarozaTribioscienceTBS9202-100
IgG-CH1Thermo Fisher 194320005
Ficoll-Plaque PlusGE Healthcare17-1440-03
Zestaw do wzbogacania komórek NKStemcell19055
MagnetStemcell18000
CCK8 zestawDojindoCK04
DMEMGibcoC11995500CP
RPMI-1640GibcoC11875500CP
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF2442
TrypsynaGibco15050-057
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122Hodowla komórkowa
Marker wzorcowySigma AldrichMWGF200Filtracja żelowa
Izopropylo-b-D-tio-galaktopyranozyd (IPTG)Chemikalia VWRVWRC0487-100G
Rurka do dializySigma AldrichD0655-100FT
KnanamycineVWRVWRC0408-100G
AmpicylinaVWRVWRC0339-100G
TryptonThermo FisherLP0042B
Ekstrakt z drożdżyThermo FisherLP0021B
NaClSangon BiotechA100241
Trizma baseSigma AldrichT6791-1KG
EDTASigma AldrichV900106
GlycinealaddinA110752-500g
KClaladdinP112134-500g
MgClSigma AldrichV900020
AgarSangon BiotechA505255-0250
Fosforan potasu, jednozasadowy bezwodny (KH2PO4)VWR7778-77-0
Fosforan sodu, dwuzasadowy, bezwodny (Na2HPO4)VWR7558-79-4
2-merkaptoetanolVWR60-24-2
Fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)VWR329-98-6
LizozymSigma AldrichL6876-25G
Coomassie Błękit brylantowy R250VWRVWRC0472-50G
Błękit bromofenolowySangon BiotechA500922-25G
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWRVWRC0332-100G
GlicerolSigma AldrichV900122
plastikowa miska 100mm x 20mmKolba Corning430167
25cm2Corning430639
96-dołkowy klaster hodowli komórkowychCorning3599
SacharozaSangon BiotechA610498-0005
CHOKolekcja Kultur Typu Chińskiej Akademii NaukGNHa 3
MHCC-97HKolekcja Kultur Typów Chińskiej Akademii NaukSCSP-528
HepG2Kolekcja Kultur Typu Chińskiej Akademii NaukTCHu 72
Huh7Kolekcja Kultur Typu Chińskiej Akademii NaukTCHu182
Hep3BKolekcja Kultur Typu Chińskiej Akademii NaukTCHu106
NK92ATCCCRL2408
System obrazowania Żywica powinowactwa

Bibliografia

  1. Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
  2. Rathi, C., Meibohm, B. Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs. The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).
  3. Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment. Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).
  4. Demarest, S. J., Glaser, S. M. Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).
  5. Mabry, R., Snavely, M. Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles. IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).
  6. Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability. Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).
  7. Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors. Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).
  8. Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).
  9. Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications. Frontiers in Immunology. 8, 977(2017).
  10. Fernandes, C. F. C., et al. Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases. Frontiers in Immunology. 8, 653(2017).
  11. Li, L., et al. A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing. Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).
  12. Li, A., et al. A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells. AMB Express. 6 (1), 32(2016).
  13. Nakano, K., et al. Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).
  14. Behar, G., et al. Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells. Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).
  15. Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. Expression of single-domain antibodies in bacterial systems. Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).
  16. Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. Prokaryotic expression of antibodies. Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).
  17. Spiess, C., et al. Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies. Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).
  18. Filmus, J., Selleck, S. B. Glypicans: proteoglycans with a surprise. Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).
  19. Baumhoer, D., et al. Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples. American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).
  20. Llovet, J. M., et al. A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis. Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).
  21. Zhu, Z. W., et al. Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders. Gut. 48 (4), 558-564 (2001).
  22. Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution. Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).
  23. Flaherty, M. M., et al. Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice. Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).
  24. Sharma, R., Das, A. Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans. Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).
  25. Li, X. Y., et al. Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells. International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).
  26. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
  27. Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
  28. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  29. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Feng, M., et al. Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja w E. colioczyszczanie przy użyciu niklu-NTAkomórki NKtest cytotoksycznościfrakcja peryplazmatycznaizolacja PBMCwiązanie GPC3chromatografia powinowactwa
Bispecyficzne przeciwciało ukierunkowane na GPC3, GPC3-S-Fab, o silnej cytotoksyczności
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.