Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Protokół pozyskiwania zwyrodnieniowego tenocytu od ludzi

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57634

⸱

9 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine, 2Department of Pathology, Kyung Hee University Hospital at Gangdong, Kyung Hee University School of Medicine, 3Department of Physiology, CHA University School of Medicine, 4Department of Rehabilitation, CHA Bundang Medical Center, CHA University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Stosowanie in vitro tenocytów zwyrodnieniowych jest niezbędne przy badaniu skuteczności nowego leczenia tendinopatii. Jednak większość badań naukowych wykorzystuje tylko model zwierzęcy lub zdrowy tenocyt. Proponujemy następujący protokół izolacji ludzkich tenocytów zwyrodnieniowych podczas operacji.

Streszczenie

Tendinopatia, bolesny stan, który rozwija się w odpowiedzi na zwyrodnienie ścięgien, rośnie w rozwiniętym świecie ze względu na rosnącą aktywność fizyczną i dłuższą oczekiwaną długość życia. Pomimo coraz częstszego występowania, leżąca u jego podstaw patogeneza nadal pozostaje niejasna, a leczenie jest na ogół objawowe. Ostatnio badano liczne opcje terapeutyczne, w tym czynniki wzrostu, komórki macierzyste i terapię genową, w nadziei na zwiększenie siły leczniczej zwyrodnieniowego ścięgna. Jednak większość tych badań przeprowadzono tylko na modelach zwierzęcych lub zdrowych ludzkich tenocytach. Pomimo niektórych badań z użyciem patologicznych tenocytów, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, obecnie nie ma protokołu opisującego, w jaki sposób uzyskać ludzkie tenocyty zwyrodnieniowe. Celem pracy jest opisanie standardowego protokołu pozyskiwania ludzkich tenocytów zwyrodnieniowych. Początkowo tkanka ścięgna została pobrana od pacjenta z zapaleniem nadkłykcia bocznego podczas operacji. Następnie pobrano próbki biopsyjne ze ścięgna prostownika nadgarstka promieniowego brevis odpowiadającego zmianom strukturalnym obserwowanym w czasie operacji. Wszystkie pobrane ścięgna wydawały się być matowe, szare, kruche i obrzęknięte, co odróżniało je wizualnie od zdrowych. Tenocyty hodowano i wykorzystywano do eksperymentów. Tymczasem połowa pobranych tkanek została przeanalizowana histologicznie i wykazano, że mają one te same kluczowe cechy tendinopatii (dysplazja angiofibroblastyczną lub hiperplazja). Wtórna analiza za pomocą immunocytochemii potwierdziła, że hodowane komórki były tenocytami, przy czym większość komórek miała dodatnie barwienia na obecność białek irokeza i tenomoduliny. Cechy zwyrodnieniowej natury tenocytów określono następnie poprzez porównanie komórek ze zdrową grupą kontrolną za pomocą testu proliferacji lub qRT-PCR. Zwyrodnieniowy tenocyt wykazywał wyższy wskaźnik proliferacji i podobne wzorce ekspresji genów tendinopatii, które pasowały do poprzednich doniesień. Ogólnie rzecz biorąc, ten nowy protokół może stanowić użyteczne narzędzie dla przyszłych badań nad tendinopatią.

Wprowadzenie

Tendinopatia to przewlekła choroba zwyrodnieniowa układu mięśniowo-szkieletowego, która rozwija się w różnych częściach ciała. Ostatnio liczba przypadków tendinopatii znacznie wzrosła w krajach rozwiniętych ze względu na rosnące uczestnictwo w sportach rekreacyjnych i wydłużenie średniej długości życia1,2. Uważa się, że przyczyna tendinopatii jest wieloczynnikowa, a przyczyny te obejmują niedokrwienie, uszkodzenia spowodowane wolnymi rodnikami tlenowymi, brak równowagi między unerwieniem zwężającym naczynia krwionośne i rozszerzające naczynia krwionośne, wewnętrzne mikropęknięcia i zmiany w neuroregulacji3,4,5,6,7,8. Większość metod leczenia tendinopatii łagodzi jedynie jej objawy. Co więcej, zabiegi bez regeneracji tkanek wymagają długiego czasu na rehabilitację i osiągają ograniczoną odpowiedź ze strony uszkodzonych ścięgien, co stanowi wyzwanie kliniczne dla lekarzy9.

Niekompetencja obecnych opcji leczenia wraz z brakiem zdolności zwyrodnieniowego ścięgna do samoleczenia skłoniła badaczy do zainteresowania się poszukiwaniem alternatywnych strategii leczenia. Ostatnio nowe badania wykazały wiele obiecujących wyników w zakresie poprawy skuteczności gojenia ścięgien tendinopatii za pomocą czynników wzrostu, terapii opartej na komórkach macierzystych i terapii genowej10,11,12.

Poprzez przegląd literatury stwierdziliśmy, że badania można podzielić na dwie kategorie na podstawie materiałów analitycznych: modele zwierzęce, takie jak szczur, mysz czy królik; oraz modele ludzkie. Jeśli chodzi o model zwierzęcy, obecnie istnieją dwie popularne techniki generowania tendinopatii: chemiczna indukcja urazu lub mechaniczne przeciążenie modelu. Jednak każdy model zwierzęcy był ograniczony w odtwarzaniu złożonej patologii ludzkiej tendinopatii13,14.

Większość prac z wykorzystaniem próbek ludzkich została przeanalizowana histologicznie lub przeprowadzono eksperyment in vitro na zdrowym ludzkim tenocycie zamiast na tenocycie zwyrodnieniowym15,16,17,18,19,20,21. Tylko kilka artykułów informowało, że używali ludzkiego tenocytu zwyrodnieniowego, ale nie opisywali szczegółowo protokołu użytego do uzyskania zwyrodnieniowego tenocytu z human22,23. W tym kontekście należy zauważyć, że pomyślne wyniki zarówno z modelu zwierzęcego, jak i zdrowej tkanki/tenocytu niekoniecznie muszą przewidywać skuteczność u ludzi lub skuteczne dawkowanie, ponieważ zwyrodnienie ścięgien jest skomplikowanym procesem, a patogeneza nadal nie jest w pełni poznana.

Zbiorczo, konieczne jest opisanie standardowego protokołu pozyskiwania zwyrodnieniowego tenocytu z tkanki ludzkiej bez powodowania negatywnych skutków dla dawcy. W tym artykule opisano protokół pozyskiwania ludzkiego tenocytu zwyrodnieniowego. Aby potwierdzić słuszność protokołu, pobrane tkanki poddano analizie histologicznej. Następnie potwierdzono, że wyhodowana komórka jest zwyrodnieniowym tenocytem za pomocą immunocytochemii (ICC), ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i testu żywotności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół został przeprowadzony zgodnie z Deklaracją Helsińską i protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną w Centrum Medycznym CHA Bundang.

1. Pobranie tkanki zwyrodnieniowej ścięgna od pacjenta

  1. Zdiagnozuj zapalenie nadkłykcia bocznego, zbierając wywiad medyczny i wykorzystując wyniki badania fizykalnego: tkliwość w pobliżu ścięgna w pobliżu nadkłykcia bocznego; ból wywołany przez oporne wyprostowanie stawu nadgarstkowego.
  2. Należy zastosować następujące kryteria włączenia: wiek powyżej 18 lat; przebyte zapalenie nadkłykcia bocznego przez co najmniej sześć miesięcy; oporny na leczenie nieoperacyjne; minęły co najmniej trzy miesiące od wstrzyknięcia kortykosteroidu, osocza bogatopłytkowego lub toksyny botulinowej
  3. Wyklucz następujące osoby: kobiety w ciąży, pacjenci z chorobą kręgosłupa szyjnego w wywiadzie, zapaleniem stawów łokciowych, chorobą reumatologiczną, operacją łokcia i zespołem uwięźnięcia nerwu; pacjenci odmawiający oddania tkanki.
  4. Technika chirurgiczna
    UWAGA: Zobacz Rysunek 124.
    1. Po znieczuleniu ogólnym izofluranem i intubacji dotchawiczej połóż rękę na stole i załóż opaskę uciskową. Następnie nałóż środek betadyny na całe ramię i obłóż aseptycznym prześcieradłem chirurgicznym.
    2. Odsłoć boczny łokieć przez 3–5 cm nacięcie za pomocą ostrza skalpela chirurgicznego nr 15 tuż przednio-przyśrodkowo do nadkłykcia bocznego i proksymalnie do poziomu stawu.
    3. Wizualnie zidentyfikuj interfejs prostownika nadgarstka promieniowego długiego (ECRL) i rozcięgna prostownika i wykonaj nacięcie rozcięgna o głębokości 2–3 mm między ECRL a rozcięgno prostownika za pomocą chirurgicznego ostrza skalpela nr 15 na zidentyfikowanym interfejsie.
    4. Wyodrębnij ECRL z przodu, co spowoduje, że patologiczny początek prostownika nadgarstka promieniowego długiego końca (ECRB) poniżej będzie bezpośrednio widoczny.
    5. Wizualnie zidentyfikuj patologiczną tkankę zwyrodnieniową po jej charakterystycznym matowym, szarawym kolorze i zwykle obrzękniętej i kruchej tkance.
    6. Po identyfikacji należy ostrożnie wyciąć całą zwyrodnieniową tkankę za pomocą skalpela chirurgicznego nr 15 i miniostrzy.
    7. Natychmiast zanurzyć wyciętą tkankę (około 1 cm3) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ostrożnie usunąć całą otaczającą tkankę z wyjątkiem tkanki ścięgna w około 10 ml PBS tak szybko, jak to możliwe.
    8. W przypadku egzostozy kostnej na nadkłykciu bocznym usuń egzostozę za pomocą rongeur i wygładź ją tarkiem. Wykonaj wiele otworów (średnica 1,6 mm, około 6–8 otworów) w kłykciu przednio-bocznym, aby zwiększyć zaopatrzenie naczyń krwionośnych. Jest to opcjonalne.
    9. Zamknij ranę warstwa po warstwie za pomocą niewchłanialnego materiału szwowego.
  5. Zdrowy tenocyt kontrolny
    1. Uzyskaj zdrowe tenocyty z pozostałego ścięgna ścięgna auto-podkolanowego lub ścięgna auto-rzepki podczas rekonstrukcji więzadła krzyżowego przedniego i użyj go jako kontroli w następującym eksperymencie25.
      UWAGA: Liczba próbek użytych w tym badaniu wynosiła trzy w każdej grupie.

2. Histologia

  1. Przechowuj około połowy pobranej tkanki w neutralnej, buforowanej 10% formalinie w chemicznym dygestorium lub jego odpowiedniku.
  2. Zanurz tkankę w bloku parafinowym (4–5 ml) i podziel ją na odcinki 4–5 μm koronalnie.
  3. Wybarwienie skrawków ścięgna kontrolnego i zwyrodnieniowego barwnikiem Hematoxylin i Eozyny (H&E) oraz niebieskim barwnikiem Alcian o pH 2,5. Barwienie H&E należy wykonać w automatycznej odplamiaczu w następujący sposób.
    1. Odparafinować za pomocą ksylenu (odpowiednio 3 razy, 5 minut).
    2. Hydrat z klasyfikowanych alkoholi do wody (100% alkoholu, 4 min; 100% alkoholu, 3 min; 95% alkoholu, 2 min; 70% alkoholu, 1 min; woda, 2 min).
    3. Plamić w Hematoxylin przez 5 min. Dobrze myć w wodzie przez 2 min.
    4. Różnicować w 1% kwaśnym alkoholu (1% HCl w 70% alkoholu) przez 3 s. Dobrze myć w wodzie przez 3 min.
    5. Zneutralizuj HCl, zanurzając go w 0,5% amoniaku na 10 s, a następnie myjąc wodą przez 3 minuty.
    6. Bejcować w Eosion przez 5 min.
    7. Odwodnić za pomocą alkoholi (80% alkoholu, 30 s; 95% alkoholu, 1 min; 100% alkoholu 1 min, 100% alkoholu 2 min).
    8. Klarować w ksylenie (3 razy, odpowiednio 2 min, 2 min i 3 min).
    9. Montaż za pomocą prowadnicy pokrywy.
  4. Wykonaj immunohistochemię (IHC) przy użyciu zestawu do wykrywania polimeru wiązania zgodnie z instrukcjami producenta z niewielkimi modyfikacjami.
    1. Po odparafinowaniu za pomocą ksylenu należy przeprowadzić procedurę pobierania antygenu za pomocą roztworu do odzyskiwania epitopów Bonda przez 30 minut w temperaturze 100 °C. Roztwór do odzyskiwania epitopów Bond zawiera bufor na bazie cytrynianu i środek powierzchniowo czynny (1 l, pH 5,9–6,1).
    2. Ugasić endogenne peroksydazy przez inkubację tkanki z nadtlenkiem wodoru przez 5 minut.
    3. Inkubować skrawki przez 15 minut w temperaturze otoczenia (21–22 °C) z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko czynnikowi wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) (1:200), tenomodulinie (1:200) lub irokezowi (1:200).
    4. Wykonaj wtórne znakowanie przeciwciał za pomocą bezbiotynowego polimerowego systemu sprzęgającego przeciwciała peroksydazy chrzanowej i łącznika.
      1. Użyj wtórnej króliczej anty mysiej IgG w 10% (v/v) surowicy zwierzęcej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej trisem/0,09% roztworze 2-metylo-4-izotiazolino-3-onu w celu zlokalizowania przeciwciał myszy.
      2. Użyj polimerowego anty-królika Poly-HRP-IgG (<25 μg/ml) zawierającego 10% (v/v) surowicy zwierzęcej w soli fizjologicznej buforowanej Tris/0,09% w celu zlokalizowania przeciwciał króliczych.
      3. Użyj hydratu tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzydyny w roztworze stabilizatora, aby uwidocznić kompleks za pomocą brązowego osadu.
      4. Przeciwbarwienie za pomocą <0,1% hematoksyliny (niebieskiej), aby uwidocznić jądra komórkowe.
  5. Obserwuj szkiełka zabarwione barwnikami H&E, niebieskimi barwnikami Alcian i IHC dla VEGF, tenomoduliny i irokeza pod mikroskopem świetlnym i uzyskaj reprezentatywne obrazy mikroskopowe każdego szkiełka w jednym polu o dużej mocy (400X).

3. Kultura tenocytów

  1. Przygotowanie tkanek
    1. Przygotuj próbkę ścięgna, dokładnie usuwając całą otaczającą tkankę za pomocą mikronożyczek i kleszczy.
    2. Umyj PBS i zmiel na małe kawałki (około 1mm3 lub mniej).
    3. Trawić tkankę przez 1 godzinę w 30 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionego 30 mg/ml kolagenazy II w temperaturze 37 °C.
    4. Przepuścić komórki przez sitko o średnicy 100 μm.
    5. Dezaktywuj kolagenazę II, dodając 1 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    6. Wirować przy 196 x g przez 5 min.
  2. Hodowla komórkowa
    1. Wysiew 3 x 105 komórek do naczynia o średnicy 100 mm i kultura z DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% roztworem antybiotykowo-przeciwgrzybiczym w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 przez 1 tydzień.
    2. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co trzy dni, aż do wystąpienia 80% konfluencji. Hoduj zarówno zdrowe próbki komórek kontrolnych, jak i zwyrodnieniowych do przejścia czwartego i użyj do eksperymentu.

4. Immunocytochemia (ICC)

  1. Przenieś 200 μl hodowanej komórki (2 x 105 komórek) do ośmiu dołków szkiełka komorowego i hoduj komórki do zbiegu z dodatkiem świeżej pożywki przez 1 dzień.
  2. Umyj komórki PBS i utrwal 500 μl 4% formaldehydu na studzienkę.
  3. Inkubować szkiełka z 0,5% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w celu przepuszczalności błon.
  4. Blok w PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej i 0,05% TWEEN-20 odpowiednio dla irokeza i tenomoduliny.
  5. Inkubować w ciemności z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-mohawk (rozcieńczenie 1:100) i kozim przeciwciałem anty-tenomodulinowym (rozcieńczenie 1:100) w temperaturze 4 °C przez noc.
  6. Inkubować przeciwciała drugorzędowe (Alexa 555-anti goat (1:200) dla tenomoduliny; Alexa 488-anti mouse (1:200) dla irokeza) w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Zamocować za pomocą 0,5 μl fluorescencyjnego medium montażowego.
  8. Analiza za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (400X).

5. Test proliferacji

  1. Zmierz żywotność komórek za pomocą rozpuszczalnego w wodzie tetrazolu (WST)-1.
    1. Wysiewaj zarówno zdrowe, jak i zwyrodniałe komórki do 96 dołków o gęstości 2 x 103 komórki na dołek przez 24, 72 i 120 godzin.
    2. Po inkubacji dodać 10 μl 10% roztworu WST-1 do każdej studzienki.
    3. Inkubować płytki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
    4. Zmierz gęstość optyczną przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Wykonaj odczyty co najmniej trzy razy we wszystkich punktach czasowych dla każdej próbki.
  2. Zmierz ilość DNA komórkowego za pomocą testu BrdU.
    1. Wysiewaj zarówno zdrowe, jak i zwyrodniałe komórki do 96 dołków o gęstości 2 x 103 komórek na dołek przez 24, 72 i 120 godzin.
    2. Po inkubacji dodać 10 μl 10% roztworu BrdU do każdej studzienki.
    3. Inkubować płytki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
    4. Dodać 100 μl/basenik roztworu utrwalającego/denaturującego (60–70% etanolu, 0,1–0,5% wodorotlenku sodu) i utrzymywać płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    5. Dodać 100 μl/dobrze przygotowany 1x roztwór przeciwciała wykrywającego i utrzymywać płytkę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    6. Usuń roztwór i umyj płytkę trzy razy 1x buforem do mycia.
    7. Dodać 100 μl/dobrze przygotowany 1x sprzężony z HRP roztwór przeciwciał drugorzędowych i utrzymywać płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    8. Usuń roztwór i umyj płytkę trzy razy za pomocą 1x buforu do mycia.
    9. Dodać 100 μl 50% substratu TMB.
    10. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Dodać 100 μl roztworu STOP.
    12. Zmierzyć gęstości optyczne przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
      UWAGA: Wykonaj odczyty co najmniej trzy razy we wszystkich punktach czasowych dla każdej próbki.

6. Analiza statystyczna

  1. Zbieraj i analizuj dane za pomocą SPSS.
  2. Przedstaw dane za pomocą średniej ± standardowego błędu średniej.
  3. Użyj testu U Manna-Whitneya.
  4. Rozważ różnice istotne statystycznie, gdy wartość p jest mniejsza niż 0,05 (p <0,05).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analizy histologiczne wykazały, że pobrana tkanka z miejsca zapalenia nadkazykciowego miała cechy ścięgna z tendinopatią. Przekrój H&E zdegenerowanego ścięgna z tendinopatią ujawnił zdezorganizowane pęczki kolagenowe z utratą polarności oraz brak cienkich, prostych, gęsto upakowanych struktur włókien równoległych. W próbkach powszechne były cechy histologiczne sugerujące degenerację, takie jak zwiększona komórkowość i powiększone jądra pozbawione typowego wrzecionowatego kształtu. Pon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wiele wcześniejszych badań donosiło, jak tworzyć przewlekłe tendinopatyczne modele zwierzęce przy użyciu różnych procedur, takich jak wstrzyknięcie kolagenazy lub kartogeniny, bieganie na bieżni i inne26,27. Chociaż liczne badania wykazały obiecujące efekty terapeutyczne oparte na tych modelach zwierzęcych, eksperymenty z wykorzystaniem ludzkiego tenocytu zwyrodnieniowego byłyby kluczowe w dziedzinie tendinopatii w celu odtworzenia skuteczności leczenia. W tym ar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant z Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Zdrowia za pośrednictwem Koreańskiego Instytutu Rozwoju Przemysłu Medycznego (KHIDI), który został sfinansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej Republiki Korei (numer grantu: HI16C1559).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SkalpelKisanbioKS-Q0306-15No. 15
Mini-ostrzeBeaver374769
Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)Gibco11995065
PBSGibco14190250
płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco16000044
50 mM kwas askorbinowy-2-fosforanSigma-AldrichA5960
Antybiotyk-Antybiotyk RoztwórGibco15240062
4% formaldehydBio-roztwórBP031
Triton X-100 Sigma-AldrichX100-100ml
BSARdtechC0082
TWEEN 20Sigma-AldrichP9416-100ml
MKX (C-5)Santa Cruz BiotechnologySC-515878
Tenomodulin (N-14)Santa Cruz BiotechnologySC-49325
Fluorescencyjny nośnik montażowyDAKOS3023
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Thermo Fisher ScientificD1306
WST-1Dojindo Molecular TechnologiesCK04
Zestaw do oznaczania proliferacji komórek BrdUTechnologia sygnalizacji komórkowej#6813
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596018
Zestaw do syntezy cDNA iScript Bio-Rad170-8891
TaqMan Mistrzowska MieszankaEkspresji Genów Applied Biosystems4369016
GAPDHThermo Fisher ScientificHs02786624_g1
COL3A1Thermo Fisher ScientificHs00943809_m1
ACTA2Thermo Fisher ScientificHs00426835_g1
TAC1Thermo Fisher Scientific
TACR1Thermo Fisher ScientificHs00185530_m1
PTGS2Thermo Fisher ScientificHs00153133_m1
ACTBThermo Fisher ScientificHs99999903_m1
Sitka komórkowe (100 &mikro; m) Naczynie hodowlane Corning352360
100 mmThermo Fisher Scientific8188207
8-dołkowy szkiełko komoroweThermo Fisher Scientific154534
96 Well Clear Płaskie dno z polistyrenu poddanego obróbce TCMikroskop Corning3596
Nikon Eclipse 50i Nikon
VERSA max molekularne
CFX96 System wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad
Roztwór formaliny, neutralnie buforowany, 10%Sigma-AldrichHT501128
parafinyLeica Biosystems3801340
EtanolJUNSEI CHEMICAL90303-2185
HematoksylinaDAKOCS70030-2
EozynaDAKOCS70130-2
Błękit alckiDAKOAR16011-2
Kwas cytrynowySigma-Aldrich251275
KsylenJUNSEI CHEMICAL25165-0430
Peroksydazy endogenne DAKOS200380-2
Balsam kanadyjskiJUNSEI CHEMICAL23255-1210
Ostrze mikrotomoweFEATHERA35
Szkło ślizgoweSUPERIOR1000612
Szkło nakrywkoweMarienfeld-Superior101050
VEGFSanta cruz biotechnologysc-7269
SPSS SoftwareIBMVer. 18.0
Wirówka wielofunkcyjnaLABOGENE1248R
Hs00243225_m1Czytnik mikropłytek Urządzenia

Bibliografia

  1. Ackermann, P. W., Renstrom, P. Tendinopathy in sport. Sports Health. 4 (3), 193-201 (2012).
  2. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinical Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).
  3. Lui, P. P., Chan, L. S., Fu, S. C., Chan, K. M. Expression of sensory neuropeptides in tendon is associated with failed healing and activity-related tendon pain in collagenase-induced tendon injury. American Journal of Sports Medicine. 38 (4), 757-764 (2010).
  4. Han, S. H., et al. Effects of corticosteroid on the expressions of neuropeptide and cytokine mRNA and on tenocyte viability in lateral epicondylitis. Journal of Inflammation (London). 9 (1), 40(2012).
  5. Uchio, Y., et al. Expression of neuropeptides and cytokines at the extensor carpi radialis brevis muscle origin. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 11 (6), 570-575 (2002).
  6. Lieber, R. L., Loren, G. J., Friden, J. In vivo measurement of human wrist extensor muscle sarcomere length changes. Journal of Neurophysiology. 71 (3), 874-881 (1994).
  7. Regan, W., Wold, L. E., Coonrad, R., Morrey, B. F. Microscopic histopathology of chronic refractory lateral epicondylitis. American Journal of Sports Medicine. 20 (6), 746-749 (1992).
  8. Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery American volume. 87 (1), 187-202 (2005).
  9. Lui, P. P. Stem cell technology for tendon regeneration: current status, challenges, and future research directions. Stem Cells Cloning. 8, 163-174 (2015).
  10. Dahlgren, L. A., van der Meulen, M. C., Bertram, J. E., Starrak, G. S., Nixon, A. J. Insulin-like growth factor-I improves cellular and molecular aspects of healing in a collagenase-induced model of flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 20 (5), 910-919 (2002).
  11. Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopedic Research. 27 (10), 1392-1398 (2009).
  12. Durgam, S. S., Stewart, A. A., Sivaguru, M., Wagoner Johnson, A. J., Stewart, M. C. Tendon-derived progenitor cells improve healing of collagenase-induced flexor tendinitis. Journal of Orthopedic Research. 34 (12), 2162-2171 (2016).
  13. Titan, A., Andarawis-Puri, N. Tendinopathy: Investigating the Intersection of Clinical and Animal Research to Identify Progress and Hurdles in the Field. Journal of Bone and Joint Surgery Review. 4 (10), (2016).
  14. Dirks, R. C., Warden, S. J. Models for the study of tendinopathy. Journal of Musculoskeletal Neuronal Interaction. 11 (2), 141-149 (2011).
  15. de Mos, M., et al. Can platelet-rich plasma enhance tendon repair? A cell culture study. American Journal of Sports Medicine. 36 (6), 1171-1178 (2008).
  16. Scherb, M. B., Han, S. H., Courneya, J. P., Guyton, G. P., Schon, L. C. Effect of bupivacaine on cultured tenocytes. Orthopedics. 32 (1), 26(2009).
  17. Wong, M. W., et al. Effect of dexamethasone on cultured human tenocytes and its reversibility by platelet-derived growth factor. Journal of Bone and Joint Surgery American Volume. 85 (10), 1914-1920 (2003).
  18. Tempfer, H., et al. Effects of crystalline glucocorticoid triamcinolone acetonide on cultered human supraspinatus tendon cells. Acta Orthopaedics. 80 (3), 357-362 (2009).
  19. Menon, A., et al. New insights in extracellular matrix remodeling and collagen turnover related pathways in cultured human tenocytes after ciprofloxacin administration. Muscles Ligaments Tendons J. 3 (3), 122-131 (2013).
  20. Backman, L. J., Fong, G., Andersson, G., Scott, A., Danielson, P. Substance P is a mechanoresponsive, autocrine regulator of human tenocyte proliferation. PLoS One. 6 (11), 27209(2011).
  21. Backman, L. J., Eriksson, D. E., Danielson, P. Substance P reduces TNF-alpha-induced apoptosis in human tenocytes through NK-1 receptor stimulation. Britich Journal of Sports Medicine. 48 (19), 1414-1420 (2014).
  22. Rolf, C. G., Fu, B. S., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRbeta causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology (Oxford). 40 (3), 256-261 (2001).
  23. Hoppe, S., et al. Tenocytes of chronic rotator cuff tendon tears can be stimulated by platelet-released growth factors. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22 (3), 340-349 (2013).
  24. Schipper, O. N., Dunn, J. H., Ochiai, D. H., Donovan, J. S., Nirschl, R. P. Nirschl surgical technique for concomitant lateral and medial elbow tendinosis: a retrospective review of 53 elbows with a mean follow-up of 11.7 years. American Journal of Sports Medicine. 39 (5), 972-976 (2011).
  25. Cook, J. L., Feller, J. A., Bonar, S. F., Khan, K. M. Abnormal tenocyte morphology is more prevalent than collagen disruption in asymptomatic athletes' patellar tendons. Journal of Orthopedic Research. 22 (2), 334-338 (2004).
  26. Yuan, T., et al. Creating an Animal Model of Tendinopathy by Inducing Chondrogenic Differentiation with Kartogenin. PLoS One. 11 (2), 0148557(2016).
  27. Lui, P. P., Maffulli, N., Rolf, C., Smith, R. K. What are the validated animal models for tendinopathy. Scandinavian Journal of Medical Scientific Sports. 21 (1), 3-17 (2011).
  28. Wilhelm, A. Lateral epicondylitis review and current concepts. Journal of Hand Surgery American Volume. 34 (7), author reply 1359-1360 1359-1360 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tkanka ci gnistatrawienie kolagenazhodowla kom rkowaimmunocytochemiabarwienie H Etest proliferacjiqRT PCRbia ko Mohawkbia ko tenomodulina
Protokół pozyskiwania zwyrodnieniowego tenocytu od ludzi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.