Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

Podsumowanie

Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.

Streszczenie

W wielu kontekstach biologicznych, komórki zwierzęce muszą fizycznie oddziaływać ze swoim otoczeniem, rozwijając siły mechaniczne. Wśród nich dobrze scharakteryzowano siły trakcyjne, ale brakuje technik pozwalających na pomiar sił wypukłości wywieranych przez komórki prostopadle do ich podłoża. Zaprojektowaliśmy eksperymentalny układ do pomiaru sił wypukłości wywieranych przez przylegające komórki na ich podłoże. Komórki posiane na podatnym arkuszu Formvar deformują ten substrat, a uzyskana topografia jest mapowana za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) w skali nanometrowej. Wartości sił są następnie pobierane z analizy profilu odkształcenia w oparciu o geometrię wystających struktur komórkowych. W związku z tym siły wywierane przez poszczególne wystające jednostki żywej komórki można mierzyć w czasie. Technika ta umożliwi badanie generowania siły i jej regulacji w wielu procesach komórkowych związanych z wypukłością. Tutaj opisujemy jego zastosowanie do pomiaru sił wystających generowanych przez podosomy utworzone przez ludzkie makrofagi.

Wprowadzenie

Komórki zwierzęce oddziałują fizycznie z matrycą i innymi komórkami, które tworzą ich środowisko¹. Jest to konieczne, aby mogły migrować, internalizować ciała, zdobywać informacje zewnętrzne lub różnicować się. W takich procesach komórka musi generować siły mechaniczne i, jak wykazały liczne badania z ostatnich lat, zdolność komórki do generowania sił i sondowania otoczenia wpływa na jej zachowanie biologiczne, kierując np. proliferacją lub różnicowaniem^2,3. Z kolei pomiar sił komórkowych jest główną pomocą w badaniu regulacji generowania siły i zrozumieniu jej wpływu na zachowanie komórek i los tkanek ^4,5.

Ostatnie lata były świadkami rozwoju licznych technik pomiaru sił, jakie komórka może wywierać na swoje otoczenie⁶. Większość z nich odegrała zasadniczą rolę w ujawnieniu sił trakcyjnych, jakie wywierają komórki, gdy ciągną ruchome sondy lub odkształcalne podłoże. Jednak siły mechaniczne zaangażowane w wypukłość w środowisko zewnątrzkomórkowe cierpią z powodu braku technik pomiarowych i do tej pory nie są dobrze scharakteryzowane.

Aby przezwyciężyć to ograniczenie, przedstawiamy metodę pomiaru sił wywieranych prostopadle na podłoże. Polega na posiewaniu żywych komórek na cienkim elastycznym arkuszu, który może odkształcać się w kierunku prostopadłym, co umożliwia pomiar deformacji podłoża przez komórki i wydedukowanie zaangażowanych sił. Topografia podłoża jest mierzona z rozdzielczością w nanoskali za pomocą mikroskopii sił atomowych, a ocena sił wynikających z odkształcenia opiera się na wiedzy na temat geometrii wystających struktur komórkowych^7,8,9.

Tutaj opisujemy konfigurację i jej zastosowanie do pomiaru sił generowanych przez podosomy, wystające struktury adhezyjne tworzone przez makrofagi do ich mezenchymalnej migracji w środowiskach trójwymiarowych^{10,11,12,13,14,15,16,17}. Wierzymy, że ta technika przyczyni się do lepszego zrozumienia generowania siły i jej regulacji w wielu procesach komórkowych związanych z protruzją.

Protokół

1. Przygotowanie siatek pokrytych formvarem

1. Oczyść siatki mikroskopii elektronowej czystym acetonem i wysusz je na bibule filtracyjnej. Następnie wyczyść szkiełko mikroskopowe czystym etanolem, przetrzyj papierem do soczewek i usuń kurz za pomocą gruszki.
2. Umieścić szkiełko szklane oczyszczone etanolem pionowo w lejku urządzenia do odlewania folii zawierającego roztwór Formvaru w dolnej części. Przykryj górną część lejka.
3. Przepompować 100 ml roztworu Formvaru (0,5% w dichlorku etylenu) za pomocą bańki rozpylacza, aż poziom osiągnie dwie trzecie szkiełka.
4. Trzymaj szkiełko w roztworze przez 1 minutę.
5. Otwórz zawór urządzenia, aby spuścić roztwór Formvar w stałym strumieniu. Natężenie przepływu od 10 do 15 ml/s pozwoli uzyskać warstwę Formvar o długości fali 30-80 nm. Grubość warstwy zależy od stężenia roztworu Formvaru i szybkości drenażu.
   UWAGA: Szybkość drenażu można kontrolować, odpowietrzając ciśnienie przez zawór wylotowy powietrza, powoli otwierając zawór. Im szybszy drenaż, tym grubsza folia. W praktyce, ponieważ trudno jest przewidzieć grubość folii na podstawie natężenia przepływu Formvar, przygotowujemy kilka partii folii Formvar i kontrolujemy ich grubość za pomocą AFM (patrz Krok 2).
6. Wyjmij szkiełko z komory i delikatnie wysusz je na bibule filtracyjnej, aby usunąć płynny Formvar.
7. Wytnij prostokąt o wymiarach 20 mm x 50 mm z folii Formvar za pomocą żyletki.
8. Napełnij zlewkę czystą wodą destylowaną i powoli zanurz zjeżdżalnię pionowo w wodzie, aby odpłynęła z folii: folia powinna unosić się na powierzchni wody.
9. Umieść suche kratki oczyszczone acetonem na folii, błyszczącą stroną do góry.
10. Umieść okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (Ø 12 mm) na kilku kratkach. Szkiełko nakrywkowe posłuży do pomiaru grubości folii (patrz krok 2).
11. Przykryj szkiełko mikroskopowe białą naklejką o zmienionym rozmiarze, aby pasowało do niej. Zanurz szkiełko pionowo na granicy pływającej folii Formvar, aż cała folia przylgnie do szkiełka. Usuń nadmiar wody ze szkiełka za pomocą bibuły filtracyjnej i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.

2. Pomiar grubości folii

1. Przetnij Formvar wokół szkiełka nakrywkowego za pomocą pęsety, aby odłączyć go od szkiełka.
2. Zaznacz długopisem położenie siatki pod szkiełkiem nakrywkowym.
3. Przeciąć Formvar wokół zaznaczonej siatki, aby odłączyć go od szkiełka nakrywkowego. W pozostałym arkuszu Formvar znajdzie się zatem otwór, który pozwoli na zmierzenie grubości folii. Przykryj szkiełko nakrywkowe PBS i umieść je na szklanym szkiełku mikroskopowym.
4. Zamontuj wspornik z azotku krzemu na pustaku szklanym AFM, upewniając się, że złoty pasek nie jest zakryty przez końcówkę sprężyny.
   UWAGA: Czułość i stała sprężystości wspornika powinny być wcześniej skalibrowane w PBS.
5. Zamontuj szklany blok na module AFM, a następnie umieść moduł na mikroskopie.
6. Umieścić szkiełko nakrywkowe pokryte Formvarem w komorze obserwacyjnej i przykryć je 500 μl PBS.
7. Zeskanuj granicę otworu w arkuszu Formvar za pomocą AFM w trybie kontaktowym i nastawą siły 0.5 nN.
8. Użyj powierzchni szkiełka nakrywkowego jako odniesienia dla pomiarów wysokości i oceń grubość Formvar jako wysokość przekroju poprzecznego (wykonaj co najmniej 10 pomiarów na partię Formvar).

3. Umieszczanie komórek na siatkach

1. Pod sterylnym kapturem umieść pasek (12 mm x 3 mm) dwustronnej taśmy klejącej na szkiełku nakrywkowym.
2. Wytnij pęsetą siatkę pokrytą Formvarem i połóż ją do góry nogami na pasku kleju (do taśmy wystarczy przymocować tylko krawędź siatki). Folia Formvar musi być zwrócona w stronę szkiełka nakrywkowego.
3. Umieść to urządzenie w kulturze dobrze.
4. Umieść 10 μl kropli RPMI bez FCS zawierającej 10⁴ makrofagów różniących się od ludzkich monocytów¹⁶.
   UWAGA: Uważaj, aby nie dotykać siatki końcówką pipety, aby zapobiec uszkodzeniu powłoki Formvar.
5. Inkubować przez 30 minut (37 °C, 5% CO₂ ), aby komórki przylegały.
6. Napełnij studzienkę 2 ml RPMI zawierającego 10% FCS.
7. Inkubować urządzenie przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 ,} aby komórki przyległy przed obserwacją AFM.

4. Pomiary topograficzne deformacji wywołanych przez podosomy

1. Przyklej dwa paski dwustronnej taśmy klejącej na szklanym dnie szalki Petriego.
   UWAGA: Odległość między dwoma paskami powinna być mniejsza niż średnica siatki.
2. Ostrożnie odłącz siatkę pokrytą makrofagami od taśmy klejącej.
3. Odwróć siatkę do góry nogami, aby komórki były skierowane w stronę szkła i przyklej siatkę między dwoma paskami samoprzylepnymi.
4. Przymocuj siatkę za pomocą dwóch nowych pasków dwustronnego kleju: siatka zostanie w ten sposób umieszczona między dwoma paskami kleju, pozostawiając środkową część siatki dostępną dla końcówki AFM.
   UWAGA: Upewnij się, że siatka jest dobrze zamocowana i nie jest skręcona; w przeciwnym razie wspornik AFM może nie być w stanie zbliżyć się do powierzchni Formvar.
5. Wypełnić szalkę Petriego 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej o temperaturze 37 °C (RPMI z 10% FCS) uzupełnionej 10 mM HEPES (pH 7,4).
6. Umieścić naczynie hodowlane na podgrzewaczu do naczyń o temperaturze 37 °C.
7. Zamontuj podgrzewacz do naczyń na AFM stage.
8. Pozwól, aby system ustabilizował się w temperaturze 37 °C.
9. W trybie kontaktowym z siłą 0,5 nN wykonaj pierwszy globalny obraz, aby zlokalizować podosomy, a następnie zeskanuj topografię Formvar przy 3 Hz za pomocą piksela o długości około 20 nm.
   UWAGA: Unikaj skanowania w pobliżu krawędzi siatki.

Wyniki

Powyższy protokół opisuje sposób przygotowania układu eksperymentalnego do ilościowego oznaczenia sił protruzyjnych wywieranych przez podosomy makrofagów na podłożu z Formvaru. Jest to realizowane przy użyciu AFM i zostało zilustrowane na Rysunku 1.

Podczas analizy obrazu topograficznego wypukłości pod podosomami przy użyciu oprogramowania do przetwarzania danych JPK, z każdej linii skanowania należ...

Dyskusja

Właściwości materiału

Wybór materiału na membranę odkształcalną, w naszym przypadku Formvar, musi spełniać kilka wymagań. Materiał musi być przezroczysty dla światła widzialnego i wykazywać ograniczoną autofluorescencję, aby umożliwić obserwacje w jasnym polu i mikroskopii fluorescencyjnej. Chropowatość cienkiej warstwy musi być znacznie mniejsza niż 10 nm, aby uniknąć jakiegokolwiek wpływu topograficznego na adhezję komórek i umożliwić wyraźną obserwację wypukłości wywołanych...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Siatki niklowe o siatkach 200	Mikroskopia elektronowa Nauki	G200-Ni
Bibuła filtracyjna	Sigma-Aldrich	1001-055
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	10235612
Białe naklejki 26 x 70 mm	Avery	DP033-100
Urządzenie do odlewania folii z zaworem na wylocie	Mikroskopia elektronowa Sciences	71305-01
Razorblades	Mikroskopia elektronowa Sciences	72000
Etanol	VWR	1.08543.0250
Aceton	VWR	20066.321
Formvar 0,5% roztwór w dichlorku etylenu	Mikroskopia elektronowa Sciences	15820
Szkiełka nakrywkowe 12 mm	VWR	631-0666
Mikroskop odwrócony	Carl Zeiss	Axiovert 200
	JPK Instruments	NanoWizard III
Uchwyt na próbkę z kontrolowaną temperaturą	JPK Instruments	BioCell
Wspornik z azotku krzemu o nominalnej stałej sprężystości 0,01 N/m	Veeco Instruments	MLCT-AUHW
PBS	Gibco	14190-094
Taśma dwustronnie klejąca	APLI AGIPA	118100
RPMI 1640	Gibco	31870-025
FCS	Sigma-Aldrich	F7524
HEPES	Sigma-Aldrich	H0887
35 mm szalki Petriego ze szklanym dnem	WPI	FD35-100

Mikroskop sił atomowych