Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W wielu kontekstach biologicznych, komórki zwierzęce muszą fizycznie oddziaływać ze swoim otoczeniem, rozwijając siły mechaniczne. Wśród nich dobrze scharakteryzowano siły trakcyjne, ale brakuje technik pozwalających na pomiar sił wypukłości wywieranych przez komórki prostopadle do ich podłoża. Zaprojektowaliśmy eksperymentalny układ do pomiaru sił wypukłości wywieranych przez przylegające komórki na ich podłoże. Komórki posiane na podatnym arkuszu Formvar deformują ten substrat, a uzyskana topografia jest mapowana za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) w skali nanometrowej. Wartości sił są następnie pobierane z analizy profilu odkształcenia w oparciu o geometrię wystających struktur komórkowych. W związku z tym siły wywierane przez poszczególne wystające jednostki żywej komórki można mierzyć w czasie. Technika ta umożliwi badanie generowania siły i jej regulacji w wielu procesach komórkowych związanych z wypukłością. Tutaj opisujemy jego zastosowanie do pomiaru sił wystających generowanych przez podosomy utworzone przez ludzkie makrofagi.
Wprowadzenie
Komórki zwierzęce oddziałują fizycznie z matrycą i innymi komórkami, które tworzą ich środowisko1. Jest to konieczne, aby mogły migrować, internalizować ciała, zdobywać informacje zewnętrzne lub różnicować się. W takich procesach komórka musi generować siły mechaniczne i, jak wykazały liczne badania z ostatnich lat, zdolność komórki do generowania sił i sondowania otoczenia wpływa na jej zachowanie biologiczne, kierując np. proliferacją lub różnicowaniem2,3. Z kolei pomiar sił komórkowych jest główną pomocą w badaniu regulacji generowania siły i zrozumieniu jej wpływu na zachowanie komó....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie siatek pokrytych formvarem
- Oczyść siatki mikroskopii elektronowej czystym acetonem i wysusz je na bibule filtracyjnej. Następnie wyczyść szkiełko mikroskopowe czystym etanolem, przetrzyj papierem do soczewek i usuń kurz za pomocą gruszki.
- Umieścić szkiełko szklane oczyszczone etanolem pionowo w lejku urządzenia do odlewania folii zawierającego roztwór Formvaru w dolnej części. Przykryj górną część lejka.
- Przepompować 100 ml roztworu Formvaru (0,5% w dichlorku etylenu) za pomocą bańki rozpylacza, aż poziom osiągnie dwie trzecie szkiełka.
- Trzymaj szkiełko w roztworze przez 1 minutę.
- Otwórz zawór urządz....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Powyższy protokół opisuje sposób przygotowania układu eksperymentalnego do ilościowego oznaczenia sił protruzyjnych wywieranych przez podosomy makrofagów na podłożu z Formvaru. Jest to realizowane przy użyciu AFM i zostało zilustrowane na Rysunku 1.
Podczas analizy obrazu topograficznego wypukłości pod podosomami przy użyciu oprogramowania do przetwarzania danych JPK, z każdej linii skanowania należ.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Właściwości materiału
Wybór materiału na membranę odkształcalną, w naszym przypadku Formvar, musi spełniać kilka wymagań. Materiał musi być przezroczysty dla światła widzialnego i wykazywać ograniczoną autofluorescencję, aby umożliwić obserwacje w jasnym polu i mikroskopii fluorescencyjnej. Chropowatość cienkiej warstwy musi być znacznie mniejsza niż 10 nm, aby uniknąć jakiegokolwiek wpływu topograficznego na adhezję komórek i umożliwić wyraźną obserwację wypukłości wywołanych.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy są wdzięczni Annie Labernadie, Guillaume'owi Charrière'owi i Patrickowi Delobelle za ich początkowy wkład w tę pracę oraz Matthieu Sanchezowi i Françoise Viali za pomoc w filmowaniu i edycji. Prace te były wspierane przez l'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan Cancer, Fondation Toulouse Cancer oraz Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Siatki niklowe o siatkach 200 | Mikroskopia elektronowa Nauki | G200-Ni | |
| Bibuła filtracyjna | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 10235612 | |
| Białe naklejki 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Urządzenie do odlewania folii z zaworem na wylocie | Mikroskopia elektronowa Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Mikroskopia elektronowa Sciences | 72000 | |
| Etanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Aceton | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0,5% roztwór w dichlorku etylenu | Mikroskopia elektronowa Sciences | 15820 | |
| Szkiełka nakrywkowe 12 mm | VWR | 631-0666 | |
| Mikroskop odwrócony | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| JPK Instruments | NanoWizard III | ||
| Uchwyt na próbkę z kontrolowaną temperaturą | JPK Instruments | BioCell | |
| Wspornik z azotku krzemu o nominalnej stałej sprężystości 0,01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Taśma dwustronnie klejąca | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm szalki Petriego ze szklanym dnem | WPI | FD35-100 |
Bibliografia
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Se....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
