Method Article

Mikroskopia sił wypukłości: metoda ilościowego określania sił wytwarzanych przez wypukłości komórek

DOI:

10.3791/57636

⸱

June 16th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale, IPBS, Université de Toulouse, CNRS, UPS, 2METi, 3CNRS, LAAS, 4Univ de Toulouse, INSA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj szczegółowo opisujemy techniki eksperymentalne używane do oceny sił wypukłości, które podosomy przykładają do odpowiedniej folii, od przygotowania filmu do automatycznej analizy obrazów topograficznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W wielu kontekstach biologicznych, komórki zwierzęce muszą fizycznie oddziaływać ze swoim otoczeniem, rozwijając siły mechaniczne. Wśród nich dobrze scharakteryzowano siły trakcyjne, ale brakuje technik pozwalających na pomiar sił wypukłości wywieranych przez komórki prostopadle do ich podłoża. Zaprojektowaliśmy eksperymentalny układ do pomiaru sił wypukłości wywieranych przez przylegające komórki na ich podłoże. Komórki posiane na podatnym arkuszu Formvar deformują ten substrat, a uzyskana topografia jest mapowana za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM) w skali nanometrowej. Wartości sił są następnie pobierane z analizy profilu odkształcenia w oparciu o geometrię wystających struktur komórkowych. W związku z tym siły wywierane przez poszczególne wystające jednostki żywej komórki można mierzyć w czasie. Technika ta umożliwi badanie generowania siły i jej regulacji w wielu procesach komórkowych związanych z wypukłością. Tutaj opisujemy jego zastosowanie do pomiaru sił wystających generowanych przez podosomy utworzone przez ludzkie makrofagi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki zwierzęce oddziałują fizycznie z matrycą i innymi komórkami, które tworzą ich środowisko1. Jest to konieczne, aby mogły migrować, internalizować ciała, zdobywać informacje zewnętrzne lub różnicować się. W takich procesach komórka musi generować siły mechaniczne i, jak wykazały liczne badania z ostatnich lat, zdolność komórki do generowania sił i sondowania otoczenia wpływa na jej zachowanie biologiczne, kierując np. proliferacją lub różnicowaniem2,3. Z kolei pomiar sił komórkowych jest główną pomocą w badaniu regulacji generowania siły i zrozumieniu jej wpływu na zachowanie komó....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie siatek pokrytych formvarem

  1. Oczyść siatki mikroskopii elektronowej czystym acetonem i wysusz je na bibule filtracyjnej. Następnie wyczyść szkiełko mikroskopowe czystym etanolem, przetrzyj papierem do soczewek i usuń kurz za pomocą gruszki.
  2. Umieścić szkiełko szklane oczyszczone etanolem pionowo w lejku urządzenia do odlewania folii zawierającego roztwór Formvaru w dolnej części. Przykryj górną część lejka.
  3. Przepompować 100 ml roztworu Formvaru (0,5% w dichlorku etylenu) za pomocą bańki rozpylacza, aż poziom osiągnie dwie trzecie szkiełka.
  4. Trzymaj szkiełko w roztworze przez 1 minutę.
  5. Otwórz zawór urządz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powyższy protokół opisuje, jak przygotować zestaw eksperymentalny do ilościowego określenia sił wypukłości wywieranych przez podosomy makrofagów na substracie Formvar. Osiąga się to za pomocą AFM i ilustruje to Rysunek 1.

Podczas analizy obrazu topograficznego wybrzuszeń pod podosoomami za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych JPK, dopasowanie wielomianu trzeciego stopnia powinno być odejmow.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Właściwości materiału

Wybór materiału na membranę odkształcalną, w naszym przypadku Formvar, musi spełniać kilka wymagań. Materiał musi być przezroczysty dla światła widzialnego i wykazywać ograniczoną autofluorescencję, aby umożliwić obserwacje w jasnym polu i mikroskopii fluorescencyjnej. Chropowatość cienkiej warstwy musi być znacznie mniejsza niż 10 nm, aby uniknąć jakiegokolwiek wpływu topograficznego na adhezję komórek i umożliwić wyraźną obserwację wypukłości wywołanych.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Annie Labernadie, Guillaume'owi Charrière'owi i Patrickowi Delobelle za ich początkowy wkład w tę pracę oraz Matthieu Sanchezowi i Françoise Viali za pomoc w filmowaniu i edycji. Prace te były wspierane przez l'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan Cancer, Fondation Toulouse Cancer oraz Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Siatki niklowe o siatkach 200Mikroskopia elektronowa NaukiG200-Ni
Bibuła filtracyjnaSigma-Aldrich1001-055
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific10235612
Białe naklejki 26 x 70 mmAveryDP033-100
Urządzenie do odlewania folii z zaworem na wylocieMikroskopia elektronowa Sciences71305-01
RazorbladesMikroskopia elektronowa Sciences72000
EtanolVWR1.08543.0250
AcetonVWR20066.321
Formvar 0,5% roztwór w dichlorku etylenuMikroskopia elektronowa Sciences15820
Szkiełka nakrywkowe 12 mmVWR631-0666
Mikroskop odwróconyCarl ZeissAxiovert 200
JPK InstrumentsNanoWizard III
Uchwyt na próbkę z kontrolowaną temperaturą JPK InstrumentsBioCell
Wspornik z azotku krzemu o nominalnej stałej sprężystości 0,01 N/mVeeco InstrumentsMLCT-AUHW
PBSGibco14190-094
Taśma dwustronnie klejącaAPLI AGIPA118100
RPMI 1640Gibco31870-025
FCSSigma-AldrichF7524
HEPES Sigma-AldrichH0887
35 mm szalki Petriego ze szklanym dnemWPIFD35-100
Mikroskop sił atomowych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  2. Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  3. Engler, A. J., Se....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protrusion Force MicroscopyAtomic Force MicroscopyFormvar FilmPodosome FormationHuman MacrophagesForce QuantificationCell ProtrusionsSubstrate DeformationMechanical ModelAFM Imaging

Related Articles