Artykuł metodologiczny

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

5.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57641

⸱

27 marca 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Streszczenie

Komórki trzustki pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) są obiecującym źródłem komórek dla medycyny regeneracyjnej i platformą do badania procesów rozwojowych człowieka. Stopniowe różnicowanie, które podsumowuje procesy rozwojowe, jest jednym z głównych sposobów generowania komórek trzustki, w tym komórek progenitorowych trzustki / dwunastnicy homeobox protein 1+ (PDX1+). Konwencjonalne protokoły inicjują różnicowanie z małymi koloniami wkrótce po pasażu. Jednak w stanie kolonii lub agregatów komórki są podatne na heterogenności, które mogą utrudniać różnicowanie się do komórek PDX1+. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół różnicowania hPSC w komórki PDX1+. Protokół składa się z czterech kroków i inicjuje różnicowanie poprzez wysiewanie zdysocjowanych pojedynczych komórek. Po indukcji ostatecznych komórek endodermy SOX17 + nastąpiła ekspresja dwóch prymitywnych markerów rurki jelitowej, HNF1β i HNF4α, i ostateczne różnicowanie w komórki PDX1 +. Obecny protokół zapewnia łatwą obsługę i może poprawić i ustabilizować skuteczność różnicowania niektórych linii hPSC, które wcześniej stwierdzono, że różnicują się nieefektywnie w linie endodermalne lub komórki PDX1 +.

Wprowadzenie

Trzustka składa się głównie z komórek zewnątrzwydzielniczych i endokrynnych, a jej dysfunkcja lub przeciążenie powoduje wiele chorób, takich jak zapalenie trzustki, cukrzyca i rak trzustki. Aby wyjaśnić patogenezę pankreatopatii, konieczna jest analiza procesu rozwoju i funkcji komórek trzustki. Ponadto do ustanowienia terapii suplementacji komórek/tkanek wymagane jest stabilne zaopatrzenie w komórki o solidnej jakości. Ludzkie pluripotencjalne komórki trzustki pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) są obiecującym źródłem komórek do tych celów, a protokół różnicowania w kierunku komórek trzustki był intensywnie badany1,2,3,4. Ostatnie postępy w generowaniu in vitro komórek β trzustki naśladują wytwarzanie komórek β u dorosłego człowieka, a komórki te wykazują skuteczność terapeutyczną po wszczepieniu do myszy z cukrzycą 2,3. Ponadto analiza β komórek wygenerowanych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) zdrowych dawców i dawców chorych na cukrzycę typu 1 nie wykazała żadnych różnic funkcjonalnych, w tym w warunkach stresu5. Co więcej, fenotypy choroby zostały częściowo odtworzone w indukowanych komórkach trzustki z iPSC lub hPSC pochodzącymi od pacjenta, które zawierają mutacje genetyczne w tym samym miejscu co pacjenci6,7.

Aby wygenerować komórki trzustki z hPSC, stosuje się stopniowe różnicowanie, które podsumowuje procesy rozwojowe. Trzustka pochodzi z warstwy endodermy wczesnego zarodka, która wyraża region determinujący płeć Y-box 17 (SOX17) i widelec A2 (FOXA2)8. Na podstawie badań na myszach warstwa endodermalna tworzy prymitywną rurkę jelitową, która charakteryzuje się ekspresją czynnika jądrowego hepatocytów 1-beta (Hnf1β) i czynnika jądrowego hepatocytów 4-alfa (Hnf4α). Prymitywna rurka jelitowa wydłuża się i rozwija w aparat oddechowy, przewód pokarmowy i narządy. Po wydłużeniu tylny obszar jelita przedniego staje się przypuszczalnym obszarem trzustki, co jest oznaczone ekspresją czynnika transkrypcyjnego trzustka/dwunastnica homeobox protein 1 (PDX1)8,9,10. Grzbietowa i brzuszna część rurki jelitowej PDX1 + pogrubia się, tworząc pąki trzustki, które są oznaczone koekspresją czynnika transkrypcyjnego trzustki 1 podjednostki alfa (PTF1A) i homeoboxu NK6 1 (NKX6.1)8,11. Wyrażenie to oznacza morfologiczny początek organogenezy trzustki. Komórki endodermy trzustki, które są składnikami zawiązków trzustki, tworzą rozgałęzioną rurkową sieć struktur nabłonkowych12 i ostatecznie różnicują się w komórki zewnątrzwydzielnicze i endokrynne, w tym komórki β wydzielające insulinę i komórki α wydzielające glukagon. Ekspresja PDX1 jest najpierw wykrywana w przypuszczalnym obszarze trzustki, który jest następnie obserwowany przez cały okres rozwoju trzustki i wykazuje lokalizację w komórkach β i δ9,13,14. Chociaż obszar komórek Pdx1 +, który nie wyraża Ptf1a lub Nkx6.1, różnicuje się w antrum żołądka, dwunastnicę, pozawątrobowy przewód żółciowy i niektóre komórki jelitowe na środkowym i późnym etapie rozwoju u myszy9, komórki PDX1+ są uważane za przodków trzustki we wczesnym stadium rozwoju u ludzi.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania hPSC na komórki PDX1+ w celu wytworzenia linii trzustkowych. Protokół inicjuje różnicowanie poprzez rozsiewanie zdysocjowanych pojedynczych komórek15,16,17. Ogólnie rzecz biorąc, niezróżnicowane hPSC są utrzymywane jako kolonie lub agregaty komórkowe w zawiesinie lub adhezji. W rezultacie, większość protokołów inicjuje różnicowanie wkrótce po przejściu. Jednak w stanie kolonii lub agregatów komórki są podatne na niejednorodności przestrzenne i transkrypcyjne18,19,20,21,22, co może utrudnić pierwszy krok różnicowania w kierunku ostatecznej endodermy, a następnie nieefektywne różnicowanie do PDX1+ Komórek. Obecny protokół może zapewnić łatwą obsługę w celu poprawy i ustabilizowania skuteczności różnicowania niektórych linii hPSC, które wcześniej stwierdzono, że różnicują się nieefektywnie do linii endodermalnych i komórek PDX1+23,24,25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty z użyciem hPSC zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Wydziału Medycyny i Wyższej Szkoły Medycznej Uniwersytetu w Kioto.

1. Przygotowanie materiałów

UWAGA: Przygotuj wszystkie podłoża i odczynniki do hodowli komórkowej w sterylnym środowisku. Przed użyciem rozgrzej podstawowe podłoże hodowlane do temperatury pokojowej (RT). Pożywkę do różnicowania stosuje się w ciągu 6 godzin w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje na temat odczynników znajdują się w Tabeli Materiałów.

  1. Zróżnicowanie (Rysunek 1A)
    1. Stage 1A medium: Przenieś medium RPMI 1640 do probówki za pomocą pipety. Dodaj suplement bez surowicy, aktywinę A, CHIR99021 i Y-27632 do stężenia odpowiednio 1x, 100 ng/mL, 3 μM i 10 μM.
    2. Podłoże etapu 1B: Przenieś medium RPMI 1640 do probówki za pomocą pipety. Dodaj suplement bez surowicy, aktywinę A i CHIR99021 w stężeniu odpowiednio 1x, 100 ng/ml, ≤1 μM.
      UWAGA: Stężenie CHIR99021 powinno być niższe niż w pożywce etapu 1A, a dodawanie nie jest konieczne, ale zwiększa liczbę komórek.
    3. Etap 2: Przenieś pożywkę Improved MEM (iMEM) do probówki za pomocą pipety. Dodaj suplement bez surowicy i czynnik wzrostu keratynocytów (KGF) w stężeniu odpowiednio 0,5x i 50 ng/ml.
    4. Etap 3 pożywka: Przenieś pożywkę iMEM do probówki za pomocą pipety. Dodać suplement bez surowicy, KGF, NOGGIN, kwas 3-Keto-N-aminoetylo-N'-aminoaproylodihydrocynamoilu cyklopaminy () i 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametylo-2-naftalenylo)-1-propenylo]-benzoesowy (TTNPB) pipetą do stężeń odpowiednio 0,5x, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 0,5 μM i 10 nM.
  2. Cytometria przepływowa (FCM)
    1. 1x Bufor do permeabilizacji/płukania: Przenieś wodę do probówki za pomocą pipety. Dodać bufor permeabilizacyjny/płuczący pipetą do stężenia 1x.
    2. Roztwór blokujący FCM: Przenieś 1x bufor do przepuszczalności/płukania do probówki za pomocą pipety. Dodać surowicę osła pipetą do stężenia 2% (obj./obj.).
  3. Barwienie immunologiczne
    1. Roztwór blokujący: Przenieść sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco do probówki za pomocą pipety. Dodać surowicę osła i Triton X za pomocą pipety do stężeń odpowiednio 5% (obj. / obj.) i 0,4% (obj. / obj.).

2. Różnicowanie hPSC do komórek tylnego jelita przedniego/progenitorów trzustki (komórki PDX1+)

UWAGA: Wszystkie procedury należy przeprowadzać przy użyciu sterylnych technik. hPSC są utrzymywane na 6-dołkowych płytkach pokrytych syntetycznym materiałem powierzchniowym dla hPSC z pożywką konserwacyjną hPSC zgodnie z instrukcjami producenta17,26. Gdy komórki osiągną 50-80% konfluencji (etap 0), użyj ich do różnicowania.

  1. Przygotuj płyty pokryte matrycą membrany podstawnej.
    1. Przenieść 6 ml RPMI 1640 (4 °C) do probówki schłodzonej do 4 °C na lodzie. Dodać 2 mg matrycy błony podstawnej (4 °C) ze schłodzonymi końcówkami pipet o pojemności 1 ml i dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie, aby uzyskać matrycę błony podstawnej o stężeniu 0,33 mg/ml.
    2. Przenieść 2 ml rozcieńczonej matrycy błony podstawnej do każdego dołka 6-dołkowych płytek do hodowli komórkowych za pomocą pipety. Umieścić płytki w temperaturze 37 °C na 60-90 minut w inkubatorze. Następnie trzymaj płytki w temperaturze RT do czasu użycia (w ciągu 3 godzin).
  2. Wysiewaj hPSC i inicjuj różnicowanie do ostatecznej endodermy (etap 1A).
    1. Odessać zużytą pożywkę i dodać pipetą 2 ml 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (RT) na studzienkę, aby przemyć hPSC hodowane na płytkach 6-dołkowych.
    2. Odessać 0,5 mM EDTA i dodać pipetą 2 ml 0,5 mM EDTA do dołka. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    3. Odessać 0,5 mM EDTA i dodać 1 ml pożywki podtrzymującej hPSC w temperaturze RT uzupełnionej pipetą o 10 μM Y-27632 na studzienkę. Pipetę delikatnie, ale szybko, aby zdmuchnąć przyczepione komórki na płytkach i zgrupować komórki na pojedyncze komórki. Nie należy wytwarzać pęcherzyków w zawiesinie komórek podczas pipetowania.
    4. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 4 ml pożywki konserwacyjnej hPSC w temperaturze pokojowej uzupełnionej 10 μM Y-27632. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek.
    5. Policz liczbę komórek w zawiesinie komórek, stosując procedurę wykluczania barwienia błękitu trypanowego.
      1. Wymieszaj 15 μl zawiesiny komórkowej i 15 μl błękitu trypanowego w probówce.
      2. Przenieść 10 μl zawiesiny komórek rozcieńczonej błękitem trypanowym na szkiełka do liczenia komórek w dwóch egzemplarzach za pomocą pipety o pojemności 10 μl.
      3. Policz liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i oblicz gęstość komórek w zawiesinie komórek. Rentowność wynosi zwykle >98%.
    6. Podwielokrotną zawiesinę komórek umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml w odległości 1-1,5 x 106 komórek na studzienkę z płytek 6-dołkowych (1-1,5 x 105 komórek/cm2).
    7. Odwirować probówkę o pojemności 50 ml przy 200 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    8. Odessać supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki z 1 ml pożywki etapu 1A (RT) na studzienkę. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek i dodać kolejny 1 ml pożywki etapu 1A (łącznie 2 ml na studzienkę).
    9. Odessać rozcieńczoną matrycę błony podstawnej do dołków płytek do kultur komórkowych przygotowanych w kroku 2.1.2 za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl. Natychmiast przejdź do następnego kroku.
    10. Ponownie delikatnie odpipetować zawiesinę komórek w kroku 2.2.8. Natychmiast po wymieszaniu przenieść zawiesinę komórkową (2 ml) do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Przykryj płytkę folią aluminiową, aby chronić płytkę przed światłem. Umieść płytkę w czystej ławce w temperaturze RT na 10-15 min.
      nuta: Nie przesuwaj talerza po wysiewie.
    11. Delikatnie umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 (wilgotna atmosfera) i hodować przez 24 godziny
      nuta: Nie potrząsaj talerzem po wysianiu.
  3. Indukuj różnicowanie do ostatecznej endodermy (etap 1B).
    1. Odessać zużytą pożywkę i dodać pipetą 2 ml DPBS do studzienek. Powtórzyć aspirację i dodawanie DPBS jeden raz.
      nuta: Aby usunąć martwe komórki z monowarstwy, delikatnie potrząśnij płytką przed każdym zasysaniem.
    2. Odessać zużyty DPBS za pomocą pipety i dodać 4 ml pożywki etapu 1B (37 °C) do studzienki. Delikatnie umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C (nawilżona atmosfera 5% CO2 ) i hodować ją przez 48 godzin.
    3. Odessać zużytą pożywkę i dodać pipetą 2 ml DPBS do studzienki. Powtórzyć aspirację i dodawanie DPBS jeden raz.
      nuta: Usuń martwe komórki z monowarstwy przez delikatne potrząsanie przed każdą aspiracją.
    4. Odessać zużyty DPBS za pomocą pipety i dodać 4 ml pożywki etapu 1B (37 °C) do studzienki. Delikatnie umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, nawilżona atmosfera 5% CO2 ) i hodować przez 24 godziny.
  4. Indukuj różnicowanie do prymitywnej cewy jelitowej (etap 2).
    1. Odessać zużytą pożywkę i dodać 2 ml DPBS do studzienki za pomocą pipety.
      UWAGA: Usuń martwe komórki z monowarstwy poprzez delikatne potrząsanie przed każdą aspiracją.
    2. Odessać zużyty DPBS za pomocą pipety i dodać 4 ml pożywki etapu 2 (37 °C) do dołka. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, nawilżona atmosfera 5% CO2 ) i hodować przez 4 dni.
  5. Indukuj różnicowanie do komórek PDX1 + (etap 3).
    1. Odessać zużytą pożywkę i dodać pipetą 2 ml DPBS do studzienki. Powtórzyć aspirację i dodawanie DPBS jeden raz.
    2. Odessać zużyty DPBS za pomocą pipety i dodać 4 ml pożywki etapu 3 (37 °C) do dołka. Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, wilgotna atmosfera 5% CO2 ) i hodować przez 3 dni.
  6. Indukują różnicowanie do komórek endokrynnych trzustki.
    1. Wykonaj indukcję komórek NKX6.1+ (Etap 4, przez 8 dni), a następnie indukcję komórek endokrynologicznych (Etap 5, przez 12 dni) zgodnie z wcześniej opisanymi protokołami3,16,26. Scharakteryzuj i zwaliduj różnicowanie komórek endokrynnych za pomocą barwienia immunologicznego i ilościowej analizy łańcuchowej reakcji polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (qRT-PCR).
      nuta: Szczegółowe procedury eksperymentalne można znaleźć w Toyoda et al.16 i Kimura et al.26. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z sekwencjami starterów stosowanymi do analizy qRT-PCR.

3. Cytometria przepływowa (FCM)

  1. Odessać zużytą pożywkę i dodać pipetą 2 ml 0,5 mM EDTA do studzienki. Powtórz aspirację i dodanie 0,5 mM EDTA jeden raz.
    nuta: Przed każdą aspiracją należy delikatnie wstrząsnąć płytką, aby usunąć wszelkie martwe komórki z komórek jednowarstwowych.
  2. Aby zdysocjować komórki (około 3-6 × 106 komórek na studzienkę), dodaj 2 ml 0,25% trypsyny zawierającej 0,5 mM EDTA na dołek. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
  3. Pipetę delikatnie, ale szybko, aby zdysocjować zlepione komórki na pojedyncze komórki. Nie należy wytwarzać pęcherzyków w zawiesinie komórek podczas pipetowania.
  4. Dodać 8-10 ml pożywki bazowej (RPMI 1640 lub iMEM, RT) zawierającej 0,5x suplementu bez surowicy i 10 μM Y-27632 na dołek i wymieszać zawiesinę komórkową. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej.
  5. Odwirować probówkę o sile 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 2 ml 0,5 mM EDTA (RT). Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek.
  7. Odwirować probówkę o sile 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  8. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl buforu utrwalającego i przepuszczalnego na10-6 komórek pod maską. Delikatnie odpipetować zawiesinę ogniw pod kapturem. Trzymaj probówkę w pozycji RT przez 30 minut.
  9. Odwirować probówkę o sile 400 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  10. Odessać supernatant pod maską i ponownie zawiesić komórki za pomocą 500 μl roztworu blokującego FCM na 10-6 komórek. Delikatnie odpipetować zawiesinę komórek. Trzymaj probówkę w pozycji RT przez 30 minut.
  11. Przenieść 50 μl zawiesiny komórek do probówki (około 1 x 105 komórek). Odwirować probówkę o sile 400 x g przy temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki ze 100 μl rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego (patrz tabela materiałów) w roztworze blokującym FCM i inkubować w temperaturze 4 °C przez >16 godzin.
  12. Odwirować probówkę o stężeniu 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 180 μl 1x buforu do trwałej poprawy.
  13. Odwirować probówkę o sile 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 100 μl rozcieńczonego przeciwciała drugorzędowego (patrz tabela materiałów) w roztworze blokującym FCM. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 60 minut lub w temperaturze 4 °C przez >16 godzin, chroniąc je przed światłem.
  14. Odwirować probówkę o stężeniu 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 180 μl 1x buforu do trwałej poprawy.
  15. Odwirować probówkę o sile 400 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 180 μl 2% surowicy osła w DPBS.
  16. Przefiltrować zawiesinę komórek, przenosząc ją na probówkę z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml z sitkiem do komórek (siatka nylonowa 35 μm) i utrzymywać w temperaturze 4 °C, chroniąc ją przed światłem, aż do zakończenia analizy.
  17. Przeanalizuj proporcję dodatnio wybarwionych komórek za pomocą cytometru przepływowego27.

4. Barwienie immunologiczne

  1. Odessać zużytą pożywkę i dodać pipetą 2 ml DPBS do studzienki. Powtórzyć aspirację i dodawanie DPBS jeden raz.
    nuta: Delikatnie potrząśnij płytką, aby usunąć wszelkie martwe komórki z komórek jednowarstwowych przed każdą aspiracją.
  2. Dodać 2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) (4 °C) do studzienki pipetą pod kapturem. Przechowywać płytkę w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
  3. Usuń PFA pipetą pod pokrywą. Dodać 2 ml DPBS w temperaturze pokojowej do studzienki pipetą pod kapturem. Powtórzyć aspirację i dodawanie DPBS jeden raz.
  4. Dodać 2 ml roztworu blokującego do dołka i utrzymywać płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  5. Odessać zużyty roztwór i dodać 1 ml przeciwciała pierwszorzędowego (patrz tabela materiałów) do roztworu blokującego na studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut lub w temperaturze 4 °C przez >16 h.
  6. Odessać zużyty roztwór, dodać 2 ml DPBS zawierającego 0,4% Triton X-100 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Powtórzyć aspirację, dodanie roztworu i inkubację jeden raz.
  7. Odessać zużyty roztwór i dodać 1 ml przeciwciała drugorzędowego (patrz Tabela Materiałów) do roztworu blokującego na studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 60 minut, chroniąc przed światłem.
  8. Odessać zużyty roztwór, dodać 2 ml DPBS zawierającego 0,4% Triton X-100 (RT) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut z ochroną przed światłem. Powtórz aspirację, dodanie roztworu i inkubację dwa razy.
  9. Wykonaj mikrofotografie, aby zbadać efektywność różnicowania pod mikroskopem fluorescencyjnym28.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Namnażane hiPSC (585A129,30) są zagęszczone i tworzą jednorodną monowarstwę (Rysunek 1B), która nadaje się do różnicowania. Nieróżnicowane hiPSC (Etap 0) są dysocjowane i ponowny wysiewany jako pojedyncze komórki przy niskiej gęstości komórek (1-1,5 x 105 komórek/cm2). W ciągu 1 h komórki przylegają do płytki i zaczynają wykazywać wypustki. W 1. dniu komórki proliferują i są dobrze rozmieszczone, pokrywając 80-9...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Generowanie komórek PDX1+ składa się z wielu etapów; Dlatego tak ważne jest, aby leczyć komórki w odpowiednim czasie. Wśród etapów, skuteczność indukcji ostatecznej endodermy w dużej mierze wpływa na końcową wydajność indukcji, prawdopodobnie poprzez interferencję z innymi zanieczyszczającymi komórkami linii (tj. mezodermą i ektodermą), które mogą namnażać się i / lub wydzielać czynniki zakłócające specyficzne różnicowanie. Jeśli odsetek komórek SOX17+ jest niższy niż 80% w dniu 4 (etap 1B), skutecz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) poprzez Badania Naukowe (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 i 18K08510) dla T.T., oraz Grant-in-Aid dla JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant Number 17J07622) dla A.K. oraz Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (AMED) poprzez grant badawczy "Core Center for iPS Cell Research, Sieć Ośrodków Badawczych Realizacji Medycyny Regeneracyjnej" do K.O. Autorzy dziękują dr. Peterowi Karagiannisowi za przeczytanie manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 3-keto-N-aminoetylo-N′-aminoproylodihydrocynamonoilocyklopaminyToronto Research ChemicalsK171000
Kwas 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametylo-2-naftalenylo)-1-propenylo]-benzoesowySanta Cruz BiotechnologySC-203303TTNPB
50 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenuThermo Fisher Scientific339652
Przeciwciało anty-CDX2 [EPR2764Y]AbcamAb76541Anty-CDX2, &razy; 1/1000 rozcieńczenie
B-27 Suplement (50 & razy;)Thermo Fisher Scientific17504-044Suplement bez surowicy
BD FACSAria II Sorter komórekBD BiosciencesDo cytometrii
przepływowej Zamrażarka biomedycznaSANYOMDF-U538Dla -30 ° C Przechowywanie
Szkiełka do liczenia komórek do licznika komórek TC10/TC20, dwukomoroweBIO-RAD1450011Szkiełko do liczenia
PŁYTKA WIELODOŁKOWA DO HODOWLI KOMÓRKOWYCH, 6-DOŁKOWA, PS, PRZEZROCZYSTAGreiner bio-one657165Do hodowli różnicowej/płytki 6-dołkowej
WirówkaTOMYAX-310Do hodowli komórek
WirówkaTOMYMX-305Do RT-qPCR
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
CLEAN BENCHSHOWA KAGAKU S-1601PRVCzysta ławka
Corning CellBIND 6-dołkowa płytkaCorning3335Do bezfeederowej hodowli hPSC/płytki 6-dołkowej
Corning Matrigel Podstawna membrana membranowa Matrix Zmniejszony współczynnik wzrostuCorning354230Matryca membrany podstawnej
Corning Synthemax II-SC SubstrateCorning3535Do bezfeederowej hodowli hPSC/syntetycznego materiału powierzchniowego dla hPSC
CryostatLeicaLeica CM1510 SDo barwienia immunologicznego agregatów.
Zestaw Cytofix/CytopermBecton Dickinson554714Bufor do trwałej ondulacji/prania jest  Bufor przepuszczalny/myjący. Bufor Cytofix/Cytoperm jest buforem do utrwalania i przepuszczalności.
Długopis DakoS2002Do barwienia immunologicznego agregatów
mieszanka dNTP (10 mM)Thermo Fisher Scientific18427-088Do RT-qPCR
Przeciwciało wtórne przeciw kozom IgG (H + L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11055Przeciwciało drugorzędowe, &czasy; Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało anty-mysie IgG osła (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036Przeciwciało drugorzędowe, &razy; 1/500 rozcieńczenie
Przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040Przeciwciało drugorzędowe, &razy; 1/500 rozcieńczenie
Surowica osłaMerck MilliporeS30Surowica osła
D-PBS(-) bez Ca lub MgNacalai tesque14249-95DPBS
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Do hodowli hPSC bez karmienia pożywki polistyrenowej
Falcon 5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z sitkiem do komórek Snap CapCorning352235ml rurka z polistyrenu o okrągłym dnie z sitkiem do komórek
Końcówka filtra, 1,000 &mikro; LWatoson124-1000SStosować razem z pipetami
Końcówka filtra, 20 i mikro; LWatoson124-P20SStosować razem z pipetami
Końcówka filtra, 200 i mikro; LWatoson124-P200SUżywaj razem z pipetami
Mikroskop fluorescencyjnyKeyenceBZ-X700Do barwienia immunologicznego
Inkubator Forma Steri-Cycle CO2Termo Fisher Scientific370AInkubator
HNF-1β Przeciwciało (C-20)Santa Cruz Biotechnologysc-7411Anty-HNF1β, &razy; 1/200 rozcieńczenie
HNF-4&alfa; Przeciwciało (H-171)Santa Cruz Biotechnologysc-8987Anty-HNF4α, &razy; Rozcieńczenie 1/200
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Do barwienia jądra, &razy; Rozcieńczenie 1/200
Ludzka trzustka Całkowite RNAAmbionAM7954Do RT-qPCR
Ludzkie przeciwciało PDX-1 / IPF1R& D SystemsAF2419Anti-PDX1, kozia IgG i razy; Rozcieńczenie 1/200
Ludzkie przeciwciało SOX17R& D SystemsAF1924Anti-SOX17, & razy rozcieńczenie 1/200
Ulepszone MEM Opcja mediumThermo Fisher Scientific10373-017iMEM
Komora inkubacyjnaCosmo Bio10DODo barwienia immunologicznego kruszyw
Rękawice do badań lateksowychpowlekane Adachi
MASSzkło Matsunami Glass83-1881Do barwienie immunologiczne agregatów
MicroAmp Fast 96-dołkowa płytka reakcyjnaApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientific4346907RT-qPCR
OlympusCKX41N-31PHPDo hodowli komórek
MikroprobówkaWatoson131-515CS
Monoklonalna anty-&alfa;-fetoproteinaSIGMAA8452Anti-AFP, &razy; rozcieńczenie 1/200
Nanodrop 8000Thermo Fisher Scientificdo RT-qPCR
Oligo dTFASMACOligo made Oligo Dla RT-qPCR sekwencji jest "TTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyd, proszekNacalai tesque26126-54PFA, utrwalacz, rozcieńczony w DPBS
Lodówka farmaceutycznaSANYOMPR-514Do 4 & stopni; C przechowywanie
PIPETMAN P GILSON
Pipeta Rekombinowana ludzka KGF/FGF-7R& D Systems251-KGKGF
Rekombinowany człowiek NogginPeproTech120-10CNOGGIN
Rekombinowana aktywina człowiek/mysz/szczur A& D Systems338-ACActivin A
ReverTra Ace (100 U/μ L)TOYOBOTRT-101Do RT-qPCR
Zestaw DNaz bez RNaz (50)QIAGEN79254Do RT-qPCR
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Do RT-qPCR
RPMI 1640 z L-GlnNacalai tesque30264-85RPMI 1640
Folia uszczelniająca do czasu rzeczywistegoTakaraNJ500serologicznych RT-qPCR
10 mlCostar/Corning4488Do hodowli komórek Pipety
serologiczne 25 mlCostar/Corning4489Do hodowli komórek
Pipety serologiczne 5 mlCostar/Corning4487Do hodowli komórek
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAbSygnalizacja komórkowa3579SAnti-SOX2, &razy rozcieńczenie 1/200
StepOnePlusApplied Biosystems/Thermo Fisher ScientificFor RT-qPCR
SacharozaNacalai tesque30406-25Do barwienia immunologicznego kruszyw
TB Green
Premix Ex Taq II 		TakaraRR820BDo RT-qPCR
TC20 Automatyczny licznik komórekBIO-RAD1450101J1Automatyczny licznik komórek
Związek Tissue-Tek OCT 4583 Sakura Finetechnical4583Do barwienia immunologicznego agregatów
Tissue-Tek Cryomold Formy/adapterySakura Finetechnical4566Do barwienia immunologicznego kruszyw
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
Trypan BlueBIO-RAD1450021
Ultrazimna zamrażarkaSANYOMDF-U33VDo -80 ° C przechowujący
UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575-038Rozcieńczony DPBS w celu przygotowania 0,5 mM EDTA
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems/Thermo Fisher ScientificFor RT-qPCR
Y-27632Wako251-00514
5 Szkło ślizgowe Do mikroskopu R Do pipet

Bibliografia

  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463(2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367(2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218(2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076(2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki PDX1 dodatnier nicowanie hPSCendoderma definitywnafrakcja naczyniowo stromalnacytometria przep ywowaWestern blotmikroskopia konfokalnaizolacja kom rektrawienie tkanekkom rki progenitorowe

Powiązane artykuły