Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komórki trzustki pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) są obiecującym źródłem komórek dla medycyny regeneracyjnej i platformą do badania procesów rozwojowych człowieka. Stopniowe różnicowanie, które podsumowuje procesy rozwojowe, jest jednym z głównych sposobów generowania komórek trzustki, w tym komórek progenitorowych trzustki / dwunastnicy homeobox protein 1+ (PDX1+). Konwencjonalne protokoły inicjują różnicowanie z małymi koloniami wkrótce po pasażu. Jednak w stanie kolonii lub agregatów komórki są podatne na heterogenności, które mogą utrudniać różnicowanie się do komórek PDX1+. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół różnicowania hPSC w komórki PDX1+. Protokół składa się z czterech kroków i inicjuje różnicowanie poprzez wysiewanie zdysocjowanych pojedynczych komórek. Po indukcji ostatecznych komórek endodermy SOX17 + nastąpiła ekspresja dwóch prymitywnych markerów rurki jelitowej, HNF1β i HNF4α, i ostateczne różnicowanie w komórki PDX1 +. Obecny protokół zapewnia łatwą obsługę i może poprawić i ustabilizować skuteczność różnicowania niektórych linii hPSC, które wcześniej stwierdzono, że różnicują się nieefektywnie w linie endodermalne lub komórki PDX1 +.
Wprowadzenie
Trzustka składa się głównie z komórek zewnątrzwydzielniczych i endokrynnych, a jej dysfunkcja lub przeciążenie powoduje wiele chorób, takich jak zapalenie trzustki, cukrzyca i rak trzustki. Aby wyjaśnić patogenezę pankreatopatii, konieczna jest analiza procesu rozwoju i funkcji komórek trzustki. Ponadto do ustanowienia terapii suplementacji komórek/tkanek wymagane jest stabilne zaopatrzenie w komórki o solidnej jakości. Ludzkie pluripotencjalne komórki trzustki pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) są obiecującym źródłem komórek do tych celów, a protokół różnicowania w kierunku komórek trzustki był intensywnie badany
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty z użyciem hPSC zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Wydziału Medycyny i Wyższej Szkoły Medycznej Uniwersytetu w Kioto.
1. Przygotowanie materiałów
UWAGA: Przygotuj wszystkie podłoża i odczynniki do hodowli komórkowej w sterylnym środowisku. Przed użyciem rozgrzej podstawowe podłoże hodowlane do temperatury pokojowej (RT). Pożywkę do różnicowania stosuje się w ciągu 6 godzin w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje na temat odczynników znajdują się w Tabeli Materiałów.
- Zróżnicowanie (Rysunek 1A
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Namnażane hiPSC (585A129,30) są zagęszczone i tworzą jednorodną monowarstwę (Rysunek 1B), która nadaje się do różnicowania. Nieróżnicowane hiPSC (Etap 0) są dysocjowane i ponowny wysiewany jako pojedyncze komórki przy niskiej gęstości komórek (1-1,5 x 105 komórek/cm2). W ciągu 1 h komórki przylegają do płytki i zaczynają wykazywać wypustki. W 1. dniu komórki proliferują i są dobrze rozmieszczone, pokrywając 80-9.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Generowanie komórek PDX1+ składa się z wielu etapów; Dlatego tak ważne jest, aby leczyć komórki w odpowiednim czasie. Wśród etapów, skuteczność indukcji ostatecznej endodermy w dużej mierze wpływa na końcową wydajność indukcji, prawdopodobnie poprzez interferencję z innymi zanieczyszczającymi komórkami linii (tj. mezodermą i ektodermą), które mogą namnażać się i / lub wydzielać czynniki zakłócające specyficzne różnicowanie. Jeśli odsetek komórek SOX17+ jest niższy niż 80% w dniu 4 (etap 1B), skutecz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (JSPS) poprzez Badania Naukowe (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 i 18K08510) dla T.T., oraz Grant-in-Aid dla JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant Number 17J07622) dla A.K. oraz Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (AMED) poprzez grant badawczy "Core Center for iPS Cell Research, Sieć Ośrodków Badawczych Realizacji Medycyny Regeneracyjnej" do K.O. Autorzy dziękują dr. Peterowi Karagiannisowi za przeczytanie manuskryptu.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas 3-keto-N-aminoetylo-N′-aminoproylodihydrocynamonoilocyklopaminy | Toronto Research Chemicals | K171000 | |
| Kwas 4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahydro-5,5,8,8-tetrametylo-2-naftalenylo)-1-propenylo]-benzoesowy | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 ml stożkowe sterylne probówki wirówkowe z polipropylenu | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Przeciwciało anty-CDX2 [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anty-CDX2, &razy; 1/1000 rozcieńczenie |
| B-27 Suplement (50 & razy;) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Suplement bez surowicy |
| BD FACSAria II Sorter komórek | BD Biosciences | Do cytometrii | |
| przepływowej Zamrażarka biomedyczna | SANYO | MDF-U538 | Dla -30 ° C Przechowywanie |
| Szkiełka do liczenia komórek do licznika komórek TC10/TC20, dwukomorowe | BIO-RAD | 1450011 | Szkiełko do liczenia |
| PŁYTKA WIELODOŁKOWA DO HODOWLI KOMÓRKOWYCH, 6-DOŁKOWA, PS, PRZEZROCZYSTA | Greiner bio-one | 657165 | Do hodowli różnicowej/płytki 6-dołkowej |
| Wirówka | TOMY | AX-310 | Do hodowli komórek |
| Wirówka | TOMY | MX-305 | Do RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Czysta ławka |
| Corning CellBIND 6-dołkowa płytka | Corning | 3335 | Do bezfeederowej hodowli hPSC/płytki 6-dołkowej |
| Corning Matrigel Podstawna membrana membranowa Matrix Zmniejszony współczynnik wzrostu | Corning | 354230 | Matryca membrany podstawnej |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | Do bezfeederowej hodowli hPSC/syntetycznego materiału powierzchniowego dla hPSC |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | Do barwienia immunologicznego agregatów. |
| Zestaw Cytofix/Cytoperm | Becton Dickinson | 554714 | Bufor do trwałej ondulacji/prania jest Bufor przepuszczalny/myjący. Bufor Cytofix/Cytoperm jest buforem do utrwalania i przepuszczalności. |
| Długopis Dako | S2002 | Do barwienia immunologicznego agregatów | |
| mieszanka dNTP (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | Do RT-qPCR |
| Przeciwciało wtórne przeciw kozom IgG (H + L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Przeciwciało drugorzędowe, &czasy; Rozcieńczenie 1/500 |
| Przeciwciało anty-mysie IgG osła (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Przeciwciało drugorzędowe, &razy; 1/500 rozcieńczenie |
| Przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Przeciwciało drugorzędowe, &razy; 1/500 rozcieńczenie |
| Surowica osła | Merck Millipore | S30 | Surowica osła |
| D-PBS(-) bez Ca lub Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Do hodowli hPSC bez karmienia pożywki polistyrenowej |
| Falcon 5 ml probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z sitkiem do komórek Snap Cap | Corning | 352235 | ml rurka z polistyrenu o okrągłym dnie z sitkiem do komórek |
| Końcówka filtra, 1,000 &mikro; L | Watoson | 124-1000S | Stosować razem z pipetami |
| Końcówka filtra, 20 i mikro; L | Watoson | 124-P20S | Stosować razem z pipetami |
| Końcówka filtra, 200 i mikro; L | Watoson | 124-P200S | Używaj razem z pipetami |
| Mikroskop fluorescencyjny | Keyence | BZ-X700 | Do barwienia immunologicznego |
| Inkubator Forma Steri-Cycle CO2 | Termo Fisher Scientific | 370A | Inkubator |
| HNF-1β Przeciwciało (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anty-HNF1β, &razy; 1/200 rozcieńczenie |
| HNF-4&alfa; Przeciwciało (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anty-HNF4α, &razy; Rozcieńczenie 1/200 |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Do barwienia jądra, &razy; Rozcieńczenie 1/200 |
| Ludzka trzustka Całkowite RNA | Ambion | AM7954 | Do RT-qPCR |
| Ludzkie przeciwciało PDX-1 / IPF1 | R& D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, kozia IgG i razy; Rozcieńczenie 1/200 |
| Ludzkie przeciwciało SOX17 | R& D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, & razy rozcieńczenie 1/200 |
| Ulepszone MEM Opcja medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Komora inkubacyjna | Cosmo Bio | 10DO | Do barwienia immunologicznego kruszyw |
| Rękawice do badań lateksowych | powlekane Adachi | ||
| MAS | Szkło Matsunami Glass | 83-1881 | Do barwienie immunologiczne agregatów |
| MicroAmp Fast 96-dołkowa płytka reakcyjna | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | RT-qPCR |
| Olympus | CKX41N-31PHP | Do hodowli komórek | |
| Mikroprobówka | Watoson | 131-515CS | |
| Monoklonalna anty-&alfa;-fetoproteina | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, &razy; rozcieńczenie 1/200 |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | do RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Oligo made Oligo | Dla RT-qPCR sekwencji jest "TTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyd, proszek | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, utrwalacz, rozcieńczony w DPBS |
| Lodówka farmaceutyczna | SANYO | MPR-514 | Do 4 & stopni; C przechowywanie |
| PIPETMAN P | GILSON | ||
| Pipeta Rekombinowana ludzka KGF/FGF-7 | R& D Systems | 251-KG | KGF |
| Rekombinowany człowiek Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Rekombinowana aktywina człowiek/mysz/szczur A | & D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μ L) | TOYOBO | TRT-101 | Do RT-qPCR |
| Zestaw DNaz bez RNaz (50) | QIAGEN | 79254 | Do RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | Do RT-qPCR |
| RPMI 1640 z L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Folia uszczelniająca do czasu rzeczywistego | Takara | NJ500 | serologicznych RT-qPCR |
| 10 ml | Costar/Corning | 4488 | Do hodowli komórek Pipety |
| serologiczne 25 ml | Costar/Corning | 4489 | Do hodowli komórek |
| Pipety serologiczne 5 ml | Costar/Corning | 4487 | Do hodowli komórek |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Sygnalizacja komórkowa | 3579S | Anti-SOX2, &razy rozcieńczenie 1/200 |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sacharoza | Nacalai tesque | 30406-25 | Do barwienia immunologicznego kruszyw |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820B | Do RT-qPCR |
| TC20 Automatyczny licznik komórek | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatyczny licznik komórek |
| Związek Tissue-Tek OCT 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | Do barwienia immunologicznego agregatów |
| Tissue-Tek Cryomold Formy/adaptery | Sakura Finetechnical | 4566 | Do barwienia immunologicznego kruszyw |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultrazimna zamrażarka | SANYO | MDF-U33V | Do -80 ° C przechowujący |
| UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Rozcieńczony DPBS w celu przygotowania 0,5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
Bibliografia
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
