Artykuł metodologiczny

Wykrywanie prenylacji małej GTPazy i wiązania GTP za pomocą frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentowego sprzężonego z GTPazą

DOI:

10.3791/57646

⸱

11 listopada 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Anatomy and Cell Science, Rady Faculty of Health Sciences, Max Rady College of Medicine, University of Manitoba, 2Biology of Breathing Theme, Children Hospital Research Institute of Manitoba, University of Manitoba, 3Department of Biochemistry, School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Isfahan University of Medical Sciences, 4Division of Pulmonary, Critical Care, and Sleep Medicine, Department of Internal Medicine, Center for Comparative Respiratory Biology and Medicine, 5Department of Clinical Biochemistry, School of Medicine, Zahedan University of Medical Sciences, 6Department of Molecular Biology, School of Pharmacy with the Division of Laboratory Medicine in Sosnowiec, Medical University of Silesia, 7Centre de biophysique moléculaire - UPR 4301, Centre national de la recherche scientifique (CNRS) CS80054, 8LinkoCare Life Sciences AB, 9College of Nursing and Children's Hospital Research Institute of Manitoba, Rady Faculty of Health Sciences, University of Manitoba, 10Health Policy Research Center, Institute of Health, Shiraz University of Medical Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół do badania prenylacji i obciążenia guanozyno-5'-trifosforanu (GTP) GTPazy Rho. Protokół ten składa się z dwóch szczegółowych metod, a mianowicie frakcjonowania błonowego i testu immunoenzymentu sprzężonego z GTPazą. Protokół może być używany do pomiaru prenylacji i obciążenia GTP różnych innych małych GTPaz.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rodzina GTPazy Rho należy do nadrodziny Ras i obejmuje około 20 członków u ludzi. GTPazy Rho są ważne w regulacji różnych funkcji komórkowych, w tym dynamiki cytoszkieletu, ruchliwości komórek, polaryzacji komórek, prowadzenia aksonów, transportu pęcherzykowego i kontroli cyklu komórkowego. Zmiany w sygnalizacji GTPazy Rho odgrywają istotną rolę regulacyjną w wielu stanach patologicznych, takich jak rak, choroby ośrodkowego układu nerwowego i choroby zależne od układu odpornościowego. Potranslacyjna modyfikacja GTPaz Rho (tj. prenylacja przez produkty pośrednie szlaku mewalonianu) i wiązanie GTP są kluczowymi czynnikami wpływającymi na aktywację tego białka. W tym artykule przedstawiono dwie podstawowe i proste metody wykrywania szerokiego zakresu prenylacji GTPazy Rho i aktywności wiązania GTP. Szczegóły zastosowanych procedur technicznych są wyjaśnione krok po kroku w niniejszym manuskrypcie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rho GTPazy to grupa małych białek (21 - 25 kDa), które są dobrze zachowane podczas ewolucji i tworzą unikalną podrodzinę w nadrodzinie małych GTPaz Ras. W każdej podrodzinie w tej nadrodzinie istnieje wspólny rdzeń domeny G, który jest zaangażowany w aktywność GTPazy i wymianę nukleotydów1. Różnica między rodziną Rho a innymi podrodzinami Ras polega na obecności "domeny wstawiania Rho" w 5. nici β i 4. helisie α w małej domenie GTPase2.

Na podstawie ostatniej klasyfikacji, GTPazy Rho są uważane za rodzinę białek sygnałowych, które pasują do nadrodziny Gtas3. GTPazy Rho u ssaków mają 22 członków w oparciu o ich specyficzną funkcję i ogólną charakterystykę4, w których RhoA, Rac1 i Cdc42 należą do najlepiej zbadanych członków w tej grupie. GTPazy Rho są połączone z wewnątrzkomórkowymi szlakami sygnałowymi za pomocą ściśle regulowanego mechanizmu, który jest zależny od przełączników molekularnych poprzez modyfikacje potranslacyjne białek5.

Ładowanie i hydroliza GTP są niezbędnymi mechanizmami w cyklu aktywacji/dezaktywacji małych GTPaz Rho i są regulowane przez białka aktywujące GTPazę (GAP). GAP są odpowiedzialne za hydrolizę GTP i współpracują z czynnikami wymiany nukleotydów guaniny (GEF), które są odpowiedzialne za reakcję ładowania GTP. Inhibitory dysocjacji Rho GDP (GDI) zapewniają dalszą regulację małych GTPaz Rho poprzez wiązanie się z GTPazami Rho związanymi z GDP. Hamuje to dysocjację GDP i ułatwia sekwestrację małych GTPaz Rho z dala od aktywnych miejsc błony wewnątrzkomórkowej. Istnieje również dalsza regulacja białek GTPazy Rho, obejmująca prenylację GDI, która reguluje zarówno hydrolizę, jak i wymianę nukleotydów oraz kontroluje cykl GDP/GTP1,6,7,8.

Zarówno ładowanie GTP, jak i prenylacja GTPazy Rho są zaangażowane w przemieszczanie się GTPazy Rho między cytozolem a błonami komórkowymi poprzez zmianę właściwości lipofilowych tych białek1,9. Wyżej wymienione regulatory oddziałują z fosfolipidami błony komórkowej i innymi białkami modulującymi aktywność wymiany GDP/GTP10. Co więcej, GDI, czyli inhibitory dysocjacji, blokują zarówno hydrolizę GTP, jak i wymianę GDP/GTP. GDI hamują dysocjację nieaktywnych białek Rho od GDP, a tym samym ich interakcję z dalszymi efektorami. GDI regulują również cykl GTPaz między cytozolem a błoną komórki. Aktywność GTPaz Rho zależy w dużym stopniu od ich przemieszczania się do błony komórkowej; w związku z tym GDI są uważane za krytyczne regulatory, które mogą sekwestrować GTPazy w cytoplazmie poprzez ukrywanie ich hydrofobowego regionu/domeny11,12.

Aby GTPaza Rho miała optymalną sygnalizację i funkcję na wszystkich etapach swojego cyklu aktywacji, kluczowy jest dynamiczny cykl ładowania GTP/hydrolizy GTP. Wszelkiego rodzaju zmiany w tym procesie mogą skutkować późniejszymi zmianami w funkcjach komórek regulowanych przez GTPazę Rho, takich jak polaryzacja komórek, proliferacja, morfogeneza, cytokineza, migracja, adhezja i przeżycie13,14.

Obecny protokół dostarcza czytelnikom szczegółowej metody monitorowania aktywacji małych GTPaz RhoA poprzez badanie ich prenylacji i ładowania GDP/GTP. Metoda ta może być również stosowana do wykrywania prenylacji i wiązania GTP szerokiej gamy małych GTPaz. Test immunoenzymazowy sprzężony z GTPazą może być używany do pomiaru poziomu aktywacji innych rodzajów GTPaz, takich jak Rac1, Rac2, Rac3, H-, K- lub N-Ras, Arf i Rho15. Jako przykład podano środek farmakologiczny symwastatyna, ponieważ niedawno doniesiono, że bierze ona udział w regulacji prenylacji i aktywności małych GTPazy Rho8,9,14,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oznaczanie lokalizacji RhoA za pomocą frakcjonowania membranowego/cytozolowego

  1. Hodowla komórkowa i leczenie symwastatyną
    1. Wysiewaj 50 000 komórek U251 w naczyniu o średnicy 100 mm i hoduj je w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco (wysoka glukoza, 10% płodowa surowica bydlęca [FBS]).
    2. Gdy zlewa się w 30%, potraktuj komórki, usuwając pożywkę i dodając do niej pożywkę zawierającą symwastatynę (10 μM symwastatyny rozpuszczonej w dimetylosulfotlenku [DMSO]) i inkubuj przez 36 godzin w temperaturze 37 °C8. Użyj samego DMSO jako sterowania pojazdem.
      UWAGA: Do cytozolu i frakcjonowania błonowego komórek potrzeba 10 milionów komórek.
  2. Pobieranie komórek
    1. Wyjąć komórki z inkubatora w temperaturze 37 °C. Przyjrzyj się komórkom pod mikroskopem, aby potwierdzić zbieg.
      UWAGA: Komórki powinny być zlewające się w 70% - 80%.
    2. Odessać pożywkę, przemyć komórki 1x zimną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS). Dodać 5 ml buforu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (KCl: 400 mg/L, NaCl: 6800 mg/L, NaHCO3: 2200 mg/L, NaH2PO4. H2O: 140 mg/L, D-glukoza: 1 000 mg, EDTA disodium: 373 mg/L) na płytkę i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.
    3. Po 5 minutach inkubacji zebrać EDTA wraz z komórkami w probówce o pojemności 15 ml zawierającej taką samą ilość pożywki jak EDTA.
      UWAGA: Posiadanie pożywki w probówce neutralizuje EDTA i zapobiega dalszemu trawieniu błon komórkowych.
    4. Umieść probówkę w pojemniku na lód i przejdź do wirówki.
    5. Ustawić wirówkę na 1 500 x g w temperaturze 4 °C i wirować komórki przez 5 minut.
    6. Usunąć sklarowany osad bez naruszania osadu i dodać 1 ml zimnego PBS. Dobrze wymieszaj komórki.
    7. Przenieść mieszaninę komórek (roztwór) do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 1 500 x g w temperaturze 4 °C i wirować komórki przez 5 minut.
    8. Sprawdź rozmiar osadu (w celu oszacowania objętości bufora do następnego kroku). Umieścić próbki na lodzie. Całkowicie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu.
    9. Dodać lodowaty bufor I (10 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,1 mM EDTA, 0,1 mM EGTA, 1 mM ditiotreitol i koktajl inhibitorów proteazy), dobrze wymieszać próbki, pipetując w górę iw dół, a następnie przystąpić do sonikacji.
  3. Sonikacja
    1. Ustaw sonikator na pięć cykli, po 5 s każdy, i powtórz 3x.
    2. Wykonaj sonikację na lodzie. Przejdź do ultrawirówki.
      UWAGA: Lód i zimno zachowują białka i sprawiają, że wyniki są bardziej wiarygodne.
  4. Ultrawirowanie
    1. Użyj ultrawirówki, aby rozdzielić homogenaty komórek na frakcje cytoplazmatyczne i błonowe. Ustawić wirówkę na 100 000 x g na 35 minut w temperaturze 4 °C. Jak pokazano w Rysunek 1, sprawdź rozmiar granulki.
      UWAGA: Frakcja błonowa znajduje się na samym dnie probówki, a reszta to inne składniki cytoplazmatyczne.
    2. Zebrać supernatant całkowicie, uważając, aby nie naruszyć osadu. Supernatantem jest frakcja cytozolowa. Umieścić supernatant w nowo oznakowanej probówce.
    3. Dodać 300 μl buforu dysocjacyjnego (bufor II) (50 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M NaCl, 1 mM ditiotreitol, 1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA i koktajl inhibitorów proteazy) do osadu (zawiera frakcję błonową). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
    4. Przystąp do oznaczania białka i przygotowania próbki metodą western blot (analiza immunoblot).
  5. Immunoblotting (Immunoblotting)
    1. Przygotuj ekstrakty białek komórkowych z oddzielonych frakcji w buforze do lizy (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,5 mM PMSF, 0,5% niejonowego detergentu-40, 100 μM 3-fosforanu β-glicerolu i 0,5% koktajlu inhibitorów proteazy).
    2. Zmierz stężenie białka za pomocą metody Lowry'ego8 i oblicz objętość buforu do lizy (20 mM Tris-HCl [pH 7,5], 0,5 mM PMSF, 0,5% detergentu niedenaturującego, oktylofenoksypolietylenu, 100 μM 3-fosforanu β-glicerolu i 0,5% koktajlu inhibitorów proteazy), aby znormalizować stężenie białka między próbkami.
    3. Podgrzewać próbki w temperaturze 90 °C przez 5 minut i załadować 15 - 20 μl próbek na 15% żel SDS-PAGE w celu oddzielenia białek.
      UWAGA: Załaduj 1 μg białka na każdą próbkę. Oblicz wolumin, który należy odpowiednio uruchomić.
    4. Przenieś oddzielone białka do membran nylonowych w warunkach redukujących (500 nM glicyny, 50 mM Tris-HCl i 20% metanolu) przez 2 godziny, w temperaturze pokojowej (RT) przy 100 V.
      UWAGA: Aby potwierdzić pomyślny transfer białka, użyj barwienia Pąsa lub zwizualizuj marker białkowy na błonie.
    5. Zablokuj membrany 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku i 1x solą fizjologiczną Tris zawierającą detergent (TBS/0,01% detergentu niejonowego; TBST) w celu zablokowania nieswoistego wiązania przeciwciał w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    6. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe do analizy immunoblottingu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W tym eksperymencie Rac1/2/3, cdc42, RhoA, GAPDH i pan-kadheryna zastosowano w rozcieńczeniu 1:1,000 w 1% mleku w 1x TBST. Pan-Kadheryna i GAPDH zostały użyte do potwierdzenia czystości odpowiednio frakcji błonowej i cytozolowej.
    7. Myć membrany 3x buforem myjącym z 1x TBST przez 20 min.
    8. Inkubować błony z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową przeciwko króliczej peroksydazie chrzanowej (HRP) dla odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych (przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej).
    9. Umyj plamy 3x przez 20 minut i rozwiń je z ulepszoną detekcją chemiluminescencji (ECL).

2. Pomiar obciążenia RhoA GTP za pomocą małego testu aktywacji białka G

  1. Policz 10 000 komórek/ml i posadź komórki U251 w naczyniu o średnicy 100 mm.
  2. Gdy zlewają się w 30%, potraktuj komórki symwastatyną zgodnie z opisem w kroku 1.1.2.
  3. Wyjmij płytki hodowlane z inkubatora. Spójrz na komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić zbieg. Upewnij się, że komórki są zlewające się w 70% - 80%. Umieść szalkę Petriego na lodzie, odessaj pożywkę i umyj komórki 3x lodowatym PBS (pH 7,2).
  4. Zassać PBS. Przechyl szalkę Petriego na lodzie na dodatkową minutę, aby usunąć wszystkie pozostałości PBS.
    UWAGA: Resztkowy PBS niekorzystnie wpływa na ten test.
  5. Poddać komórki lizie w lodowato-zimnym buforze do lizy o objętości 700 μl, zawierającym inhibitory proteazy i fosfatazy.
    UWAGA: 700 μL zwykle wystarcza na 100 mm szalkę Petriego. Patrz Tabela 1, aby znaleźć odpowiednią objętość dla każdego naczynia hodowlanego.
  6. Zbierz lizat komórkowy za pomocą skrobaka do komórek. Nachyl płytkę hodowlaną dla tej techniki.
  7. Przenieś lizat do oznakowanej lodowatej krioprobówki i trzymaj ją na lodzie.
  8. Dokładnie wymieszaj za pomocą wiru. Zachowaj 10 μl lizatu do oznaczenia białka, aby zmierzyć stężenie białka w próbce.
  9. Błyskawiczne zamrożenie pozostałego lizatu komórkowego w ciekłym azocie.
    UWAGA: Przygotuj wiele porcji lizatu komórkowego przed ich błyskawicznym zamrożeniem, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania, które mogą prowadzić do utraty aktywności GTPazy RhoA.
  10. Przenieś zamrożone krioprobówki do zamrażarki o temperaturze -80 °C i przechowuj próbki do testu immunoenzymortu sprzężonego z GTPazą.
    UWAGA: Nie przechowuj próbek dłużej niż 14 dni. Pracuj szybko i nigdy nie pozostawiaj próbek na lodzie na dłużej niż 10 minut. Nigdy nie dotykaj wszystkich szalek Petriego jednocześnie.
  11. Zmierz stężenie białka za pomocą metody Lowry'ego8 i oblicz objętość buforu do lizy, aby znormalizować stężenie białka między próbkami.
    UWAGA: Najlepsze stężenie to zwykle 1 mg/ml; jednak 0,3 - 2 mg / ml może być wykrywalne.
  12. Przygotować ślepą próbę, dodając 60 μl buforu do lizy i 60 μl buforu wiążącego do mikroprobówki.
    UWAGA: Ślepa próba kontrolna zawiera wszystkie odczynniki z wyjątkiem antygenu i służy do odejmowania tła.
  13. Przygotować kontrolę pozytywną, dodając 12 μl białka kontrolnego Rho, 48 μl buforu do lizy i 60 μl buforu wiążącego.
    UWAGA: Kontrola pozytywna zawiera wszystkie odczynniki oraz potwierdzony antygen dla Rho-A-GTP.
  14. Wyjmij płytkę powinowactwa Rho z torby i umieść ją na lodzie.
  15. Rozpuść proszek w studzienkach w 100 μl lodowatej wody destylowanej. Trzymaj talerz na lodzie.
  16. Rozmrozić zamrożone lizaty komórkowe w łaźni wodnej o temperaturze 25 °C.
  17. Dodać obliczoną objętość lodowatego buforu do lizy (z kroku 2.11) do każdej próbki, aby znormalizować stężenie białka.
    UWAGA: Wyjmij PBS po umyciu komórek (za pomocą aspiratora próżniowego), aby uniknąć powodowania zmian w składzie buforu do lizy. Wyrównaj białko próbki do stężenia od 0,8 do 2 mg/ml, aby uzyskać dokładne porównanie próbek w testach aktywacji GTPazy. Tabela 2 zawiera szczegółowe informacje na temat buforu, który ma być użyty do tego testu.
  18. Przenieść 60 μl znormalizowanych, lodowatych próbek do mikroprobówek i dodać 60 μl buforu wiążącego; dokładnie wymieszać próbki i trzymać je na lodzie.
  19. Całkowicie usuń wodę/roztwory z mikropłytki energicznie trzepiąc, a następnie wykonaj pięć do siedmiu twardych stuknięć w matę laboratoryjną.
  20. Dodać 50 μl znormalizowanych próbek, ślepą próbę kontrolną i kontrolę dodatnią do studzienek w dwóch egzemplarzach.
  21. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 30 minut w temperaturze 4 °C przy 300 obr./min.
    UWAGA: Krok wytrząsania jest bardzo ważny i zaleca się używanie wytrząsarki z płytą orbitalną przy 300 obr./min.
  22. Usunąć próbki z płytki przez strzepnięcie i umyć je 2x 200 μl buforu płuczącego w temperaturze pokojowej. Po każdym płukaniu energicznie usunąć bufor płuczący z dołków przez strzepnięcie, a następnie stukanie, i trzymać płytkę na stole w temperaturze suchej masy.
  23. Dodać 200 μl buforu prezentującego antygen RT do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
  24. Wytrzepać roztwór ze studzienek i przemyć studzienki 3x 200 μl buforu płuczącego w temperaturze pokojowej.
  25. Do każdej studzienki dodać 50 μl świeżo przygotowanego przeciwciała pierwszorzędowego 1/250 anty-RhoA.
  26. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 45 minut przy 300 obr./min ustawionej na 25 °C. Wytrzepać roztwór ze studzienki.
  27. Powtórz kroki prania 2x (krok 2.24).
  28. Dodać 50 μl świeżo przygotowanego przeciwciała drugorzędowego 1/250 anty-RhoA do każdej studzienki.
  29. Umieścić płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 45 minut przy 300 obr./min ustawionych na 25 °C.
  30. Przygotować odczynnik do wykrywania HRP, mieszając równe objętości odczynnika A i odczynnika B.
  31. Wytrzepać roztwór z każdej studzienki i przemyć studzienki 3x 200 μl buforu płuczącego w temperaturze pokojowej.
  32. Dodać 50 μl świeżo przygotowanego odczynnika do wykrywania HRP do każdego dołka.
  33. Odczytaj sygnał luminescencyjny w ciągu 3 - 5 minut, aby uzyskać maksymalny sygnał i przeanalizować wyniki za pomocą odpowiedniego pakietu oprogramowania.
    UWAGA: Odczyty muszą być wykonane w ciągu 3 - 5 minut, aby uzyskać maksymalny sygnał. Uruchom "płytkę testową", aby potwierdzić, że dla lizatów komórkowych używana jest odpowiednia objętość buforu do lizy, tak aby stężenie białka było wystarczająco wysokie, aby wykryć aktywność GTPazy RhoA. (Płytka testowa jest płytką komórek używaną do określenia, czy stężenie białka mieści się w dopuszczalnym zakresie, a także do określenia, czy objętość stosowanego buforu do lizy jest odpowiednia). Kontrola dodatnia powinna być od 4 do 10 razy wyższa niż studzienki ślepe, jeśli mieści się w zakresie liniowym. Jeśli nie, wyreguluj luminometr, konsultując się z producentem. Ustawienia luminometru podano w tabeli 3.
  34. Wprowadź nieprzetworzone dane w kolumnach, w których nagłówki brzmią Próbka, Średnia, Odchylenie standardowe, rep1, rep2, rep3 i rep4, co ma pokazać liczbę powtórzeń wykonywanych na każdej próbce.
  35. W polu Średnia wprowadź formułę = średnia (Xn:Yn), gdzie X = oznaczenie kolumny dla rep1, Y = oznaczenie kolumny dla rep4, a n = oznaczenie wiersza wiersza, nad którym pracujesz.
  36. W polu Odchylenie standardowe wprowadź formułę =odch.standardowe (Xn:Yn), gdzie X = oznaczenie kolumny dla rep1, Y = oznaczenie kolumny dla rep4, a n = oznaczenie wiersza wiersza, nad którym pracujesz.
  37. Wprowadź dane replikacji do rep1, rep2 itd.
  38. Po wprowadzeniu danych użyj metody "kliknij i przeciągnij", aby wybrać próbkę, średnią i odchylenie standardowe.
  39. Następnie w oprogramowaniu do analizy danych wybierz funkcję tworzenia wykresów, która wygląda jak kwadrat z mini wykresem słupkowym w środku.
    UWAGA: Spowoduje to wyświetlenie procesu tworzenia wykresów, w którym możliwe jest projektowanie wykresów na podstawie wprowadzonych danych.
  40. Wybierz wykres kolumnowy, a w polu wartości wejściowych wyznacz wartość Liczby średnie.
    UWAGA: Najpierw tworzony jest wykres dla średnich liczb, a następnie wyznaczana jest kolumna Odchylenie standardowe dla słupków błędów osi y. Aby to zrobić, kliknij dwukrotnie paski wykresu, wybierz kartę Błąd osi Y, kliknij opcję Niestandardowe i wybierz obszar w arkuszu, aby wprowadzić lokalizację danych odchylenia standardowego. Różnicę między grupami, które należy porównać, można zobaczyć po utworzeniu pożądanych wykresów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Frakcjonowanie membranowe:

Ultrawirowanie było używane do frakcjonowania składników błony i cytozolu. Jak pokazano na Rysunek 1, supernatant zawiera frakcję cytozolową, a osad zawiera frakcję błonową. Liczebność RhoA we frakcjach cytozolowych i błonowych uzyskanych z komórek U251 badano po leczeniu symwastatyną z zastosowaniem immunoblottingu. Czystość i kontrolę obciążenia błony i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy dokładną metodę pomiaru małej prenylacji GTPazy i wiązania GTP, pokazanej jako mała lokalizacja subkomórkowa GTPazy (błona kontra cytozol) i obciążenie Rho GTP. Małe GTPazy ulegają ekspresji w komórkach eukariotycznych i odgrywają istotną rolę w proliferacji, ruchliwości i strukturze komórek. Zarówno prenylacja, jak i wiązanie GTP biorą udział w regulacji aktywności GTPazy; w związku z tym testy oceniające prenylację i wiązanie GTP tych białek są ważnymi narzędziami dla biologów komórkowych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Saeid Ghavami był wspierany przez Grant Operacyjny Centrum Nauk o Zdrowiu, grant operacyjny CHRIM oraz Grant Operacyjny dla Nowych Badaczy Research Manitoba. Javad Alizadeh był wspierany przez stypendium Research Manitoba. Shahla Shojaei otrzymała wsparcie w postaci grantu operacyjnego Fundacji Nauk o Zdrowiu oraz stypendium podoktorskiego MITACS Accelerate. Adel Rezaei Moghadam otrzymał wsparcie z grantu operacyjnego NSERC, którego właścicielem był Joseph W. Gordon. Amir A. Zeki otrzymał nagrodę NIH/NHLBI K08 (1K08HL114882-01A1). Marek J. Łoś dziękuje za wsparcie ze strony LE STUDIUM Institute for Advanced Studies (region Centre-Val de Loire, Francja) w ramach programu Smart Loire General Program i współfinansowanego przez działania "Maria Skłodowska-Curie", grant #665790. Simone da Silva Rosa była wspierana przez stypendium UMGF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM wysoki poziom glukozyVWR (Kanada)VWRL0101-0500
Surowica bydlęcapłodu VWR (Kanada)CA45001-106
Penicylina/StreptomycynaVWR (Kanada)97062-806
EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy)VWR (Kanada)CA71007-118
EGTA (Bis(eter 2-aminoetylowy) glikolu etylenowego (eter 2-aminoetylowy)-N,N,N',N'- Kwas tetraoctowy)VWR (Kanada)CAAAJ60767-AE
DTT (DL-Dithiothreitol)VWR (Kanada)CA97061-340
Nadsiarczan amonuVWR (Kanada)CABDH9214-500G
Tris-hydroksymetyloaminometanVWR (Kanada)CA71009-186
30% akrylamid/Bis roztwórBiorad (Kanada)1610158
TEMEDBiorad (Kanada)1610801
Koktajl inhibitorów proteazySigma/Aldrich (Kanada)P8340-5MLRozcieńczenie 1:75
Zestaw próbników przeciwciał Rho-GTPazySygnalizacja komórkowa (Kanada)9968Rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało Pan-KadherynaSygnalizacja komórkowa (Kanada)4068Rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało GAPDHSanta Cruz Biotechnology (USA)sc-697781:3000 Rozcieńczenie
Test aktywacji RhoA G-LISA (format luminescencji)Cytoskeleton Inc. (USA)BK121Cytoszkielet I. Przewodnik techniczny po testach aktywacji G-LISA. 2016.RhoA
Sygnalizacja komórkowa przeciwciał2117
ECLAmersham-Pharmacia BiotechRPN2209
Anti-Rabbit IgG (cała cząsteczka) Przeciwciało przeciwko peroksydazieSigmaA6154-1ML
SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate ReaderUrządzenia molekularne 1612071ASpektrofotometr
Nonidet P-40Sigma11332473001niedenaturujący detergent, oktylofenoksypolietylen
DMSOSigmaD8418-50ML
PBSSigmaP5493-1L
Koktajl inhibitorów fosfatazySigmaP5726-5MLRozcieńczenie 1:75

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
  2. Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C. The ras protein family: evolutionary tree and role of conserved amino acids. Biochemistry. 30 (19), 4637-4648 (1991).
  3. Hall, A. Rho family GTPases. Biochemical Society Transactions. 40 (6), 1378-1382 (2012).
  4. Rojas, A. M., Fuentes, G., Rausell, A., Valencia, A. The Ras protein superfamily: evolutionary tree and role of conserved amino acids. The Journal of Cell Biology. 196 (2), 189-201 (2012).
  5. Cherfils, J., Zeghouf, M. Regulation of small GTPases by GEFs, GAPs, and GDIs. Physiological Reviews. 93 (1), 269-309 (2013).
  6. Shojaei, S., et al. Perillyl Alcohol (Monoterpene Alcohol), Limonene. Enzymes. 36, 7-32 (2014).
  7. Ghavami, S., et al. Airway mesenchymal cell death by mevalonate cascade inhibition: integration of autophagy, unfolded protein response and apoptosis focusing on Bcl2 family proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (7), 1259-1271 (2014).
  8. Alizadeh, J., et al. Mevalonate Cascade Inhibition by Simvastatin Induces the Intrinsic Apoptosis Pathway via Depletion of Isoprenoids in Tumor Cells. Scientific Reports. 7, 44841(2017).
  9. Ghavami, S., et al. Mevalonate cascade regulation of airway mesenchymal cell autophagy and apoptosis: a dual role for p53. PLoS One. 6 (1), e16523(2011).
  10. Tang, Y., Olufemi, L., Wang, M. T., Nie, D. Role of Rho GTPases in breast cancer. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 759-776 (2008).
  11. DerMardirossian, C., Bokoch, G. M. GDIs: central regulatory molecules in Rho GTPase activation. Trends in Cell Biology. 15 (7), 356-363 (2005).
  12. Garcia-Mata, R., Boulter, E., Burridge, K. The 'invisible hand': regulation of RHO GTPases by RHOGDIs. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 493-504 (2011).
  13. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  14. Ghavami, S., et al. Geranylgeranyl transferase 1 modulates autophagy and apoptosis in human airway smooth muscle. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (4), L420-L428 (2012).
  15. Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC. Nature. 406 (6795), 532-535 (2000).
  16. Ghavami, S., et al. Statin-triggered cell death in primary human lung mesenchymal cells involves p53-PUMA and release of Smac and Omi but not cytochrome c. Biochimica et Biophysica Acta. 1803 (4), 452-467 (2010).
  17. Cordle, A., Koenigsknecht-Talboo, J., Wilkinson, B., Limpert, A., Landreth, G. Mechanisms of statin-mediated inhibition of small G-protein function. Journal of Biological Chemistry. 280 (40), 34202-34209 (2005).
  18. Waiczies, S., Bendix, I., Zipp, F. Geranylgeranylation but not GTP-loading of Rho GTPases determines T cell function. Science Signaling. 1 (12), pt3(2008).
  19. Waiczies, S., et al. Geranylgeranylation but not GTP loading determines rho migratory function in T cells. Journal of Immunology. 179 (9), 6024-6032 (2007).
  20. Satori, C. P., Kostal, V., Arriaga, E. A. Review on Recent Advances in the Analysis of Isolated Organelles. Analytica Chimica Acta. 753, 8-18 (2012).
  21. Berndt, N., Sebti, S. M. Measurement of protein farnesylation and geranylgeranylation in vitro, in cultured cells and in biopsies, and the effects of prenyl transferase inhibitors. Nature Protocols. 6 (11), 1775-1791 (2011).
  22. Keely, P. J., Conklin, M. W., Gehler, S., Ponik, S. M., Provenzano, P. P. Investigating integrin regulation and signaling events in three-dimensional systems. Methods in Enzymology. 426, 27-45 (2007).
  23. Oliver, A. W., et al. The HPV16 E6 binding protein Tip-1 interacts with ARHGEF16, which activates Cdc42. British Journal of Cancer. 104 (2), 324-331 (2011).
  24. Moniz, S., Matos, P., Jordan, P. WNK2 modulates MEK1 activity through the Rho GTPase pathway. Cellular Signalling. 20 (10), 1762-1768 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rho GTPazawykrywanie prenylacjitest wi zania GTPfrakcjonowanie subkom rkoweanaliza Western blotultracentryfugacjatraktowanie symwastatynlinie kom rkowe glejaka wielopostaciowegolokalizacja bia ek

Powiązane artykuły