Artykuł metodologiczny

Izolacja zawartości rezerwuaru gruczołów żuchwowych od borneańskich "eksplodujących mrówek" (Formicidae) w celu analizy objętości za pomocą GC-MS i MetaboliteDetector

DOI:

10.3791/57652

⸱

26 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Analytical Chemistry, Department of Agrobiotechnology (IFA-Tulln), University of Natural Resources and Life Sciences Vienna (BOKU), Austria, 2Institute of Chemical, Environmental and Biological Engineering, TU Vienna, Austria, 3Department of Computational Biology of Infection Research, Helmholtz Centre for Infection Research, Germany, 4Institute for Biochemistry, Biotechnology and Bioinformatics, University of Technology (TU) Braunschweig, Germany, 52nd Zoological Department, Natural History Museum Vienna, Austria, 6Chemical Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei, 7Environmental and Life Sciences, Universiti Brunei Darussalam, Brunei

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niepełnoletni robotnicy gatunku mrówek Colobopsis explodens są preparowani w celu wyizolowania woskowej zawartości przechowywanej w ich przerośniętych zbiornikach gruczołów żuchwowych w celu późniejszej ekstrakcji rozpuszczalnikiem i analizy za pomocą chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Opisano również adnotację i identyfikację składników lotnych za pomocą oprogramowania open source MetaboliteDetector.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie protokołu opisującego analizę metabolomiczną borneańskich 'eksplodujących mrówek' należących do grupy Colobopsis cylindrica (COCY). W tym celu stosuje się model gatunku C. explodens. Mrówki należące do kasty drobnych robotnic posiadają charakterystyczne przerośnięte gruczoły żuchwy (MG). W walce terytorialnej wykorzystują lepką zawartość swoich powiększonych zbiorników gruczołów żuchwowych (MGR) do zabijania rywalizujących stawonogów w charakterystycznych samobójczych "eksplozjach" poprzez dobrowolne pęknięcie powłoki gastralnej (autotyza). Pokazujemy sekcję mrówek robotnic tego gatunku w celu wyizolowania części gastralnej woskopodobnej zawartości MGR, a także wymieniamy niezbędne kroki wymagane do ekstrakcji rozpuszczalnikiem zawartych w nich związków lotnych, a następnie analizę chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) i przypuszczalną identyfikację metabolitów zawartych w ekstrakcie. Procedura preparacji jest wykonywana w chłodnych warunkach i bez użycia jakiegokolwiek roztworu buforowego do rozwarstwiania w celu zminimalizowania zmian w składzie chemicznym zawartości MGR. Po ekstrakcji lotnych metabolitów zawartych w tym roztworze na bazie rozpuszczalnika, przedstawiono etapy niezbędne do analizy próbek za pomocą iniekcji cieczy GC-MS. Na koniec przedstawiono przetwarzanie danych i przypuszczalną identyfikację metabolitów za pomocą oprogramowania open source MetaboliteDetector. Dzięki takiemu podejściu możliwe staje się profilowanie i identyfikacja lotnych metabolitów w MGR mrówek należących do grupy COCY za pomocą GC-MS i oprogramowania MetaboliteDetector.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnym celem przedstawionego tutaj przepływu pracy jest ogólne badanie składu chemicznego w wydzielinach owadów. Odbywa się to przede wszystkim w celu wyjaśnienia ekologicznych ról wydzieliny jako całości lub jej pojedynczych związków. Ponadto jesteśmy zainteresowani badaniem szlaków metabolicznych leżących u podstaw związków znajdujących się w odpowiednich wydzielinach. Szczególnie zawartość gruczołów mrówek (Hymenoptera, Formicidae) zyskała w ostatnich latach coraz większe zainteresowanie, ponieważ stanowi źródło dotychczas niezbadanych związków potencjalnie bioaktywnych (klejów, środków przeciwdrobnoustrojowych itp.)1,2. Drobne mrówki robotnice niektórych gatunków należących do grupy COCY3,4 mogą dostarczać takich związków zawartych w ich przerośniętych MGR, które rozciągają się od aparatu gębowego do gaster5,6. W przypadku zagrożenia ze strony domniemanych wrogów, pomniejsze robotnice C. explodens7 i niektóre pokrewne gatunki mogą wykorzystać zawartość MGR w nietypowy sposób: Poświęcają się, rozrywając ścianę gastralną, aby wyrzucić lepką zawartość MGR wybuchowo na przeciwnika, po czym domniemany wróg zostaje zatrzymany i może nawet zginąć5, 6,8,9. Celem opracowania i zastosowania przedstawionych w niniejszym artykule metod było pogłębienie wiedzy na temat składu chemicznego i charakteru wstępnie toksycznych składników tej wydzieliny mrówek.

W tym celu przedstawiamy protokół do sekcji mrówek robotnic C. eksplodujących, aby uzyskać gastralną część ich woskowej zawartości MGR, a następnie ekstrakcję rozpuszczalnikiem i analizę za pomocą GC-MS.

Analiza GC-MS jest jedną z dobrze znanych metod profilowania i identyfikacji lotnych metabolitów (volatilome) owadów. Typowe anality interesujące mrówki to węglowodory kutykularne10, semiochemicals11 i ogólnie związki o aktywności biologicznej12. Próbki można pobrać z całych zwierząt lub z części ciała i płynów wyizolowanych przez sekcję owada13,14. Techniki przygotowania próbek obejmują ekstrakcję zawartych w nich metabolitów za pomocą rozpuszczalników14 lub mikroekstrakcji do fazy stałej (HS-SPME)15.

Dla badań metabolomicznych ważne jest, aby próbki były szybko zamrażane bezpośrednio po pobraniu próbek, aby zminimalizować zmiany w składzie chemicznym i ilości związków. Mrówki użyte w tym badaniu zostały zabite przez szybkie zamrożenie na miejscu w chłodnej torbie wypełnionej głęboko zamrożonymi zimnymi okładami. Próbki były następnie przechowywane w zamrażarce o temperaturze -20 °C przy użyciu energii elektrycznej napędzanej generatorem, zanim zostały przetransportowane do laboratorium na suchym lodzie. Przedstawiona tutaj procedura preparacji daje możliwość wyizolowania zawartości MGR bez analizowania całej mrówki lub gastera jako całości, jak to miało miejsce wcześniej dla różnych gatunków COCY16,17,18. Co więcej, przedstawiony protokół umożliwia również bezpośredni dostęp i analizę otaczających gruczołów i tkanek, takich jak gruczoł jadowy (VG)5,8, gruczoł Dufoura (DG)8, lub jelita w innych badaniach biologicznych, lub w celu sprawdzenia, czy nie ma ewentualnych zanieczyszczeń krzyżowych wprowadzonych podczas obchodzenia się z mrówkami lub ich sekcji. Aby zminimalizować zmiany w składzie chemicznym zawartości MGR podczas preparacji, zarówno poprzez rozmrażanie próbek, jak i przy użyciu środków chemicznych, proces rozwarstwiania został zoptymalizowany tak, aby można go było przeprowadzić na zimnym opakowaniu (-20 °C), bez użycia dodatkowych, roztworów myjących lub rozpuszczalników. Próbki uzyskane tą metodą nadają się do udzielania odpowiedzi na pytania jakościowe i ilościowe.

Analiza danych w celu przypuszczalnej adnotacji i identyfikacji metabolitów odbywa się za pomocą oprogramowania open-source MetaboliteDetector19, które zostało opracowane do automatycznej analizy danych metabolomicznych opartych na GC-MS. Wykrywa pojedyncze piki jonowe obecne na chromatogramach, przeprowadza etap dekonwolucji i ekstrahuje zdekonwolucyjne widma masowe związków chemicznych zawartych w analizowanych próbkach. Przypuszczalna identyfikacja związków za pomocą MetaboliteDetector opiera się na wyznaczonym wskaźniku retencji (RI; RI Kovatsa może być obliczany automatycznie przez oprogramowanie), a także podobieństwie zdekonwoluowanych widm masowych. RI i współczynnik dopasowania spektralnego mogą być porównywane z istniejącymi bibliotekami referencyjnymi (które można zaimportować, jeśli są w powszechnym formacie NIST) lub z ustaloną biblioteką wewnętrzną. Jest to zgodne z wytycznymi dotyczącymi (przypuszczalnej) identyfikacji związków sugerowanymi np. przez Grupę Roboczą ds. Analizy Chemicznej (CAWG) Inicjatywy Standardów Metabolomicznych (MSI), gdzie co najmniej dwa niezależne i ortogonalne dane dotyczące autentycznego związku (w tym przypadku czas retencji (RT)/RI i widmo masowe) analizowane w identycznych warunkach eksperymentalnych są proponowane jako niezbędne do potwierdzenia identyfikacji metabolitów niebędących nowymi20.

Kompletny eksperyment jest przeprowadzany na zawartości MGR w modelu COCY gatunku C. explodens, ale etapy sekcji mogą być również dostosowane do izolacji innych gruczołów obecnych w mrówce. Ponadto, chociaż przedstawiamy protokół kompleksowej analizy objętości zawartości MGR, bardziej ogólne części przepływu pracy opisujące ekstrakcję, pomiar GC-MS i ocenę danych mogą być również wykorzystywane do analizy i (przypuszczalnej) identyfikacji lotnych metabolitów w ogóle.

Ponieważ eksperymenty opisane w tym manuskrypcie są przeprowadzane na owadach, nie jest wymagana etyczna zgoda. Prace terenowe, pobieranie próbek mrówek, a także ich wykorzystanie do publikacji są zgodne z wytycznymi regulującymi ten projekt przez Universiti Brunei Darussalam, Centrum Badań i Innowacji Brunei oraz Departament Leśnictwa Brunei, Brunei Darussalam.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kolekcja mrówek

  1. Zbieraj drobne mrówki robotnice za pomocą aspiratora (Rysunek 1).
  2. Natychmiast po pobraniu próbek należy utrwalić mrówki przez szybkie zamrożenie w temperaturze -20 °C i przechowywać je w tej lub niższej temperaturze do czasu analizy.

2. Izolacja zawartości MGR i DG od mrówek

  1. Przed sekcją mrówek przygotuj następujące elementy:
    1. Oczyścić szklaną szalkę Petriego i narzędzia do preparacji za pomocą mieszaniny metanolu i wody (MeOH/H2O; 1+1 v/v) i chusteczek.
      UWAGA: MeOH jest toksyczny dla ludzi. Zawsze noś odpowiednie rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary, a czyszczenie wykonuj pod wyciągiem.
    2. Zamrozić zimny okład i szklaną szalkę Petriego do temperatury -20 °C.
    3. Określić masę fiolek z krótkim gwintem o pojemności 1,5 ml wraz z nakrętkami z przegrodami z silikonu/politetrafluoroetylenu (PTFE) i przechowywać je na lodzie bezpośrednio obok mikroskopu.
      Uwaga: Wybór fiolki z próbką jest opcjonalny. W tym przypadku zawartość MGR jest umieszczana bezpośrednio w schłodzonych fiolkach o pojemności 1,5 ml wykonanych ze szkła. Tworzywa sztuczne mogą zawierać związki (np. ftalany), które mogą powodować artefakty, które zakłócają sygnały docelowych metabolitów.
    4. Zamrożony zimny pak należy umieścić w pudełku wykonanym z ekstrudowanej pianki polistyrenowej. Umieść szalkę Petriego na wierzchu zimnego opakowania i włóż do naczynia zamrożoną mrówkę. Zamontuj pudełko pod mikroskopem stereoskopowym. Dostosuj powiększenie (20–40x) i ustaw ostrość, aż cała mrówka będzie wyraźnie widoczna.
  2. Sprawdź zamrożoną mrówkę pod kątem integralności jej komór gastralnych. Do sekcji weź tylko mrówki z nienaruszonym obszarem gasterowym (Ryc. 2A, B). Wyklucz mrówki z płaskimi gastrami lub śladami stwardniałej zawartości MGR na powierzchni ich ciała z dalszej analizy (Rysunek 2C, D).
  3. Chwyć wybraną mrówkę jedną parą kleszczy z cienką końcówką na propodeum (pierwszy segment brzuszny), a drugą parą kleszczy na ogonku liściowym (drugi segment brzuszny). Odłącz obszar gasterowy, delikatnie odciągając go od reszty ciała mrówki (Rysunek 3A).
  4. Napraw teraz oddzielony mrówkowiec, przytrzymując go kleszczami z cienką końcówką na tergicie 4. Kolejną parą kleszczyków z cienką końcówką chwyć tergit 1 (znajdujący się obok ogonka) i delikatnie go usuń, odklejając (Ryc. 3B). Powtórz to również dla tergitów 2 i 3 (Ryc. 3C, D), aż część gastralna MGR (żółta zabarwiona u mrówek robotnic C. eksploduje, ale kolor zawartości MG może wahać się od białego przez żółty do czerwonego u innych gatunków) będzie widoczna w większości.
    Uwaga: Usuwając egzoszkielet, membrana MGR również zostanie częściowo usunięta.
  5. Za pomocą igły preparacyjnej delikatnie usuń woskową zawartość sparowanych MGR, wydrapując je z komory gastralnej (Ryc. 3E). Usuń tylko te części zawartości MGR, które można wyizolować bez pękania innych gruczołów obecnych w mrówce. Jeśli trzeba użyć więcej siły lub wysiłku, aby uzyskać zawartość MGR jako całość, zaakceptuj jej niepełne usunięcie (Rysunek 4).
  6. Zebrać zawartość MGR, delikatnie dotykając jej końcówką igły do preparacji, aż się do niej przyklei. Następnie przenieść zawartość MGR do schłodzonej fiolki z krótkim gwintem 1,5 o znanej masie tara.
    1. Aby usunąć lepką zawartość MGR z końcówki igły do preparacji, należy przesunąć końcówkę igły do ścianki fiolki z próbką i rozsmarować ją na ściance. Zamknąć fiolkę i umieścić ją na lodzie do momentu wyizolowania następnej zawartości MGR.
  7. Aby później sprawdzić, czy próbka zawartości MGR nie jest zanieczyszczona krzyżowo, związkami pochodzącymi z sąsiedniej DG (sekcja 6), należy również pobrać DG od mrówek, w których są one nadal nienaruszone (Rysunek 4) i umieścić je w osobnej fiolce HPLC.
  8. Zawsze czyścić szalkę Petriego i narzędzia do preparacji za pomocą MeOH/H2O (1+1 v/v) podczas zmiany z gruczołu na gruczoł lub z mrówki na mrówkę.
  9. W przypadku jednej próbki analitycznej należy połączyć zawartość zbiornika lub gruczołów wielu mrówek.
    Uwaga: Liczba gruczołów lub ich zawartość użyta do jednej próbki analitycznej może się różnić w zależności od projektu eksperymentu. W tym przypadku połączono zawartość MGR lub DG pięciu mrówek, aby uzyskać jedną próbkę analityczną.

3. Ekstrakcja rozpuszczalnikiem izolowanej zawartości dławika

  1. Oznaczyć masę próbek analitycznych (w tym przypadku zawartość MGR lub sąsiednich gruczołów zebranych z pięciu mrówek).
  2. Dodać lodowaty octan etylu o wysokiej czystości (EtOAc) w stałym stosunku 1:14 w/v i wirować próbki przez 5 minut w schłodzonych warunkach; tutaj w temperaturze 7 °C w laboratorium z termostatem.
  3. Odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze 3 820 x g w temperaturze 7 °C i przenieść supernatanty (około 55–75 μl dla ekstraktu MGR otrzymanego z pięciu mrówek) do wstępnie schłodzonych fiolek o pojemności 1,5 ml z krótkim gwintem zawierających 0,1 ml mikrowkładek. Szczelnie zamknąć fiolki nakrętkami zawierającymi otwory i czerwoną gumą/PTFE septa.
    Uwaga: Jeżeli analiza nie może być przeprowadzona natychmiast, należy przechowywać ekstrakt w temperaturze -80 °C do czasu analizy, ale zaleca się analizę próbek natychmiast po przygotowaniu, aby zminimalizować ryzyko zmian chemicznych podczas cyklu zamrażania/rozmrażania.

4. GC-MS

  1. Aby uzyskać pełną sekwencję pomiarową GC-MS, należy przygotować następujące roztwory, każdy w fiolce z krótkim gwintem o pojemności 1,5 ml:
    1. Przygotować mieszaninę kalibru RI, rozcieńczając dostępne w handlu wzorcowe roztwory alkanów do końcowego stężenia 8 mg/l na związek przy użyciu heksanu.
    2. Przygotować ślepą próbę rozpuszczalnika składającą się z czystego EtOAc.
  2. Umieścić fiolki zawierające 1) Ślepa próba rozpuszczalnika, 2) mieszanina kalibru RI, 3) ekstrakt zawartości MGR i 4) ekstrakt zawartości DG w chłodzonej tacy (10 °C) automatycznego podajnika próbek sprzężonej z chromatografem gazowym (GC).
    Uwaga: Zaleca się zminimalizowanie czasu, w którym każda fiolka jest przechowywana w autosamplerze przed pomiarem. W przypadku próbek krytycznych, takich jak próbka zawartości MGR, fiolkę można umieścić w autosamplerze bezpośrednio przed analizą.
  3. Dla każdej próbki wstrzyknąć podwielokrotność 1 μl do GC-MS w celu rozłożenia chromatograficznego na kolumnie odpowiedniej dla związków docelowych (tutaj: kolumna HP-5MS UI).
    1. Ustaw odpowiednie parametry GC, które mogą wyglądać następująco:
      1. Użyj helu jako gazu nośnego i ustaw stały przepływ kolumny na 1 ml/min. Ustaw rampę temperatury piekarnika zaczynając od 40 °C z zatrzymaniem na 2 minuty, a następnie rampą od 10 °C/min do 330 °C, z czasem podtrzymania 7 minut. Ustaw temperaturę na wlocie na 270 °C.
      2. Wybierz, a jeśli to konieczne, dostosuj proporcje podziału dla wtrysku GC-MS, które skutkują odpowiednimi kształtami i intensywnościami pików dla interesujących związków (Rysunek 5).
        Uwaga: W przedstawionym przykładzie konieczne było zmierzenie ekstraktu DG w stosunku podziału 2:1, a mieszaniny kalibru RI w trybie bez podziału. Ekstrakt zawartości MGR analizowano w stosunku podziału 2:1, a po raz drugi w proporcji 50:1.
      3. Ustawić temperaturę pomocniczą na 350 °C.
    2. Ustawić parametry spektrometru mas (MS) w następujący sposób: temperatura źródła MS 230 °C, temperatura MS Quad 150 °C, zakres skanowania od niskiej masy 30 do wysokiej masy 500, opóźnienie rozpuszczalnika 4,1 min (dla próbek ślepych i eksperymentalnych) lub 6,1 min (dla mieszaniny kalibru RI). Ustaw szybkość skanowania na około 3 skany/s.
      Uwaga: Parametry MS, w szczególności skanowanie MS, częstotliwość próbkowania i czas cyklu, mogą wpływać na wybieranie pików i dekonwolucję widma i muszą być brane pod uwagę przy wyborze ustawień parametrów w celu prawidłowej oceny danych za pomocą oprogramowania MetaboliteDetector.
  4. Po zakończeniu pomiaru wyeksportuj dane jako . Plik projektu AIA (wykonywany tutaj przy użyciu oprogramowania do analizy danych dostarczonego wraz z GC) na przenośnym nośniku danych.
    1. Wybierz punkt menu Plik | Eksportuj dane do formatu AIA..., a następnie zaznacz opcję Utwórz nowy katalog i kliknij przycisk OK. Wybierz żądane miejsce przechowywania (np. dysk flash USB) i kliknij przycisk Otwórz. Wybierz pliki do wyeksportowania i kliknij ikonę --->. Potwierdź, klikając Proces.  

5. Wykrywanie i identyfikacja metabolitów za pomocą oprogramowania MetaboliteDetector

  1. Przed rozpoczęciem analizy plików danych otwórz MetaboliteDetector, wybierz Narzędzia | Ustawienia i ustaw wymagane parametry w następujący sposób (poszczególne arkusze MetaboliteDetector są zaznaczone pogrubioną czcionką):
    1. W arkuszu Wygląd ustaw Skala czasu na Min i włącz opcję Etykiety osi.
    2. W arkuszu Dekonwolucja ustaw parametry dla ustawień szczytowych na: Próg szczytu: 10 i Minimalna wysokość szczytu (jednostki szumu): 10. Usuń zaznaczenie opcji włączania korekty linii bazowej. Ustaw parametry wykrywania metabolitów na: Pojemniki/skan: 10, Szerokość dekonwolucji (skany): 5, Wymagana intensywność (% piku podstawowego): 0 i Wymagana liczba pików: 10.
    3. W arkuszu Identyfikacja ustaw opcję Wyszukiwanie w bibliotece na: Biblioteka złożona: "CalibrationLibrary_Alkanes" i na NIST (biblioteka sqlite NIST może być dołączona w formacie .lbr). Ustaw parametry w następujący sposób: Max. Różnica RI: 10, Wynik odcięcia: 0,9, Skład czysty/zanieczyszczony: 0,5, Liczba fragmentów: 2, Minimalna liczba identycznych fragmentów: 1. Użyj skalowanej biblioteki: zaznaczone; Wynik podobieństwa: Spec. podobieństwo; Filtr masowy: m/z 207, 221, 281, 355 i 1147 (dla znanych zanieczyszczeń powstających w fazie stacjonarnej kolumny GC).
    4. W arkuszu Kwantyfikacja ustaw parametry na: Liczba jonów do oznaczania ilościowego: 3, Minimalna odległość między kolejnymi jonami: 5 i Minimalny wymagany wskaźnik jakości: 1. Wyklucz jony kwantyfikacji 207, 221, 281, 355 i 1147.
      Uwaga: W przypadku danych MS o wysokiej rozdzielczości należy dodatkowo ustawić następujące parametry w arkuszu Centroid na: Początek progu szczytowego: 10, Koniec progu szczytu: -5 oraz Maksymalna odległość od linii bazowej: 30, FWHM: 0,5.
  2. Zaimportuj pliki w folderze . CDF zawarty w wygenerowanym pliku . Plik projektu AIA jako plik . NetCDF do oprogramowania MetaboliteDetector, wybierając Plik | Import | Import z NetCDF. Wybierz ikonę w kształcie folderu, a następnie wybierz pliki dla kategorii próbek, które mają zostać zaimportowane i przetworzone: 1) Ślepa próba rozpuszczalnika, 2) Kalibry RI, 3) Ekstrakt zawartości MGR i 4) Ekstrakt zawartości DG. Potwierdź przyciskiem OK, aby rozpocząć przetwarzanie danych. Po przetworzeniu wybierz pozycję Zamknij w wyświetlonym oknie.
  3. W celu kalibracji RI i określenia wartości RI dla związków zawartych w ekstrakcie MGR, wybierz Plik | Otwórz i wybierz plik zawierający dane calibrantów RI.
    1. Po otwarciu pliku calibrant RI wybierz ikonę Lupy. Potwierdź pojawiające się okno przyciskiem OK.
    2. Aby uzyskać prawidłową kalibrację RI, sprawdź zakres wykrywalnych alkanów w pliku kalibru RI.
      1. W tym celu należy zaznaczyć trójkąt znajdujący się pod maksimum pierwszego piku, pochodzącego z pierwszego alkanu (o najniższym RT, Rysunek 6) wykrywalnego przez jednokrotne kliknięcie na niego.
      2. Sprawdź trafienie o najwyższym podobieństwie widma ("Spec. sim.", maksymalny wynik = 1) w porównaniu z wpisami w bibliotece alkanów (Rysunek 6).
      3. Aby zweryfikować tożsamość sugerowanego związku alkanowego, porównaj jego widmo masowe ze spektrum masowym podanym w literaturze, np. NIST Chemistry WebBook22.
      4. Oznaczyć ostatni alkan wykrywalny w mieszaninie kalibru RI, licząc do ostatniego piku alkanowego pojawiającego się na chromatogramie.
    3. W celu kalibracji wystąpień zarezerwowanych wybierz pozycję Narzędzia | Kreator kalibracji RI. Wybierz pozycję Dalej.
    4. Kliknij ikonę w kształcie folderu i wybierz plik zawierający chromatogram mieszaniny kalibru RI. Wybierz pozycję Dalej.
    5. Wybierz bibliotekę zawierającą wpisy dla kalibrantów alkanowych w wyświetlonym oknie.
    6. Wybierz wpisy biblioteki wszystkich alkanów wykrywalnych w pliku RI calibrant i kliknij ikonę >>. Po wybraniu >> wybierz pozycję Dalej.
    7. Sprawdź RT wymienione dla każdego wykrywalnego alkanu w wyświetlonej tabeli. W tym celu sprawdź RT przedstawione w oknie głównym dla każdego alkanu, klikając na odpowiedni trójkąt (Rysunek 7). Jeśli to konieczne (Rysunek 8), popraw RT w tabeli kalibracji ręcznie, klikając dwukrotnie odpowiednie pole, wybierając menu rozwijane i wybierając poprawny sugerowany RT. Alternatywnie, wpisz RT za pomocą klawiatury (Rysunek 9).
    8. Gdy RT dla każdego alkanu jest poprawny, wybierz przycisk Dalej. Kliknij przycisk Next (Dalej) w wyświetlonym oknie z tabelą kalibracji wystąpień zarezerwowanych.
    9. Wybierz zielony symbol + w wyświetlonym oknie Wybór chromatogramu, wybierz plik danych ślepej próby rozpuszczalnika i pliki ekstraktów gruczołów, a następnie wybierz przycisk Dalej. Ustaw ustawienia parametrów w wyświetlonym oknie w następujący sposób: Wyłączenie korekty linii bazowej, Próg szczytu: 5, Minimalna wysokość piku: 5, Pojemniki/skanowanie: 10 i Szerokość dekonwolucji: 5. Naciśnij Dalej, a następnie Start, aby wykonać obliczenia RI związków zawartych w wybranych plikach próbki.
  4. W celu adnotacji i identyfikacji wybranych metabolitów w ekstrakcie MGR należy otworzyć plik danych zmierzonego ekstraktu zawartości MGR, dla którego obliczono RI zgodnie z powyższym opisem (krok 5.3.9), wybierając Plik | Otwórz i wybierz żądany plik danych.
    1. Wybierz punkt menu Narzędzia | Ustawienia | Dekonwolucja i zmień próg szczytowy oraz minimalną wysokość piku (jednostki hałasu) na 5. Wybierz ikonę lupy i ponownie potwierdź pojawiające się okno ostrzegawcze przyciskiem OK.
    2. Kliknij na trójkąt znajdujący się pod maksimum interesującego piku i porównaj jego widmo masowe z widmami przechowywanymi w bibliotece NIST, wybierając ikonę NIST.
    3. Wybierz pierwsze wynikowe trafienie wyszukiwania NIST (Rysunek 10) .
    4. Jeśli wynikowe podobieństwo widma związku będącego przedmiotem zainteresowania jest powyżej wybranego wyniku podobieństwa widma (tutaj ≥ 0,9) w porównaniu z wpisem NIST (Rysunek 10), sprawdź RI (dla podobnej fazy stacjonarnej kolumny GC, grubości warstwy i średnicy kolumny) podanej dla tego związku w literaturze (np. NIST Chemistry WebBook22).
    5. Oblicz względną różnicę między referencyjnym RI NIST (lub uśrednionymi RI, gdy podano wiele wartości RI) a eksperymentalnie uzyskanymi RI. Jeśli różnica jest równa lub mniejsza niż określona przez użytkownika maksymalna tolerowana wartość (tutaj ≤ ±1%), oznacz związek jako "z adnotacją".
    6. Powtórz kroki 5.4.2–5.4.5 dla wszystkich interesujących związków zawartych w przykładowym pliku MGR.
    7. W celu identyfikacji związku należy porównać RI i widma masowe roztworów wzorcowych (np. 2–100 mg/l) mierzone w tych samych warunkach, jak opisano w sekcji 4, z widmami związków opisanych w adnotacjach.
    8. Przeanalizować wzorzec, jak wyjaśniono w sekcji 4 i przetworzyć uzyskane dane zgodnie z opisem dla danych dotyczących zawartości alkanów i MGR w krokach 4.4 i 5.2.
    9. Skalibruj dane uzyskane z wzorca, wybierając Narzędzia | Kreator kalibracji RI | Następnie wybierz ten sam plik calibrant RI, który był używany wcześniej. Wybierz przycisk Dalej, a następnie ponownie przycisk Dalej i wybierz plik zawierający dane uzyskane z roztworu wzorcowego, klikając zielony symbol +. Naciśnij Dalej, a następnie Zacznij obliczać RI dla standardowego związku.
      Uwaga: Jeśli analiza wzorca nie może być przeprowadzona natychmiast po analizie próbki, zaleca się ponowną analizę kalibrantów RI i wykonanie nowej kalibracji RI i obliczeń dla wzorca.
    10. Otwórz odpowiedni plik dla standardu i potwierdź jego tożsamość, porównując jego widmo z biblioteką NIST, jak wyjaśniono w kroku 5.4.2.
    11. Po potwierdzeniu tożsamości wzorca dodaj widmo masowe i RI wzorca do wewnętrznej biblioteki. W tym celu należy kliknąć na zielony symbol + i wpisać preferowaną nazwę wpisu bibliotecznego. Potwierdź przyciskiem OK, aby dodać widmo masowe i RI wzorca związku do biblioteki. Jeśli nowy wpis nie jest widoczny w bibliotece, aktywuj przycisk odświeżania.
      Uwaga: Jeśli kalibracja RI została przeprowadzona pomyślnie, RI określone przez MetaboliteDetector pojawi się w odpowiednim wpisie w bibliotece. Po utworzeniu wpisu bibliotecznego dla wzorca możliwa jest identyfikacja tego metabolitu w ekstrakcie MG na podstawie kombinacji RI i podobieństwa widm
      12. .
    12. Ponownie otwórz plik danych zawartości MGR. Wybierz punkt menu Narzędzia | Ustawienia | Identyfikacja. Teraz, gdy RI związku wzorcowego jest obliczane i dodawane do wpisu w bibliotece, zmień wynik podobieństwa z Podobieństwo widma na Wynik łączony.
    13. Kliknij ikonę lupy i wybierz trójkąt pod związkiem, który został opisany w kroku 5.4.5.
    14. Kliknij na trafienie i sprawdź wartość podaną dla "ogólnego wyniku podobieństwa" (OSS, w skrócie Metabolite Detector jako "Ogólne podobieństwo"), biorąc pod uwagę kombinację podobieństwa widma i wyniku podobieństwa RI (Rysunek 11).
      Uwaga: Jeśli trafienie zostało znalezione w bibliotece wewnętrznej, zostanie ono wyświetlone po prawej stronie okna głównego.
    15. Jeśli OSS znajduje się powyżej progu zdefiniowanego przez użytkownika (tutaj ≥ 0,9, oznaczonego również zielonym kolorem trójkąta), oznacz związek jako "zidentyfikowany" (Rysunek 11).

6. Sprawdzenie zawartości ekstraktu MGR pod kątem zanieczyszczeń przez DG Content

  1. Otwórz skalibrowany plik próbki DG, dla której RI związków zostały już obliczone za pomocą MetaboliteDetector (krok 5.3.9).
  2. W celu nałożenia chromatogramu otrzymanego po pomiarze próbki o zawartości MG i próbki DG, należy wybrać Narzędzia | Nałóż chromatogram i wybierz dwa odpowiednie pliki za pomocą zielonej ikony +. Potwierdź przyciskiem OK.
  3. Aby wyświetlić nakładkę, wybierz arkusz nakładki chromatogramu, który pojawi się u dołu okna.
  4. Sprawdź, czy związki nakładają się na siebie między ekstraktem zawartości MGR (Rysunek 12) a ekstraktem zawartości DG i wyklucz nakładające się związki z dalszej analizy zawartości MGR.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny przepływ pracy z listą eksperymentalnych kroków do przypuszczalnej identyfikacji metabolitów w wydzielinach gruczołów C. explodens jest pokazany w Rysunek 13. Ponadto przedstawiono schematyczny przegląd najważniejszych części ciała mrówek robotnic COCY wykorzystanych w prezentowanym eksperymencie jako rysunek uzupełniający S1 A, B. Główne etapy od rozbioru mrówek do przypuszczalnej identyfikacji metabolitu w zawartości MGR zilustrowano na rysunku uzupełniającym S2.

Aby wyizolować zawartość MGR odpowiednią do analizy lotnej, utrzymywano stan schłodzony podczas transportu, przechowywania, a także podczas procesu preparacji. W tym celu mrówki zostały zamrożone natychmiast po ich zebraniu za pomocą aspiratora do owadów (sekcja 1 i Rysunek 1) in situ. Po przechowywaniu przez 2 dni w zamrażarce o temperaturze -20 °C, próbki mrówek przetransportowano na suchym lodzie do Austrii, gdzie natychmiast umieszczono je w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy. Mrówki nadające się do wyizolowania ze względu na zawartość MGR wykazują obszar gasterowy, który jest okrągły i nienaruszony (Rysunek 2A) iw najlepszym przypadku dobrze zaopatrzony w zawartość MGR, jak wskazuje MGR widoczny między tergitami (Ryc. 2B). Gatunki mrówek, które nie nadają się do dalszej analizy, są pokazane w Rysunek 2C, D. Główne kroki (kroki 2.3-2.6) zaangażowane w proces izolacji zawartości MGR od mrówek COCY są zilustrowane na Rysunek 3. Wyizolowana zawartość MGR (żółta w przypadku C. explodens, ale kolory mogą wahać się od białego do czerwonego u innych gatunków należących do grupy COCY) jest pokazana na Rysunek 14.

Podczas preparowania mrówek pod kątem zawartości MGR, należy uważać, aby nie nakłuć ani nie rozerwać żadnych innych gruczołów lub jelit (krok 2.5). Rysunek 4 pokazuje wypreparowany gaster mrówek, który nadal zawiera dwa inne, nienaruszone gruczoły (DG i VG) po wyizolowaniu zawartości MGR. Przykład widocznego zanieczyszczenia zawartością jelit mrówek pokazano na Rysunek 15. Ponieważ nie można całkowicie uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego zawartością DG, znajdującą się poniżej MGR, przedstawiono część protokołu w celu analizy tych gruczołów w celu porównania wynikowych sygnałów z sygnałami z ekstraktu zawartości MGR (sekcja 6). Przy prawidłowym wykonaniu procedury preparacji możliwe jest uzyskanie około 0,75-1,2 mg zawartości MGR na mrówkę. W opisanym tutaj protokole zawartość MGR pięciu mrówek połączono, aby otrzymać powtarzające się próbki po 3,9-5,9 mg każda.

Zawartość izolowanego zbiornika gruczołu została wyekstrahowana za pomocą EtOAc (Sekcja 3) i przeanalizowana przez GC-MS (Sekcja 4). Pomiar zawartości MG ekstraktu z robotnic C. explodens daje chromatogram składający się z pików i widm masowych dla dziesiątek przypuszczalnych związków o zawartości MGR (Rysunek 5). Dwa dominujące metabolity 1-(2,4,6-trihydroksyfenylo)-etanon (ID 4) i 5,7-dihydroksy-2-metylochromen-4-on (ID 5) w ekstrakcie zawartości MG powodowały przeciążenie kolumny, dlatego ta sama próbka została ponownie przeanalizowana w wyższym stosunku podziału 50:1 (Rysunek 5, wstawka). Możliwe zanieczyszczenie krzyżowe zawartości MGR przez składniki DG, na przykład, byłoby widoczne jako dodatkowe piki na chromatogramie GC-MS wykazujące późne RTs, począwszy od około minuty 29 (Rysunek 12). Wykluczenie pików chromatograficznych i widm masowych związków znajdujących się również w ślepej próbie rozpuszczalnika, pochodzących z fazy stacjonarnej kolumny GC lub z zawartości DG obecnej w mrówkogu, a następnie przetworzenie za pomocą oprogramowania MetaboliteDetector dało wynik około 110 związków o zawartości MGR o stosunku sygnału do szumu ≥ 10. W celu późniejszej adnotacji metabolitów i identyfikacji za pomocą oprogramowania MetaboliteDetector, chromatogramy zostały skalibrowane, a wartości RI zostały określone dla mierzonych plików próbek (krok 5.3 i podkroki, Rysunek 6, Rysunek 7, Rysunek 8, Rysunek 9). Wykryte domniemane metabolity zawartości MGR zostały oznaczone adnotacjami w oparciu o kombinację podobieństwa widma do biblioteki NIST, która stanowiła integralną część oprogramowania MetaboliteDetector w przedstawionym przykładzie (krok 5.4 i kroki podrzędne, Rysunek 10). Ponadto wartości RI znalezione w literaturze dla tej samej lub porównywalnej fazy stacjonarnej, grubości warstwy i średnicy kolumny GC zostały uwzględnione w adnotacji złożonej (kroki 5.4.4 i 5.4.5). Po ustaleniu ścisłych kryteriów dopasowania i potwierdzeniu RI i widm masowych za pomocą wzorców, jak wyjaśniono w sekcji protokołu dla jednego standardowego związku (kroki 5.4.7-5.4.15 i Rysunek 11), możliwe było potwierdzenie tożsamości około 10% wykrytych metabolitów. Ponieważ szczegółowy raport na temat objętości zawartości MGR w C. explodens zostanie opublikowany w innym miejscu, niniejsze badanie skupiło się na tych metabolitach, które zostały już opisane w poprzedniej publikacji Jonesa i wsp.17 (gatunek oznaczony tutaj jako KB02-108; zobacz także Cook et al.23). Tabela 1 zawiera przegląd tych zidentyfikowanych związków.

Schemat eksperymentalnego układu probówki siatkowej z T1 i T2 w systemie chromatograficznym.
Rysunek 1: Schematyczny rysunek aspiratora do owadów. W pokrywce, która zamyka fiolkę lub pojemnik, wykonuje się dwa otwory, przez które wkłada się dwie elastyczne rurki. Otwór jednej probówki (T1), która jest skierowana do wnętrza fiolki, jest uszczelniony siatką wystarczająco drobną, aby zablokować owady. Dodatkowo w rurze wykonane są otwory ułatwiające wymianę powietrza. Koniec probówki T2 jest skierowany ściśle w stronę owadów, które są zasysane do fiolki z próbką poprzez zasysanie przez T1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram segmentacji odwłoka mrówki z oznaczonymi tergitami T1-T5; analiza mikroskopowa w skali 1 mm.
Rysunek 2: Nienaruszony a uszkodzony gaster. (A) Nienaruszony gaster nadający się do sekcji. (B) Nienaruszony gaster prawie całkowicie wypełniony zawartością MGR, nadający się również do sekcji. (C) i (D) złamane gastry mrówek z wyrzuconą i stwardniałą zawartością MGR (żółte), prawdopodobnie pęknięte podczas pęknięcia powłoki gastrowej podczas pobierania próbek. Mrówki te są wyłączone z sekcji, ekstrakcji i dalszej analizy. T: tergit. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Proces preparacji brzucha owadów, obraz mikroskopowy, identyfikacja narzędzia, oznakowane segmenty T1-T4.
Rysunek 3: Główne etapy procesu preparacji. (A) Oddzielenie obszaru gastra od reszty ciała mrówki. (B) Oderwanie egzoszkieletu: tergit 1, tergit 2 (C) i tergit 3, po czym zawartość sparowanych żółtych MGR jest prawie całkowicie widoczna (D). (E) Usunięcie lepkiej zawartości MGR za pomocą igły preparcyjnej. T: tergit. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obraz mikrograficzny wypreparowanej anatomii Drosophila z zaznaczonymi gruczołami (DG) i pęcherzykami (VG).
Rysunek 4: Zapach mrówek po wyizolowaniu zawartości MGR. Można zobaczyć dwa pozostałe gruczoły obecne w gaster (VG: gruczoł jadowy i DG: gruczoł Dufoura). Po usunięciu zawartości MGR (pozostałości po izolacji są widoczne na żółto), obie komory powinny być nadal nienaruszone. Gruczoły te można analizować w taki sam sposób, jak zawartość MGR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres chromatograficzny przedstawiający obfitość związków w funkcji czasu retencji, z podkreśleniem pików noreugeniny.
Rysunek 5: Reprezentatywny chromatogram całkowitego prądu jonów (TIC) ekstraktu o zawartości MGR. Dwa najliczniejsze piki GC-MS skutkowały bardziej symetrycznie ukształtowanymi pikami chromatograficznymi, gdy wybrano wyższy współczynnik podziału (50:1) zamiast zwykłego stosunku 2:1 (patrz wstawka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki chromatografii gazowej; Czas retencji i analiza spektralna dla związków alkanowych, m/z 128.
Rysunek 6: Oznaczanie pierwszego wykrywalnego alkanu w chromatogramie kalibru RI. Wybierany jest trójkąt poniżej maksimum piku pierwszego piku alkanowego. Alkan wymywa się w 6,31 minucie i wykazuje największe podobieństwo widma (tutaj 'Spec. sim.') do pozycji bibliotecznej 'Alkane_C09'. Aby potwierdzić tożsamość alkanów, widmo mas jest porównywane z biblioteką (np. NIST Chemistry WebBook22). W przedstawionym przykładzie nonan jest identyfikowany przez jego jon molekularny o wartości m/z 128. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres chromatograficzny z tabelą kalibracyjną; Analiza czasu retencji dla separacji związków.
Rysunek 7: Kalibracja RI przy użyciu mieszaniny wzorcowej n-alkanów. Plik z danymi kalibru RI został otwarty i wybrano funkcję "RI-Calibration-Wizard". Należy sprawdzić prawidłowe dopasowanie czasu retencji do RI przedstawionego w tabeli kalibracyjnej. RT wynoszący 6,31 min dla alkane_C09 (nonane) jest poprawnie wyświetlany w tabeli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza metodą chromatografii gazowej; Diagram czasów retencji związków i dane kalibracyjne dla alkanów.
Rysunek 8: W tabeli kalibracji wyświetlane są nieprawidłowe RT. RT nie są wyświetlane poprawnie (albo są wyświetlane przez nieprawidłową wartość RT, albo przez brakującą wartość RT wyświetlaną jako -1). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza chromatograficzna; Wykres TIC; konfiguracja kalibracji; dane dotyczące czasu przechowywania; spektrometria mas.
Rysunek 9: Ręczna korekta błędnych RT w tabeli kalibracyjnej. Nieprawidłowe wartości można skorygować ręcznie, wstawiając poprawną wartość RT dla odpowiedniego alkanu, jak pokazano tutaj dla Alkane_C39. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza spektrometrii mas; TIC i wykres widmowy; pokazano proces identyfikacji związku.
Rysunek 10: Porównanie widma masowego wybranego związku z wpisami w bibliotece NIST. Po wybraniu maksymalnego elucji piku po 6,16 min (RI 891) i aktywacji funkcji "NIST-search" (czerwone kółko), wyświetlane jest podobieństwo widma 0,99 dla 2-heptanonu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram chromatograficzny, TIC, porównujący wykryte i biblioteczne związki w celu analizy podobieństwa spektralnego.
Rycina 11: Identyfikacja metabolitu w ekstrakcie zawartości MGR. Widmo masowe i RI pochodzące ze związku eluującego w RI 891 na chromatogramie próbki są porównywane z pozycjami w bibliotece wewnętrznej zawierającymi RI i widma mierzonych związków wzorcowych. Jeżeli "Ogólny wynik podobieństwa" (OSS, w skrócie w detektorze metabolitów jako "Ogólny symil" implementujący widmo masowe i RI) między związkiem w bibliotece wewnętrznej a związkiem w pliku próbki wynosi ≥ 0,9, związek ten określa się jako "zidentyfikowany". W tym przypadku OSS między wpisem w bibliotece wewnętrznej 2-heptanonu a związkiem eluującym w RI 891 wynosi 0,96, co skutkuje identyfikacją 2-heptanonu w ekstrakcie zawartości MGR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykres chromatograficzny; Dufour's vs ekstrakty z gruczołu żuchwowego; Porównanie szczytów, analiza czasu retencji.
Rysunek 12: Nałożenie na siebie skrawków chromatogramu TIC (min. 29 do min 35) ekstraktu DG (kolor czerwony) i ekstraktu zawartości MGR (kolor niebieski). Obszary pików odpowiadające nakładającym się (przypuszczalnym) związkom są wyższe w ekstrakcie z DG niż w ekstrakcie o zawartości MGR; związki te mogą pochodzić z DG i dlatego są uważane za (niewielkie) zanieczyszczenia w ekstrakcie o zawartości MGR. W przypadku ekstraktu o zawartości MGR C. explodens piki chromatograficzne pochodzące z domniemanego zanieczyszczenia DG można znaleźć przy około 29 min. 29 i ta część chromatogramu może być wyłączona z dalszej analizy zawartości MGR. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Schemat blokowy analizy wydzielania mrówek; GC-MS, proces identyfikacji metabolitów, etapy ekstrakcji gruczołów.
Rysunek 13: Schematyczny przebieg pracy od próbek mrówek do adnotacji/identyfikacji metabolitów w ekstraktach zawartości zbiornika gruczołu po analizie GC-MS. Przedstawiony tutaj protokół wyjaśnia wszystkie etapy eksperymentalne, począwszy od wyizolowania zawartości MGR, poprzez rozbiór mrówki i analizę GC-MS, a także ocenę danych (zaznaczonych na czarno). Alternatywnie wydzielina owadów może być również wytwarzana i gromadzona in situ (oznaczona kolorem szarym). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagram rozwoju nasion; porównanie w skali ~1 mm; mikroskopia do badań botanicznych.
Rycina 14: Wyizolowana woskowa zawartość MGR przed ekstrakcją. (A) Zawartość dwóch MGR skleja się ze sobą, ale (B) można je również rozdzielić po odizolowaniu. U C. explodens kolor zawartości MGR jest pomarańczowo-żółtawy, ale u innych gatunków z grupy COCY może wahać się od białego do czerwonego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zbliżenie próbki tkanki (~1 mm) pokazujące uszkodzenia spowodowane oparzeniem, wykorzystywane w analizie kryminalistycznej i badaniach materiałowych.
Rycina 15: Ilustracja izolowanej wydzieliny MGR zanieczyszczonej krzyżowo składnikami jelit owada (brązowa). Tego typu izolaty MGR są wyłączone z ekstrakcji i dalszej analizy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

idMetabolitTrywialna nazwaCiąg InCHIFormuła sumy
1Heptan-2-oneInChI=1S/C7H14O/c1-3-4-5-6-7(2)8/h3-6H2,1-2H3C7H14O
cyfra arabskan-Undekan:InChI=1S/C11H24/c1-3-5-7-9-11-10-8-6-4-2/h3-11H2,1-2H3C11H24
3n-HeptadecaneInChI=1S/C17H36/c1-3-5-7-9-11-13-15-17-16-14-12-10-8-6-4-2/h3-17H2,1-2H3C17H36
41-(2,4,6-trihydroksyfenylo)-etanonMonoacetylofloroglucinolInChI=1S/C8H8O4/c1-4(9)8-6(11)2-5(10)3-7(8)12/h2-3,10-12H,1H3C8H8O4
55,7-dihydroksy-2-metylochromen-4-onNoreugeninInChI=1S/C10H8O4/c1-5-2-7(12)10-8(13)3-6(11)4-9(10)14-5/h2-4,11,13H,1H3C10H8O4

Tabela 1: Metabolity zidentyfikowane w ekstrakcie EtOAc zawartości MGR wyizolowanej z C. eksplodują drobne mrówki robotnice. Przedstawiono wybrane metabolity.

Rysunek uzupełniający S1. Przegląd najważniejszych części ciała należących do mrówek COCY (małych robotnic) przedstawionych w tym manuskrypcie. (A) MGR są pokazane na żółto. Ich część gastralna jest wykorzystywana do analizy lotności. (B) Część gastralna MGR znajduje się poniżej tergitów od 1 do 3. T: tergit. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2. Schematyczny przegląd prezentowanego eksperymentu. Przedstawiono główne etapy od rozbioru mrówki do przypuszczalnej identyfikacji metabolitów obecnych w zawartości MGR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym manuskrypcie przedstawiamy kompletny protokół analizy objętości zawartości znalezionej w przerośniętych MGR C. explodens minor worker mrants. Ponieważ użyte tutaj mrówki mogą "eksplodować" i wyrzucać zawartość MGR w niekontrolowany sposób po dotknięciu kleszczami, zaleca się stosowanie "miękkiej" techniki zbierania, dostarczonej przez aspirator do owadów (ryc. 1). W przypadku niektórych gatunków mrówek, w tym mrówek COCY, może być konieczne ograniczenie maksymalnej liczby mrówek do pięciu osobników na fiolkę o pojemności 50 ml, ponieważ w przeciwnym razie może dojść do samozatrucia mrówek (np . przez nagromadzenie kwasu mrówkowego w przestrzeni nad głową). Do zamrażania mrówek na polu można użyć chłodnej torby wypchanej głęboko mrożonymi zimnymi okładami. Próbki należy szybko zamrozić i przechowywać w chłodnych warunkach (np . -20 °C, najlepiej w temperaturze -80 °C), ale nie zaleca się zabijania i przechowywania mrówek w ciekłym azocie, ponieważ przy tej metodzie zaobserwowano zwiększone uszkodzenie ich gruczołów.

Przedstawiona metodologia preparacji bez buforu i rozpuszczalnika jest odpowiednia do uzyskania woskopodobnej zawartości zbiornika gruczołu żuchwowego, a także innych gruczołów obecnych u zamrożonych mrówek robotnic. W przypadku analizy objętościowej zawartości MGR w C. explodens, głównymi aspektami, które należy wziąć pod uwagę podczas sekcji, są ciągłe chłodzenie mrówki (krok 2.1.4) i minimalizacja zanieczyszczeń krzyżowych próbek MG z innymi zawartościami/płynami gruczołowymi obecnymi w gastrze mrówki (krok 2.5, rysunek 4 i rysunek 15). Znaczna część zamrożonych mrówek może zostać uszkodzona, ponieważ mrówki "eksplodowały" podczas pobierania próbek lub zostały uszkodzone podczas transportu na suchym lodzie z miejsca pobierania próbek do laboratorium. Jeśli obszar gastra jest uszkodzony, mrówki te nie nadają się do dalszej analizy (ryc. 2C, D). Jeśli brakuje tylko czułków i nóg lub są one złamane, mrówki te mogą być nadal wykorzystywane do ekstrakcji zawartości MGR i dalszej analizy. Ponieważ zawartość MGR w schłodzonych mrówkach C. explodens ma konsystencję podobną do wosku, łatwo jest je wyizolować za pomocą igieł preparacyjnych (krok 2.5, rysunek 3E i rysunek 14). Należy zachować dodatkową ostrożność podczas obchodzenia się z lepką zawartością MGR. Może przyklejać się do wszystkiego, co ma z nim kontakt fizyczny, a także często przylega do kleszczy preparacyjnych, co zwiększa ryzyko zanieczyszczenia innych próbek. Konieczne jest jedynie dotknięcie zawartości MGR igłą do preparacji i natychmiastowe przeniesienie jej do szklanych fiolek używanych do ekstrakcji (kroki 2.5 i 2.6). Ponadto zaleca się czyszczenie sprzętu do preparacji mieszaniną MeOH/H2Opodczas przełączania między mrówkami lub typami gruczołów (krok 2.8).

Zawartość gruczołów innych gatunków mrówek może być obecna w stanie ciekłym nawet podczas chłodzenia zimnymi okładami. W takim przypadku cały dławik wraz z membraną może być najpierw odizolowany, a następnie przekłuty w celu uzyskania zawartości. Płynne wydzieliny można również uzyskać za pomocą cienkich pipet kapilarnych. Przy średniej długości ciała około 4-5 mm (bez czułków) robotnice C. explodens należą do mniejszych gatunków z grupy COCY. Ich często spuchnięty gaster ma około 2-2,5 mm długości i 1-1,5 mm szerokości. Robotnice dotychczas największego znanego gatunku z grupy COCY mogą osiągać wielkość około 8 mm długości ciała przy rozmiarze gaster około 3 mm długości i 2,5 mm szerokości. Ponieważ protokół jest dobrze przystosowany do preparowania i badania pojedynczych mrówek i ras tej wielkości różnych gatunków COCY, użyte tutaj narzędzia do preparacji i mikroskop mogą wymagać dostosowania do stosowania w przypadku mniejszych mrówek lub mniejszych narządów. Co więcej, konieczne może być również zwiększenie liczby mrówek w próbce analitycznej.

Podczas preparowania mrówki pod kątem zawartości MGR bardzo ważne jest, aby nie uszkodzić żadnych innych gruczołów ani jelit - których zawartość może spowodować zanieczyszczenie krzyżowe próbki (krok 2.5, rysunek 4 i rysunek 15). W optymalnym przypadku, po ekstrakcji zawartości MGR, DG oraz VG są w widoczny sposób utrzymywane w stanie nienaruszonym (ryc. 4). Zanieczyszczenia zawartością DG, która znajduje się pod MGR, są trudne do całkowitego uniknięcia. Przyczyną takiego stanu rzeczy może być również częściowe naruszenie integralności gruczołu podczas transportu na suchym lodzie z miejsca pobierania próbek do laboratorium. Możliwe jest również, że DG ulegną uszkodzeniu podczas pobierania próbek lub w procesie eksplozji, jak zauważyliśmy w przypadku MGR u wielu badanych mrówek. Ponieważ zawartość DG może być analizowana w taki sam sposób, jak zawartość MGR (sekcje 3 i 4), wyniki można porównać z danymi wynikowymi po analizie próbek zawartości MGR (sekcja 6). W przypadku ekstraktów zawierających MGR otrzymanych z mrówek C. explodens, związki zawarte również w DG zaczynają eluować późno w chromatogramie (ryc. 12). Aby zapobiec pomyleniu związków DG ze składnikami MGR, odpowiednie metabolity można wykluczyć z dalszej analizy. Z badań nad innymi gatunkami mrówek wiadomo, że DG mogą również zawierać (wysoko) lotne związki 1,24, które zazwyczaj eluują się na wczesnym etapie chromatogramu GC.

W poprzednich badaniach dotyczących składu chemicznego zawartości MGR w mrówkach COCY, analizowano całe mrówki lub ich całe gastry 16,17,18,23, podczas gdy tutaj samą zawartość MGR uzyskano poprzez rozbiór mrówek.

Analiza wypreparowanej zawartości MGR pozwala badaczom na przeprowadzenie szerokiego zakresu badań biochemicznych, w tym identyfikację zawartych w nim metabolitów. Z uwagi na to, że przeprowadzone badania koncentrowały się na identyfikacji składników lotnych zawartych w MGR C. explodens, do jego analizy wybrano GC-MS (sekcja 4). W tym celu ekstrakty najlepiej odmierzać natychmiast po przygotowaniu lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy. Należy zauważyć, że (przedłużone) przechowywanie może powodować zmiany chemiczne ekstraktów (patrz uwagi po krokach 3.3 i 4.2). Ponieważ stężenie zawartości MGR może obejmować zakres kilku rzędów wielkości, może być konieczna analiza ekstraktów MGR przy różnych proporcjach podziału GC. Ponieważ dwa główne związki w ekstrakcie MRR z mrówek pobranym w celu zilustrowania protokołu powodowały przeciążenie kolumny, gdy zastosowano stosunek podziału 2:1, próbka ta została przeanalizowana po raz drugi przy wyższym stosunku podziału 50:1 (krok 4.3.1.2 i rysunek 5). Ustawienia parametrów GC-MS przedstawione w rozdziale 4 są odpowiednie dla danych generowanych za pomocą urządzeń GC-MS określonych w Tabeli materiałów. Obok kalibrantów RI (krok 4.1.1) należy również przeanalizować ślepą próbę rozpuszczalnika (krok 4.1.2) w celu rozpoznania niebiologicznych artefaktów i zanieczyszczeń podczas późniejszej analizy danych. W celu identyfikacji metabolitów ważne jest również zmierzenie autentycznych wzorców związków opatrzonych adnotacjami w tych samych warunkach GC-MS, jakie są stosowane do analizy ekstraktów próbek (kroki 5.4.7 i następne). Aby poprawić dokładność i wiarygodność danych końcowych, zaleca się analizowanie wszystkich kategorii próbek (ślepa próba rozpuszczalnika, kalibry RI, ekstrakty próbek i wzorce) w ramach tej samej sekwencji pomiarowej. Ponadto autentyczne wzorce powinny być analizowane w stężeniu porównywalnym do stężenia obserwowanego dla ekstraktów próbek. Pomaga to zwiększyć dokładność wartości RI i podobieństwo między próbką a standardowymi widmami masowymi, co ostatecznie doprowadzi do zwiększonej i bardziej znaczącej adnotacji/identyfikacji metabolitów. W tym celu normy mogą być wielokrotnie mierzone przy użyciu różnych współczynników podziału.

Do identyfikacji metabolitów wykorzystuje się zaawansowane oprogramowanie MetaboliteDetector do dekonwolucji widm oraz RI i porównywania widm z zaimplementowaną biblioteką NIST, a także z ustaloną biblioteką wewnętrzną (sekcja 5). Zaleca się uruchomienie MetaboliteDetector na 64 bitowym systemie operacyjnym opartym na systemie operacyjnym LINUX (np. KUBUNTU) i skopiowanie wygenerowanego *. CDF (krok 4.4) z przenośnego urządzenia do przechowywania danych na lokalny dysk twardy. MetaboliteDetector jest w stanie importować surowe dane GC-MS w formacie centroid lub profile netCDF. Oprogramowanie większości instrumentów GC-MS powinno być w stanie przekonwertować zarejestrowane surowe dane do tego formatu19. Przed rozpoczęciem analizy danych zdecydowanie zaleca się zapoznanie się z literaturą dostępną dla poprzednich wersji oprogramowania MetaboliteDetector w celu zapoznania się z funkcjami i graficznym interfejsem użytkownika 19,25,26.

Do kalibracji RI i późniejszego obliczania wartości RI pików związków obecnych w ekstraktach próbek stosuje się bibliotekę zawierającą RI i widma kalibrantów RI (w tym przypadku n-alkanów). Biblioteka taka może być albo tworzona przez samego siebie, albo może zostać pobrana już istniejąca ("CalibrationLibrary_Alkanes")27. Dostarczona domyślna biblioteka calibrant zawiera RI i widma dla n-alkanów w zakresie od C09 do C39, które zostały przeanalizowane zgodnie z opisem w sekcji 4. Udostępniona biblioteka umożliwia użytkownikom pracującym z detektorem metabolitów bezpośrednie rozpoczęcie procesu kalibracji swoich danych. W razie potrzeby biblioteka ta może być również rozszerzona o dodatkowe wpisy dla kolejnych alkanów. Na podstawie podobieństwa referencyjnych i eksperymentalnie wyprowadzonych RI oraz widm masowych (patrz krok 5.3 i podetapy, rysunek 7, rysunek 8, rysunek 9), można przeprowadzić adnotację lub identyfikację związków (krok 5.4 i podetapy, rysunek 11). Istotne jest również, aby po zautomatyzowanym przetwarzaniu danych za pomocą MetaboliteDetector, użytkownik ręcznie sprawdzał, czy piki są prawidłowo wybierane i dekonwolucje widma, sprawdzając widma masowe leżące pod "trójkątem" dla każdego przypuszczalnego związku będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto, w zależności od oprzyrządowania GC-MS i ustawień parametrów wykorzystywanych do generowania danych, konieczne mogą być adaptacje prezentowanych ustawień MetaboliteDetector. Oprogramowanie MetaboliteDetector jest w stanie wykonać o wiele więcej użytecznych operacji niż wyjaśniono w tym manuspekcie, np. wyświetlanie chromatogramów wyekstrahowanego prądu jonowego (EIC), eksport chromatogramów jako .csv, automatyczna kwantyfikacja partii związków i wiele innych.

Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie może służyć jako sugestia dla eksperymentów przeprowadzanych przez innych badaczy koncentrujących się na izolacji gruczołów lub zawartości gruczołów od owadów, analizie lotylomu, a także identyfikacji metabolitów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tego badania zostało uzyskane za pośrednictwem Wiedeńskiego Funduszu Nauki i Technologii (WWTF) LS13-048 do ISD. Specjalne podziękowania kierujemy do Diane W. Davidson (University of Utah; obecnie na emeryturze) za podzielenie się z nami swoją wiedzą na temat borneańskich mrówek COCY. Dziękujemy administracjom Centrum Badań Terenowych Kuala Belalong (KBFSC) i Universiti Brunei Darussalam (UBD) za zatwierdzenie projektu, a także Departamentowi Leśnictwa Brunei i Centrum Badań i Innowacji Brunei za pozwolenie na zbieranie mrówek oraz zatwierdzenie i wydanie pozwoleń na eksport. Specjalne podziękowania kierujemy do pracowników UBD i KBFSC, zwłaszcza Muhammada Salleha bin Abdullaha Bata, Teddy'ego Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei i Kushan Tennakoon za ułatwienie naszych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka 50 ml, 115 x 28 mm, płaska/stożkowa podstawa PPSarstedt62,559,001patrz rysunek 1 w rękopisie
Rurki PVCRehau290 4489patrz rysunek 1 w rękopisie
Siatka, stal nierdzewna, rozmiar oczek 0,63 mmAntstore1000378patrz rysunek 1 w rękopisie
ZamrażarkaSeverinKS 9890 -20 ° Skrzynka
pianki polistyrenowej C lub niższa, wymiary wewnętrzne 155 mm x 100 mm x 45 mmSzalka Petriego Thorsten Koch4260308590481
, szkło, 100 mm x 15 mmAldrichBR455742
Opakowanie na zimno 150 mm x 100 mmElite Bags1998zamrażanie do -20 ° C
Wiadro z kruszonym lodem
1,5 ml Fiolki z krótkim gwintem, 32 x 11,6 mm, przezroczyste szkło, 1. klasa hydrolityczna, szeroki otwórLa-Pha-Pack11090500
Zakrętki do 1,5 ml Fiolki z krótkim gwintem, zamknięte, Silikon biały/PTFE czerwona przegroda, 55° Shore A, 1,0 mmLa-Pha-Pack9151799
Mikroskop stereoskopowyBresser5806100
Kleszcze, bardzo cienka końcówka zakrzywionaMedizinische Instrumente May, Norman MayPI-0005B
Kleszcze, bardzo cienka końcówkaprosta niebieskaINOXBL-3408
Igła do preparowania 140 mm, spiczasta, prostaHeinz Herenz Medizinalbedarf GmbH1110301
Metanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haë nfisher scientific15654740
Woda
Rotizell-Tissue-Tü cherCarl Roth GmbH + Co.KG0087.2
Ester etylowy kwasu octowego ROTISOLV ≥ 99,8 %Carl Roth GmbH + Co.KG4442.1zamrożenie do -20 stopni; C
Vortex Genie 2neoLab7-0092
0,1 ml mikrowkładki do 1,5 ml fiolki z krótkim gwintem, 31 x 6 mm, szkło bezbarwne, 1. klasa hydrolityczna, końcówka 15 mm La-Pha-Pack06090357
Zakrętki do fiolek z krótkim gwintem 1,5 ml, z otworem, przegroda RedRubber/PTFE,  45° shore A, 1,0 mmLa-Pha-Pack9151819
Alkanowy roztwór wzorcowy C8-C20Sigma-Aldrich 04070
Wzorcowy roztwór alkanów C21-C40Sigma-Aldrich 04071
n-Hexane SupraSolvMerck104371
GC-autosampler, np. MPS2XL-TwisterGerstel
Agilent Chromatograf gazowy 6890 NAgilent Gooseneck
splitless LinerRestek22406
Helium (5.0 - F50)Messer102532501
Kolumna kapilarna GC HP-5MS UI 30 m i razy; 0,25 mm i razy; 0,25 &mikro; mAgilent19091S-433UI
Selektywny detektor masy Agilent 5975BAgilent
MSD ChemStation Oprogramowanie aplikacyjne Oprogramowanie Agilent
MetaboliteDetector (3.1.Lisa20170127Ra-Linux)Hiller Kdo pobrania z: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
Biblioteka kalibracji dla MetaboliteDetectorHiller Kdo pobrania z: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
MD Conversion Tool dla bibliotekiNIST Hiller Kdo pobrania z: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10
z destylowana

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, E. D. Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae). Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).
  2. Betz, O. Biological adhesive systems. , Springer. 111-152 (2010).
  3. Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae). Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183(2016).
  4. Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex. Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).
  5. Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'. Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).
  6. Davidson, D., et al. An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species). Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).
  7. Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).
  8. Maschwitz, U., Maschwitz, E. Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern. Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).
  9. Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest. Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).
  10. Martin, S., Drijfhout, F. A review of ant cuticular hydrocarbons. Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151(2009).
  11. Pickett, J. Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones. , Springer. 299-309 (1990).
  12. Tragust, S., et al. Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison. Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).
  13. Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination. Frontiers in Zoology. 5 (1), 16(2008).
  14. Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants. Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).
  15. Augusto, F., Valente, A. L. P. Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).
  16. Davidson, D. W., et al. Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment. Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).
  17. Jones, T., et al. The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex). Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).
  18. Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei. Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).
  19. Hiller, K., et al. MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis. Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).
  20. Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).
  21. Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).
  22. NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from: http://webbook.nist.gov/chemistry/ (2018).
  23. Cook, S. C., Davidson, D. W. Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants. Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).
  24. Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review. Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).
  25. Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation (2010).
  26. Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from: http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf (2012).
  27. Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza GC MSoprogramowanie MetaboliteDetectorsekcja mr wekekstrakcja rozpuszczalnikowaekstrakcja octanem etyluchromatografia gazowaspektrometria masidentyfikacja metabolit w

Powiązane artykuły