Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naprawa dwuniciowych pęknięć (DSB) w DNA jest wysoce skoordynowanym procesem, wymagającym tworzenia i rozwiązywania wielobiałkowych kompleksów naprawczych. Proces ten jest regulowany przez niezliczoną ilość białek, które sprzyjają asocjacji i dysocjacji białek z tymi zmianami. W dużej mierze dzięki możliwości wykonywania funkcjonalnych badań przesiewowych ogromnej biblioteki białek, istnieje większe uznanie dla genów niezbędnych do naprawy pęknięć dwuniciowego DNA. Często badania przesiewowe nokautów lub inhibitorów chemicznych identyfikują białka zaangażowane w procesy naprawcze poprzez wykorzystanie zwiększonej toksyczności jako markera białka, które jest wymagane do naprawy DSB. Chociaż analiza funkcjonalna jest przydatna do identyfikacji nowych białek komórkowych zaangażowanych w utrzymanie wierności genomu, wymaga określenia, czy białko będące przedmiotem zainteresowania sprzyja lokalizacji, tworzeniu lub rozdzielczości kompleksów naprawczych.
Nagromadzenie białek naprawczych można łatwo wykryć jako odrębne ogniska jądrowe za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. W ten sposób asocjacja i dysocjacja tych białek w miejscach uszkodzenia DNA może być dostępna, obserwując te ogniska jądrowe w reprezentatywnych odstępach czasu po indukcji pęknięć dwuniciowego DNA. Podejście to może również zidentyfikować nieprawidłowo zlokalizowane białka czynnika naprawczego, jeśli defekty naprawy nie występują jednocześnie z niepełnymi opóźnieniami w naprawie. W tym scenariuszu długotrwałe pęknięcia dwuniciowego DNA można zaprojektować poprzez ekspresję rzadkiej endonukleazy tnącej (np. I-SceI) w komórkach, w których miejsce rozpoznania wspomnianego enzymu zostało zintegrowane z genomem komórkowym. Powstała zmiana jest szczególnie trudna do usunięcia, ponieważ wierna naprawa ponownie wprowadzi miejsce rozpoznania enzymu, powodując kolejną rundę rozszczepienia. W rezultacie eliminowane są różnice w kinetyce naprawy. Jeśli kompleksy naprawcze nie zostaną utworzone, lokalizacja została utrudniona. Protokół ten opisuje metodologię niezbędną do identyfikacji zmian w kinetyce naprawy, a także lokalizacji białek naprawczych.
Wprowadzenie
Każdego dnia, każda komórka w ludzkim ciele jest bombardowana około 10 000 zmian DNA1. To egzystencjalne zagrożenie naraża nas na ryzyko mutacji, onkogenezy, a także śmierci komórek. Aby chronić wierność genomu, komórki ssaków ewoluowały, aby reagować na uszkodzenia DNA za pomocą złożonej serii asocjacji i modyfikacji białek. Odpowiedź ta jest zorganizowana w wiele ścieżek, znanych jako odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR)2,3. DDR polega na akumulacji białek naprawczych DNA w uszkodzeniach DNA, skoordynowanych zarówno czasowo, jak i przestrzennie. DDR często indukuje zatrzymanie cyklu kom....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Proszę zauważyć, że ten protokół jest napisany dla komórek U2OS zawierających stronę rozpoznającą I-SceI18. Komórki nie muszą być U2OS, ale muszą zawierać lokację I-SceI. Może być konieczne dostosowanie protokołu (np. liczby wysianych komórek i czasu inkubacji) w zależności od rodzaju użytych komórek.
1. Definiowanie kinetyki formacji kompleksu naprawczego DSB
- Hoduj komórki U20S-DRGFP na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej, aż do 85–90% zlewania się.
- Usunąć pożywkę i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) w 3 ml EDTA przez 2 minuty.
- Zastąp EDTA 1 ml trypsyny i inkubu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 1 przedstawia dobór odpowiedniej dyskryminacji szumu dla kwantyfikacji maksimów/ognisk (foci) przy użyciu programu ImageJ. Na lewym panelu znajdują się obrazy scalone DAPI oraz badanego białka naprawczego. Rysunek 1A pokazuje dyskryminację szumu na poziomie 90 i zaznacza prawidłową liczbę ognisk. Jądra na krawędzi (wskazane różową strzałką) oraz ogniska poza jądrami (wskazane żółtą strzałką) nie są liczone podczas kwantyf.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Analiza naprawy uszkodzeń DNA w ogóle, a w szczególności naprawy pęknięć dwuniciowego DNA, jest aktywnym obszarem badań, ponieważ jej konsekwencje obejmują nowotworzenie i podstawową biologię 6,20. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje podejście, które dokładnie analizuje udział białek RAD51 i γ-H2AX w rozdzielczości DSB poprzez HR. Patrząc w przyszłość, metoda ta może być wykorzystana do wyjaśnienia dodatkowych funkcji białek naprawczych w DSB14
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Joelowi Sannemanowi i dr Philine Wangemann z Confocal Microscopy Core, finansowanemu przez Kansas State University College of Veterinary Medicine, za ich wsparcie wysiłków na rzecz rozwoju tej techniki. pCBASceI był prezentem od Marii Jasin (plazmid Addgene # 26477)30. Komórki U2OS DR-GFP były miłym prezentem od Marii Jasin18.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szkiełka nakrywkowe 12 mm | VWR | 89015-725 | |
| 16% paraformaldehyd (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-dołkowa płytka | VWR | 82050-892 | |
| 96-dołkowa szklana płyta dolna | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anty-Rad51 (D4B10) | Wtyczka Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats dla ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, | ThermoFisher Scientific 12100046 ThermoFisher Scientific | Invitrogen | |
| 15576-028 | |||
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Kozia IgG Anty-Królicza Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Nadtlenek wodoru | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| Oprogramowanie ImageJ | Narodowy Instytut Zdrowia (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Wektor ekspresji SceI | Addgene | 26477 | |
| Lakier do paznokci - Insta Dri | Sally i Hansen | Wyraźnie szybkie (103) | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciu | Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Odczynnik do transfekcji TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
Bibliografia
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
