Artykuł metodologiczny

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

DOI:

10.3791/57653

⸱

8 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Bristol Medical School, Translational Health Sciences, University of Bristol

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naprawa dwuniciowych pęknięć (DSB) w DNA jest wysoce skoordynowanym procesem, wymagającym tworzenia i rozwiązywania wielobiałkowych kompleksów naprawczych. Proces ten jest regulowany przez niezliczoną ilość białek, które sprzyjają asocjacji i dysocjacji białek z tymi zmianami. W dużej mierze dzięki możliwości wykonywania funkcjonalnych badań przesiewowych ogromnej biblioteki białek, istnieje większe uznanie dla genów niezbędnych do naprawy pęknięć dwuniciowego DNA. Często badania przesiewowe nokautów lub inhibitorów chemicznych identyfikują białka zaangażowane w procesy naprawcze poprzez wykorzystanie zwiększonej toksyczności jako markera białka, które jest wymagane do naprawy DSB. Chociaż analiza funkcjonalna jest przydatna do identyfikacji nowych białek komórkowych zaangażowanych w utrzymanie wierności genomu, wymaga określenia, czy białko będące przedmiotem zainteresowania sprzyja lokalizacji, tworzeniu lub rozdzielczości kompleksów naprawczych.

Nagromadzenie białek naprawczych można łatwo wykryć jako odrębne ogniska jądrowe za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. W ten sposób asocjacja i dysocjacja tych białek w miejscach uszkodzenia DNA może być dostępna, obserwując te ogniska jądrowe w reprezentatywnych odstępach czasu po indukcji pęknięć dwuniciowego DNA. Podejście to może również zidentyfikować nieprawidłowo zlokalizowane białka czynnika naprawczego, jeśli defekty naprawy nie występują jednocześnie z niepełnymi opóźnieniami w naprawie. W tym scenariuszu długotrwałe pęknięcia dwuniciowego DNA można zaprojektować poprzez ekspresję rzadkiej endonukleazy tnącej (np. I-SceI) w komórkach, w których miejsce rozpoznania wspomnianego enzymu zostało zintegrowane z genomem komórkowym. Powstała zmiana jest szczególnie trudna do usunięcia, ponieważ wierna naprawa ponownie wprowadzi miejsce rozpoznania enzymu, powodując kolejną rundę rozszczepienia. W rezultacie eliminowane są różnice w kinetyce naprawy. Jeśli kompleksy naprawcze nie zostaną utworzone, lokalizacja została utrudniona. Protokół ten opisuje metodologię niezbędną do identyfikacji zmian w kinetyce naprawy, a także lokalizacji białek naprawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Każdego dnia, każda komórka w ludzkim ciele jest bombardowana około 10 000 zmian DNA1. To egzystencjalne zagrożenie naraża nas na ryzyko mutacji, onkogenezy, a także śmierci komórek. Aby chronić wierność genomu, komórki ssaków ewoluowały, aby reagować na uszkodzenia DNA za pomocą złożonej serii asocjacji i modyfikacji białek. Odpowiedź ta jest zorganizowana w wiele ścieżek, znanych jako odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR)2,3. DDR polega na akumulacji białek naprawczych DNA w uszkodzeniach DNA, skoordynowanych zarówno czasowo, jak i przestrzennie. DDR często indukuje zatrzymanie cyklu komórkowego, aby uniknąć propagacji lub intensyfikacji uszkodzeń, które mogą wystąpić podczas replikacji uszkodzonego DNA2,4,5. Z kolei dla żywotności komórkowej konieczne jest również wyłączenie zatrzymania cyklu komórkowego poprzez odłączenie kompleksów naprawczych po zakończeniu naprawy.

Wśród różnych rodzajów uszkodzeń DNA, DSB są najbardziej szkodliwe. Brak naprawy DSB może skutkować rearanżacjami chromosomów lub delecjami na dużą skalę, takimi jak utrata całych ramion chromosomów. Naprawa DSB jest podzielona na dwie ścieżki6,7,8. Rekombinacja homologiczna (HR) wymaga chromosomu siostrzanego do użycia jako matrycy DNA, a zatem jest ograniczona do późnych faz S i G2/M cyklu komórkowego9,10. Niehomologiczne łączenie końcowe (NHEJ) nie ma tych ograniczeń, ale może powodować małe usunięcia podczas naprawy DSBs11,12.

Naprawa DSB i ogólnie DDR są aktywnymi obszarami badań. Pomimo tego, że są zorganizowane w dogodnie oddzielone ścieżki, istnieje duża redundancja. Rzeczywiście, wiele białek (na przykład BRCA1, BRCA2 i kompleks RPA) jest zaangażowanych w wiele szlaków13,14,15,16. Naprawa uszkodzenia przez jedną ścieżkę może prowadzić do pośredniego uszkodzenia, które musi zostać naprawione przez inną ścieżkę14. Przeplatanie się tych szlaków, w połączeniu z ich złożonym zadaniem rekrutacji odpowiednich białek we właściwe miejsce przez dokładnie niezbędny czas, wymaga wielopoziomowego procesu regulacyjnego.

Niedawny raport podkreśla zawiłości DDR, pokazując, że tworzenie kompleksów naprawczych, rozdzielczość i lokalizacja mogą być oddzielnie zakłócone17. Ogólnym celem poniższego protokołu jest ostateczne zbadanie zdolności komórek do naprawy DSB. Za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej można uwidocznić akumulację białek naprawczych w miejscach uszkodzenia w reprezentatywnych punktach czasowych po indukcji DSB.

Ta technika ma kilka zalet w porównaniu z powszechnie stosowanymi podejściami. Często naprawa jest badana w pojedynczych punktach czasowych i nie jest w stanie odwzorować dynamicznego procesu montażu i dysocjacji kompleksów naprawczych. Obserwowanie pełnego zakresu naprawy od początkowej aktywacji do pełnej rozdzielczości zapewnia, że opóźnienie naprawy nie zostanie błędnie zidentyfikowane jako całkowite zahamowanie. I odwrotnie, zapewnia, że indukcja reakcji naprawczej, która nie jest w stanie dezaktywować tej reakcji, nie jest błędnie identyfikowana jako normalna lub nadmierna aktywacja.

Opóźnione tworzenie kompleksu białkowego i błędna lokalizacja białek naprawczych, jednak nie mogą być jednoznacznie odróżnione przy tym podejściu. Aby ustalić, czy białka naprawcze są nieprawidłowo zlokalizowane, czy opóźnione w ich lokalizacji, można wprowadzić "długotrwały" DSB poprzez enzymatyczne rozszczepienie komórkowego DNA. Powstała zmiana jest ponownie wycinana za każdym razem, gdy jest naprawiana, co skutkuje wyraźnym dużym skupieniem na naprawie jądrowej i usuwa czasowe ograniczenie rekrutacji. Można to osiągnąć poprzez modyfikację istniejącego podejścia za pomocą rzadkiej endonukleazy tnącej (np. I-SceI) w celu wywołania długotrwałego DSB. Długowieczność DSB umożliwia wizualizację nieuchwytnych białek naprawczych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Zwiększona liczebność może również poprawić wizualizację, gdy wykrycie jest utrudnione przez ograniczenie jakości przeciwciał, co może być przydatne, gdy mniej zbadane białka zostaną zidentyfikowane jako mające wpływ na naprawę DNA.

Zwłaszcza, że udostępniamy wyraźne instrukcje dotyczące darmowego oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów (np. ImageJ). Usuwa to główną barierę finansową w analizie obrazu, otwierając badania nad naprawą uszkodzeń DNA dla szerszego grona odbiorców.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proszę zauważyć, że ten protokół jest napisany dla komórek U2OS zawierających stronę rozpoznającą I-SceI18. Komórki nie muszą być U2OS, ale muszą zawierać lokację I-SceI. Może być konieczne dostosowanie protokołu (np. liczby wysianych komórek i czasu inkubacji) w zależności od rodzaju użytych komórek.

1. Definiowanie kinetyki formacji kompleksu naprawczego DSB

  1. Hoduj komórki U20S-DRGFP na 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej, aż do 85–90% zlewania się.
  2. Usunąć pożywkę i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) w 3 ml EDTA przez 2 minuty.
  3. Zastąp EDTA 1 ml trypsyny i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Upewnij się, że komórki są oderwane od powierzchni płytki, oglądając ją pod mikroskopem. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modify Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny.
  4. Oznaczyć stężenie komórek w tej zawiesinie za pomocą hemocytometru i metody wykluczania błękitu trypanowego.
  5. Wysiew 6 x 103 komórek/basenik w 200 μl 96-dołkowej płytki ze szklanym dnem. Alternatywnie, wysiewaj 4 x 106 komórek w 8 ml na 12 mm szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na 10 cm płytce.
    UWAGA: Każda studzienka lub szkiełko nakrywkowe reprezentuje pojedynczy punkt czasowy, w tym kontrolę.
  6. Hoduj komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  7. Wywoływanie DSB
    1. Zastąpić pożywkę z płytki 96-dołkowej/10 cm naczyniemH2O2rozcieńczonym do stężenia 25 μM za pomocą DMEM + 10% FBS i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    2. Umyj komórki 3x 1x PBS i zastąp świeżym DMEM uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 0, 1, 4, 8, 24 i 48 godzin. Upewnić się, że w każdym doświadczeniu stosuje się świeże rozcieńczenia H2O2.
      UWAGA: Aby uniknąć zabijania komórek przy zastosowanym tutaj stężeniuH2O2, upewnij się, że dawka uszkodzenia jest na tyle niska, aby większość komórek uniknęła apoptozy i starzenia się. Bardzo ważne jest, aby obserwować proces rekonwalescencji. Najlepiej osiągnąć to poprzez pomiar wrażliwości na różne dawki. Wykonaj test MTT lub inny test żywotności komórek, aby określić minimalne stężenie nadtlenku wodoru, które można zastosować.
  8. Utrwalanie i przepuszczalnie komórek
    1. Umyj komórki 3 razy za pomocą 1x PBS. Usuń szkiełko nakrywkowe z płytki o średnicy 10 cm dla każdego punktu czasowego i umieść je w jednym dołku płytki 24-dołkowej w celu zamocowania. Użyj igły i kleszków, aby ostrożnie usunąć szkiełko nakrywkowe i uniknąć zarysowania komórek z powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    2. Utrwalić komórki przez inkubację przez 15 minut z 4% paraformaldehydem (PFA) w wyznaczonych porach po 1 godzinie ekspozycji na H2O 2 i świeżej wymianie DMEM (0, 1, 4, 8, 24 i 48 godzin).
    3. Umyj utrwalone szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą PBS. Przepuszczalność komórek za pomocą 0,5% niejonowego detergentu rozcieńczonego w 1x PBS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, przed przemyciem 3x PBS.
      UWAGA: Po przepuszczalności szkiełka nakrywkowe można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez co najmniej tydzień.
  9. Naprawa złożonej wizualizacji
    1. Zablokować 96-dołkową płytkę/szkiełka nakrywkowe w roztworze 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,1% niejonowego detergentu rozcieńczonego w 1x PBS (3% roztwór BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    2. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami, które są ukierunkowane na białko naprawcze będące przedmiotem zainteresowania, rozcieńczone zgodnie ze specyfikacjami producenta w 3% roztworze BSA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, przed 3-krotnym przemyciem 1x PBS.
    3. Inkubować 96-dołkową płytkę/szkiełko nakrywkowe z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym zgodnie z protokołem producenta w 3% roztworze BSA. Upewnij się, że fluorofory wtórne nie mają nakładających się widm wzbudzenia lub emisji.
    4. Po umyciu komórek PBS 3 razy dodać DAPI, rozcieńczony zgodnie ze specyfikacją producenta w 1x PBS i inkubować w temperaturze RT przez 5 min.
    5. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach z kroplą środka montażowego, upewniając się, że strona z ogniwem jest skierowana w dół. Ostrożnie dociśnij szkiełka nakrywkowe i wchłoń nadmiar środka montażowego chusteczką.
    6. Uszczelnij szkiełka nakrywkowe szybkoschnącym przezroczystym lakierem do paznokci i upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest całkowicie uszczelnione szkiełkiem nakrywkowym.
    7. Wykonuj obrazy z mikroskopu konfokalnego, skupiając się na kanale DAPI, przed innymi kanałami (z sygnałami z interesującego genu naprawy DNA), aby uniknąć wprowadzania stronniczości do eksperymentu.
    8. Alternatywnie, obrazy można uzyskać, pobierając przekroje Z żądanego obszaru i kondensując obraz w jednej płaszczyźnie, aby zobrazować wszystkie wykrywalne ogniska.
      UWAGA: Jeśli rozdzielczość DSB lub białko będące przedmiotem zainteresowania nie zostanie zaobserwowane w wybranych punktach czasowych, określ, kiedy DSB jest rozwiązywane, wybierając początkowo szeroki zakres punktów czasowych (0–48 godzin po indukcji DSB). Interesujące punkty czasowe będą się różnić w zależności od metody indukcji DSB i interesującego nas białka naprawczego.
  10. Skorzystaj z bezpłatnego oprogramowania ImageJ, aby zdefiniować jądra na obrazach mikroskopii immunofluorescencyjnej.
    UWAGA: Aby otwierać obrazy mikroskopowe, w ImageJ musi być zainstalowana wtyczka Bio-Formats.
    1. Otwórz obrazy konfokalne (.czi lub .tif), przeciągając plik obrazu do okna ImageJ lub wybierając "Importer formatów biologicznych" z paska narzędzi "Wtyczka" w ImageJ.
      UWAGA: Pojawi się okno "Opcja importu formatów biologicznych".
    2. Wybierz "Podziel kanały", aby podzielić obraz na konstytutywne obrazy DAPI i fluorescencyjne w oknie "Opcja importu bioformatów".
    3. Wybierz "Kolorowe" w "Opcjach kolorów" z menu rozwijanego. Wybierz "OK", aby otworzyć obrazy DAPI i Histone H2AX (H2AX) jako osobne okna i wybierz obraz DAPI.
    4. Wybierz pasek narzędzi "Obraz" i opcję "Dostosuj próg", aby wybrać nuclei.
      UWAGA: Pojawi się okno "Próg".
    5. Dostosuj próg obrazu, przesuwając dolny pasek okna "Próg" całkowicie w prawo. Dostosuj górny pasek, aż jądra staną się całkowicie czerwone z wyraźnymi konturami, a tło będzie czarne. NIE wybieraj opcji Zastosuj. Zamknij okno "Dostosuj próg".
    6. Wybierz pasek narzędzi "Analizuj" i opcję "Analizuj cząstki". Zobacz okno "Analizuj cząstki" pojawiające się na ekranie.
    7. Wprowadź minimalny rozmiar jądra.
      UWAGA: Cząstki o wielkości mniejszej od wprowadzonej wielkości nie będą liczone jako jądra.
    8. Z menu rozwijanego "Pokaż" wybierz "Konspekty". Wybierz opcję "Dodaj do menedżera". Kliknij "OK", aby otworzyć okno "Menedżer ROI".
      UWAGA: Kontury jąder pojawią się w osobnym oknie.
    9. Przypisz numery do jąder, które można wybrać z okna "Menedżer ROI".
  11. Użyj ImageJ do ilościowego oznaczania ognisk H2AX w obrazach mikroskopii immunofluorescencyjnej.
    1. Wybierz okienko ognisk "H2AX" (barwione fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym). Następnie wybierz pasek narzędzi "Proces" i wybierz "Znajdź maksima", aby znaleźć ogniska w jądrach.
      UWAGA: Otworzy się okno "Znajdź maksima".
    2. Wybierz opcję "Pojedyncze punkty" z menu rozwijanego "Typ wyjścia" i wybierz "Podgląd wyboru punktu", aby wyświetlić maksima/ogniska. Wprowadź wartość "Tolerancja szumów" w zależności od intensywności fluorescencji obrazu (Rysunek 1). Sprawdź, czy pojawia się białe okno z małymi czarnymi kropkami.
      UWAGA: Te kropki reprezentują wykryte ogniska/maksima H2AX. Wartość tolerancji szumów musi być utrzymywana na stałym poziomie dla wszystkich analizowanych obrazów. Niska/wysoka tolerancja szumów będzie przedstawiać zbyt wiele/niewiele maksimów (ognisk) w jądrze i nie będzie dokładnym odwzorowaniem ognisk w jądrze.
    3. W oknie "Menedżer ROI" należy wybrać jądra, dla których należy określić ilościowo ogniska H2AX. Zaznacz wszystkie jądra, zaznaczając opcję "pokaż wszystko".
    4. Wybierz "Pomiar", aby zmierzyć liczbę maksimów/ognisk w wybranych jądrach.
      UWAGA: Liczba maksimów/ognisk pojawia się jako wielokrotność 255, tj. jedno maksimum ma odczyt "RawIntDen" (Zintegrowana gęstość) równy 255.
    5. Skopiuj wartości "RawIntDen" i wklej je do oprogramowania w celu analizy danych.

2. Analiza lokalizacji do długotrwałego pęknięcia dwuniciowego DNA

  1. Komórki nasienne na 96-dołkowych płytkach/szkiełkach nakrywkowych, jak opisano w sekcjach 1.1 i 1.2.
  2. Indukcja pęknięć dwuniciowego DNA
    1. Komórki transfekcyjne z wektorem ekspresyjnym I-SceI przy użyciu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów zgodnie ze specyfikacją producenta. Odczekaj 24–72 godziny po transfekcji, aby zmaksymalizować ekspresję endonukleazy. Określ, czy transfekcja się powiodła, lokalizując komórki z pojedynczym dużym ogniskiem jądrowym γ-H2AX.
  3. Akwizycja obrazów
    1. Utrwalić, przepuścić, zablokować i umyć 96-dołkową płytkę/szkiełka nakrywkowe zgodnie z opisem w sekcji 1.8.
    2. Współinkubować komórki z przeciwciałem przeciwko γ-H2AX i białkiem naprawczym będącym przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku użyto pierwszorzędowego przeciwciała przeciwko RAD51) rozcieńczonym zgodnie ze specyfikacją producenta w 3% roztworze BSA.
    3. Umyć 96-dołkową płytkę/szkiełka nakrywkowe 3 razy za pomocą 1x PBS. Inkubować 96-dołkową płytkę/szkiełko nakrywkowe z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym zgodnie z protokołem producenta w 3% roztworze BSA. Upewnij się, że fluorofory wtórne nie mają nakładających się widm wzbudzenia lub emisji.
    4. Zidentyfikuj komórki, które mają duże ognisko jądrowe γ-H2AX. Rób zdjęcia tylko tych komórek, aby uniknąć stronniczości.
  4. Analiza długotrwałych ognisk indukowanych I-SceI
    1. Analizuj długotrwałe ogniska ręcznie, licząc zarówno liczbę komórek, które mają duże ogniska γ-H2AX, jak i ogniska kolokalizowane białka naprawczego, które jest przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 1 przedstawia wybór prawidłowej dyskryminacji szumów dla kwantyfikacji maksimów/ognisk za pomocą ImageJ. Połączone obrazy DAPI i interesującego nas białka naprawczego znajdują się na lewym panelu. Rysunek 1A pokazuje rozróżnienie szumów na poziomie 90 i zaznacza prawidłową liczbę ognisk. Jądra na krawędzi (oznaczone różową strzałką) i ogniska na zewnątrz jąder (oznaczone żółtą strzałką) nie są wliczane do kwantyfikacji. <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza naprawy uszkodzeń DNA w ogóle, a w szczególności naprawy pęknięć dwuniciowego DNA, jest aktywnym obszarem badań, ponieważ jej konsekwencje obejmują nowotworzenie i podstawową biologię 6,20. Manuskrypt ten szczegółowo opisuje podejście, które dokładnie analizuje udział białek RAD51 i γ-H2AX w rozdzielczości DSB poprzez HR. Patrząc w przyszłość, metoda ta może być wykorzystana do wyjaśnienia dodatkowych funkcji białek naprawczych w DSB14

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Joelowi Sannemanowi i dr Philine Wangemann z Confocal Microscopy Core, finansowanemu przez Kansas State University College of Veterinary Medicine, za ich wsparcie wysiłków na rzecz rozwoju tej techniki. pCBASceI był prezentem od Marii Jasin (plazmid Addgene # 26477)30. Komórki U2OS DR-GFP były miłym prezentem od Marii Jasin18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka nakrywkowe 12 mmVWR89015-725
16% paraformaldehyd (PFA)ThermoFisher Scientific28908
24-dołkowa płytkaVWR82050-892
96-dołkowa szklana płyta dolnaCellvisP96-1.5H-N
Anti-H2AX Alexa488EMD Millipore05-636-AF488
Anty-Rad51 (D4B10) Wtyczka Cell Signaling Technology8875S
Bio-formats dla ImageJNational Institute of Health (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWR97061-416
DAPIThermoFisher ScientificD1306
DMEM,ThermoFisher Scientific 12100046 ThermoFisher ScientificInvitrogen
15576-028
Surowica bydlęca płodu (FBS)VWR89510-194
Kozia IgG Anty-Królicza Alexa594ThermoFisher Scientific  A-11012 
Nadtlenek wodorusigma-Aldrich216763-100ML
Oprogramowanie ImageJNarodowy Instytut Zdrowia (NIH) https://imagej.nih.gov/ij/
Wektor ekspresji SceIAddgene26477
Lakier do paznokci - Insta DriSally i HansenWyraźnie szybkie (103)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Bio BasicPD8117
ProLong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciuTechnologiesP36930
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypsin-EDTASigma-AldrichT4049-500ML
Odczynnik do transfekcji TurboFectThermoFisher ScientificR0531
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
Life

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  2. Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
  3. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  4. Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
  5. Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
  6. Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
  7. Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
  8. Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
  9. Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501(2011).
  10. Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9(2012).
  11. Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
  12. Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
  13. Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
  14. D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
  15. Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
  16. Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
  17. Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
  18. Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
  19. Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
  20. Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
  21. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687(2015).
  22. Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
  23. Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957(2010).
  24. Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617(2017).
  25. Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
  26. Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
  27. Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
  28. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237(2015).
  29. Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

P kni cia dwuniciowetworzenie si ognisklokalizacja bia ekekspresja I SceIgamma H2AXmikroskopia konfokalnaanaliza w programie ImageJtest kolokalizacji

Powiązane artykuły