Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

Analiza węglowodanów to ważny i wymagający temat. Węglowodany i ich pochodne odgrywają ważną rolę w organizmach żywych^1,2,3. Cząsteczki te mają skomplikowaną strukturę i są podatne na rozkład. Wielu z nich nie można jednoznacznie scharakteryzować ze względu na trudności w separacji i wykrywaniu. Chociaż spektrometria mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) została zastosowana do analizy szerokiego zakresu biomolekuł, ze względu na jej czułość i zrozumiałe wyniki⁴, analiza węglowodanów za pomocą MALDI-MS nadal stanowi poważne wyzwanie ze względu na niską wydajność jonizacji takich cząsteczek⁵. Derywatyzacja chemiczna jest powszechnym sposobem na poprawę efektywności jonizacji węglowodanów^6,7, ale takie procedury są czasochłonne i pochłaniają próbki. Poza tym skuteczność jonizacji derywatyzowanych węglowodanów jest nadal niższa niż białek. W związku z tym konieczne jest opracowanie metod poprawy sygnału węglowodanowego w MALDI-MS bez skomplikowanych procedur.

Zastosowanie MALDI-MS do analizy ilościowej to kolejny trudny temat. Głównym problemem MALDI-MS jest to, że jego czułość i odtwarzalność danych zależy w decydującym stopniu od protokołów przygotowania próbek i parametrów eksperymentalnych. W wielu przypadkach analiza ilościowa za pomocą MALDI-MS jest niewiarygodna ze względu na niejednorodną morfologię próbki i rozmieszczenie analitu. Dobrze znanym przykładem są próbki przygotowane z matrycą MALDI kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB). Gdy DHB krystalizuje powoli w środowisku otoczenia, zakres włączenia analitu do kryształów matrycy jest nieprzewidywalny, ponieważ powstałe próbki wykazują nieregularną morfologię. Takie próbki zwykle składają się z dużych igieł i drobnych kryształów. Gdy DHB jest przygotowywany przy użyciu lotnego rozpuszczalnika i/lub podgrzanej płytki próbki, szybki proces schnięcia skutkuje bardziej jednorodnymi drobnymi kryształami i lepszymi wynikami ilościowymi^8,9^,10. Technika ta jest znana jako "rekrystalizacja" próbek MALDI. Poprawę przypisuje się lepszemu wprowadzaniu analitów do drobnych kryształów osnowy podczas procesu szybkiej krystalizacji. Wykazaliśmy również, że dostosowanie środowiska przygotowania próbki zmniejszyło niejednorodność sygnału węglowodanowego i poprawiło wyniki ilościowe^11,12. Wyniki tych prac sugerują, że morfologia próbki jest krytycznym czynnikiem określającym jakość sygnału węglowodanów. Aby opracować ogólną strategię codziennej analizy, potrzebna jest skuteczna metoda reformowania próbki, zapewniająca poprawę wrażliwości na węglowodany.

Systematycznie badaliśmy korelację między morfologią próbki a wrażliwością na węglowodany w MALDI-MS w niedawnym raporcie¹³. Wyniki uzyskane przy użyciu kilku ważnych węglowodanów i matryc pokazują, że najlepsze wzmocnienie sygnału jest realizowane przez rekrystalizację wysuszonych próbek MALDI. Morfologia próbek przygotowanych konwencjonalną metodą suchych kropel (DD) jest reformowana przez szybką rekrystalizację metanolem (MeOH). Szczegółowe protokoły przygotowania próbek przedstawiono tutaj. Protokół składa się z trzech głównych etapów, w tym wstępnego kondycjonowania płytki próbki, osadzania i rekrystalizacji próbki oraz analizy spektrometrii mas. Wykorzystywane węglowodany obejmują sialyl-lewis A (SLe^A) i maltoheptaozę (MH). DHB jest używany jako macierz modelu. Wyniki pokazują, że intensywność sygnału węglowodanów i rozkład przestrzenny znacznie się poprawiły po rekrystalizacji. Taką metodę można zastosować do próbek z innymi popularnymi matrycami, w tym 2,4,6-trihydroksyacetofenonem (THAP) i kwasem α-cyjano-4-hydroksycynamonowym. Metoda ta służy jako ogólne podejście, które można łatwo zintegrować z rutyną laboratoryjną do analizy węglowodanów.

1. Wstępne kondycjonowanie płytki próbki

1. Czyszczenie płytki z próbką
   1. Nosić rękawice nitrylowe, aby uniknąć zanieczyszczenia płytki sample podczas czyszczenia.
   2. Płytkę z próbką umyć ręcznie 100,0 ml roztworu detergentu (1,0 mg/ml).
   3. Płytkę z próbką należy umyć ręcznie wodą destylowaną dejonizowaną (DDW).
   4. Przepłukać powierzchnię płytki próbki 30,0 ml MeOH.
   5. Umieścić płytkę z próbką w zlewce o pojemności 600 ml i napełnić ją DDW, aż płytka z próbką zostanie całkowicie zanurzona w wodzie.
   6. Umieścić zlewkę w łaźni ultradźwiękowej (patrz Tabela Materiałów) i sonikować płytkę próbki przez 15 minut (200 W, 40 kHz).
   7. Wyjmij płytkę z próbką i zdmuchnij krople wody za pomocą azotu pod ciśnieniem.
   8. Umieść 0,2 μl MeOH na płytce próbki, aby sprawdzić, czy MeOH rozprzestrzenia się na inne miejsca.
      nuta: Jeśli MeOH łączy się z innymi plamami, powtórz kroki 1.1.3-1.1.5; Jeśli nie, przejdź do następnego kroku.
2. Regulacja temperatury w komorze suszenia
   1. Użyj komory suszącej w stałych warunkach, aby wysuszyć kropelki, jak opisano wcześniej^11,12,13. W szczególności należy zastosować szczegółową procedurę opisaną w krokach 2.1-2.5 Ou, Y.-M. Wsp. 2016¹². Krótko:
      1. Przedmuchnąć komorę suszenia azotem o temperaturze pokojowej przy stałym natężeniu przepływu, aby utrzymać środowisko o niskiej wilgotności względnej.
      2. Utrzymywać stałą temperaturę płytki próbki w warunkach regularnych (25 °C) lub szybkoschnących (50 °C), regulowanych przez blok miedziany o regulowanej temperaturze w komorze suszącej.
3. Przygotowanie roztworów matryc i analitów
   1. Przygotowanie roztworów matrycowych
      1. Rozpuścić DHB w 50% acetonitrylu (ACN):50% DDW, aby przygotować 0,1 M roztwór.
   2. Przygotowanie analitów węglowodanowych
      1. Rozpuścić SLe^A w DDW, aby przygotować ^10-4 M roztwór.
      2. Rozpuścić MH w DDW, aby przygotować ^10-4 M roztwór.

2. Osadzanie próbki i rekrystalizacja

Uwaga: Zoptymalizowane procedury analizy małych i regularnych ilości próbek są opisane tutaj. Upewnij się, że temperatura płytki próbki jest ustabilizowana na żądanym poziomie przed złożeniem roztworów. Jeśli próbka rozprzestrzenia się na dużym obszarze, aby pokryć inne miejsca próbki podczas rekrystalizacji, należy przygotować nową próbkę lub powtórzyć krok 1.1.

1. Do analizy niewielkiej ilości (0,1 μl) próbki
   Uwaga: Poniższe kroki zostały opracowane w celu zminimalizowania zużycia próbki i czasu. Nadaje się do analizy ilościowej rzeczywistych próbek z ograniczoną ilością lub szybkiego IMS do analizy ilościowej.
   1. Wymieszaj 0,25 μl roztworu DHB i 0,25 μl roztworu SLe^A lub MH w probówce do mikrowirówki.
   2. Mieszaj zmieszany roztwór za pomocą mieszalnika wirowego przez 3 sekundy.
   3. Odwiruj zmieszany roztwór w mini wirówce przez 2 sekundy (2000 x g).
   4. Za pomocą pipety pobrać 0,1 μl wstępnie zmieszanego roztworu i natychmiast umieścić go na płytce z próbką.
      nuta: Podczas wrzucania niewielkiej ilości próbki NIE WOLNO przechowywać wstępnie zmieszanego roztworu na końcówce pipety przez ponad 10 sekund.
   5. Poczekaj, aż próbka wyschnie. Typowe czasy schnięcia podano w tabeli 1.
   6. Za pomocą pipety nanieść 0,2 μl MeOH bezpośrednio na wysuszone miejsce próbki. Próbka natychmiast ulegnie zamoczeniu i wyschnięciu.
      nuta: Upewnij się, że procedura osadzania została zakończona w ciągu 3 sekund, aby uniknąć znacznych strat MeOH w wyniku parowania.
   7. Zbadaj próbkę pod mikroskopem. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami (patrz Rysunek 1 jako przykład pożądanych wyników), powtórz kroki 2.1.1-2.1.6, aby przygotować nową próbkę.
   8. Założyć rękawice nitrylowe i ostrożnie wyjąć płytkę próbki z komory suszenia.
2. Do analizy regularnej ilości (1 μl) próbki
   nuta: Poniższe kroki zostały opracowane w celu maksymalizacji jednorodności próbek węglowodanów przy typowo stosowanej ilości próbki MALDI. Proces nadaje się do analiz rutynowych i ilościowych. Proces rekrystalizacji polega na równomiernym rozprowadzaniu próbek i matryc na większych obszarach.
   1. Wymieszaj 2,5 μl roztworu DHB i 2,5 μl roztworu SLe^A lub MH w probówce do mikrowirówki.
   2. Wirować wstępnie zmieszany roztwór za pomocą mieszalnika wirowego przez 5 sekund.
   3. Odwiruj zmieszany roztwór w mini wirówce przez 2 sekundy (2000 x g).
   4. Za pomocą pipety pobrać 1,0 μl wstępnie zmieszanego roztworu i natychmiast umieścić go na płytce z próbką.
      Uwaga: NIE WOLNO ponownie używać pozostałego wstępnie zmieszanego roztworu po zdeponowaniu próbek.
   5. Poczekaj, aż próbka wyschnie. Typowe czasy schnięcia podano w tabeli 1.
   6. Za pomocą pipety nanieść 1,5 μl MeOH bezpośrednio na wysuszone miejsce próbki. Próbka natychmiast ulegnie zamoczeniu i wyschnięciu.
      nuta: W przypadku wysokiej temperatury płytki próbki (50 °C) etap rekrystalizacji należy przeprowadzić w ciągu 5 sekund, aby zminimalizować parowanie MeOH w końcówce pipety.
   7. Zbadaj próbkę pod mikroskopem. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami (patrz Rysunek 1 jako przykład pożądanych wyników), powtórz kroki 2.2.1-2.2.6, aby przygotować nową próbkę.
   8. Założyć rękawice nitrylowe i ostrożnie wyjąć płytkę próbki z komory suszenia.

3. Akwizycja i analiza danych spektrometrii mas

Uwaga: Analiza jest wykonywana przy użyciu komercyjnego spektrometru mas czasu przelotu (Tabela materiałów) wyposażonego w źródło jonów MALDI. Przyrząd jest obsługiwany przez specjalne oprogramowanie sterujące (Tabela materiałów) ze wstępnie zoptymalizowanym opóźnieniem ekstrakcji i energią lasera. Widma rejestrowane są w trybie liniowym o zakresie mas m/z = 0 – 1500. Potencjał płytki próbki wynosi ±25 keV, a każde widmo ma średnio 10 strzałów laserowych. Użytkownicy powinni przeprowadzić optymalizację urządzenia i analizę próbki przy użyciu kompatybilnego oprogramowania i postępować zgodnie z instrukcjami producenta urządzenia.

1. Otwórz oprogramowanie sterujące przyrządu (patrz Tabela materiałów).
2. Włożyć płytkę z próbką do spektrometru masowego.
3. Wybierz wstępnie zoptymalizowaną metodę pozyskiwania danych w oprogramowaniu.
4. Zarejestruj cały obszar próbki dla IMS za pomocą oprogramowania do obrazowania (patrz Tabela materiałów).
   nuta: Pomiń ten krok, jeśli nie korzystasz z IMS.
5. Rozpocznij akwizycję danych w trybie wsadowym oprogramowania sterującego.
6. Wykreśl obrazy jonów za pomocą oprogramowania do obrazowania po zakończeniu zbierania danych.
7. Analizuj widma masowe za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów), jeśli dane są rejestrowane bez obrazu jonów.

Reprezentatywne obrazy SEM SLeA zmieszanego z DHB, przygotowane przy użyciu metod DD i rekrystalizacji, są pokazane w Rysunek 1. Typowa morfologia DHB przygotowana metodą DD to duże kryształy w kształcie igieł na krawędzi i drobne struktury krystaliczne w środku plamek próbki. Typowe długości takich igiełkowatych kryształów wynoszą ~100 μm. Po rekrystalizacji przez MeOH próbka ma większą powierzchnię równomiernie pokrytą drobnymi kryształami przypominającymi płatki. Długości kryształów "płatkowych" wynoszą około 20-50 μm. Próbki rekrystalizowane zapewniają większą efektywną powierzchnię niż te wytwarzane przez konwencjonalne próbki DD.

Wyniki IMS wskazują, że kryształy podobne do płatków zwykle skutkują wyższą intensywnością sygnału węglowodanowego i bardziej jednorodnym rozkładem przestrzennym. W konwencjonalnych próbkach DD sygnały jonów węglowodanowych są rozprowadzane głównie na obrzeżach plamek próbki. Rysunek 2 pokazuje wyniki IMS SLeA i MH z rekrystalizacją MeOH i bez niej. Po rekrystalizacji rozkład sygnałów SLeA i MH dobrze pasuje do obrazu plamek próbki w jasnym polu. Ponadto wszystkie zrekrystalizowane próbki węglowodanów wykazują znaczny wzrost intensywności sygnału w porównaniu z wynikami uzyskanymi z próbek DD. Ze względu na większą intensywność i jednorodność sygnału, rekrystalizacja znacznie poprawia jakość danych w analizie ilościowej.

Zwiększenie intensywności sygnału węglowodanowego poprzez rekrystalizację jest skuteczne zarówno dla modów jonów dodatnich, jak i ujemnych. Rysunek 3 porównuje intensywność sygnału węglowodanów sodowanych (w trybie jonów dodatnich) i deprotonowanych (w trybie jonów ujemnych) w próbkach rekrystalizowanych w stosunku do intensywności sygnału próbek DD. Średnio rekrystalizacja próbek SLeA i MH zwiększa sygnały sodowane odpowiednio o 3,9 i 3,3 razy. W przypadku zdeprotonowanego SLeA sygnał jonowy jest zwykle wzmacniany o współczynnik około 4,7 po rekrystalizacji.

Rysunek 1. Obrazy SEM SLeA przygotowane za pomocą matrycy DHB. Próbki przygotowuje się metodami suszonych kropelek i rekrystalizacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki obrazowej spektrometrii mas SLeA i MH przygotowanych metodami suchych kropelek i rekrystalizacji. Obrazy jonów reprezentują rozkłady analitów sodowanych lub deprotonowanych. Wszystkie obrazy jasnego pola i jonów są wyświetlane w tej samej skali. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Natężenie sygnału węglowodanowego uzyskane różnymi metodami przygotowania próbki. Czarne paski: sodowane SLeA (m/z: 843); czerwone paski: zdeprotonowane SLeA (m/z: 819); niebieskie paski: sodowany MH (m/z: 1175). Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1. Parametry doświadczalne i warunki suszenia w różnych temperaturach płytki próbki.x

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.