Artykuł metodologiczny

Wydajna metoda przygotowania próbki w celu wzmocnienia sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57660

⸱

29 lipca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Genomic Research Center, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazano protokół wzmacniania sygnałów jonów węglowodanowych w spektrometrii mas MALDI poprzez reformowanie struktur krystalicznych podczas procesów przygotowywania próbek.

Streszczenie

Przygotowanie próbki jest krytycznym procesem w analizie węglowodanów metodą spektrometrii mas (MS). Chociaż desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) MS jest metodą z wyboru w analizie węglowodanów, słaby sygnał jonowy i odtwarzalność danych próbek węglowodanów nadal stanowią poważny problem. Do ilościowej analizy węglowodanów niezbędny jest skuteczny protokół analityczny zapewniający najwyższą jakość danych. Ten film przedstawia protokoły przygotowania próbek w celu poprawy intensywności sygnału i zminimalizowania zmienności danych dotyczących węglowodanów w MALDI-MS. Po wysuszeniu i krystalizacji kropelek próbki, morfologia kryształów jest reformowana przez metanol przed analizą spektrometryczną mas. Wzmocnienie sygnału węglowodanowego bada się za pomocą obrazowania metodą spektrometrii mas (IMS) MALDI. Wyniki eksperymentalne pokazują, że reformacja kryształów dostosowuje struktury krystaliczne i redystrybuuje anality węglowodanowe. W porównaniu z metodą przygotowania suszonych kropel w konwencjonalnym MALDI-MS, reformowanie morfologii kryształów węglowodanów za pomocą metanolu wykazuje znacznie lepszą intensywność sygnału, rozkład obrazu jonów i stabilność danych. Ponieważ przedstawione w niniejszym dokumencie protokoły nie obejmują zmian w składzie próbki, mają one ogólne zastosowanie do różnych węglowodanów i matryc.

Wprowadzenie

Analiza węglowodanów to ważny i wymagający temat. Węglowodany i ich pochodne odgrywają ważną rolę w organizmach żywych1,2,3. Cząsteczki te mają skomplikowaną strukturę i są podatne na rozkład. Wielu z nich nie można jednoznacznie scharakteryzować ze względu na trudności w separacji i wykrywaniu. Chociaż spektrometria mas (MS) z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI) została zastosowana do analizy szerokiego zakresu biomolekuł, ze względu na jej czułość i zrozumiałe wyniki4, analiza węglowodanów za pomocą MALDI-MS nadal stanowi poważne wyzwanie ze względu na niską wydajność jonizacji takich cząsteczek5. Derywatyzacja chemiczna jest powszechnym sposobem na poprawę efektywności jonizacji węglowodanów6,7, ale takie procedury są czasochłonne i pochłaniają próbki. Poza tym skuteczność jonizacji derywatyzowanych węglowodanów jest nadal niższa niż białek. W związku z tym konieczne jest opracowanie metod poprawy sygnału węglowodanowego w MALDI-MS bez skomplikowanych procedur.

Zastosowanie MALDI-MS do analizy ilościowej to kolejny trudny temat. Głównym problemem MALDI-MS jest to, że jego czułość i odtwarzalność danych zależy w decydującym stopniu od protokołów przygotowania próbek i parametrów eksperymentalnych. W wielu przypadkach analiza ilościowa za pomocą MALDI-MS jest niewiarygodna ze względu na niejednorodną morfologię próbki i rozmieszczenie analitu. Dobrze znanym przykładem są próbki przygotowane z matrycą MALDI kwasu 2,5-dihydroksybenzoesowego (DHB). Gdy DHB krystalizuje powoli w środowisku otoczenia, zakres włączenia analitu do kryształów matrycy jest nieprzewidywalny, ponieważ powstałe próbki wykazują nieregularną morfologię. Takie próbki zwykle składają się z dużych igieł i drobnych kryształów. Gdy DHB jest przygotowywany przy użyciu lotnego rozpuszczalnika i/lub podgrzanej płytki próbki, szybki proces schnięcia skutkuje bardziej jednorodnymi drobnymi kryształami i lepszymi wynikami ilościowymi8,9,10. Technika ta jest znana jako "rekrystalizacja" próbek MALDI. Poprawę przypisuje się lepszemu wprowadzaniu analitów do drobnych kryształów osnowy podczas procesu szybkiej krystalizacji. Wykazaliśmy również, że dostosowanie środowiska przygotowania próbki zmniejszyło niejednorodność sygnału węglowodanowego i poprawiło wyniki ilościowe11,12. Wyniki tych prac sugerują, że morfologia próbki jest krytycznym czynnikiem określającym jakość sygnału węglowodanów. Aby opracować ogólną strategię codziennej analizy, potrzebna jest skuteczna metoda reformowania próbki, zapewniająca poprawę wrażliwości na węglowodany.

Systematycznie badaliśmy korelację między morfologią próbki a wrażliwością na węglowodany w MALDI-MS w niedawnym raporcie13. Wyniki uzyskane przy użyciu kilku ważnych węglowodanów i matryc pokazują, że najlepsze wzmocnienie sygnału jest realizowane przez rekrystalizację wysuszonych próbek MALDI. Morfologia próbek przygotowanych konwencjonalną metodą suchych kropel (DD) jest reformowana przez szybką rekrystalizację metanolem (MeOH). Szczegółowe protokoły przygotowania próbek przedstawiono tutaj. Protokół składa się z trzech głównych etapów, w tym wstępnego kondycjonowania płytki próbki, osadzania i rekrystalizacji próbki oraz analizy spektrometrii mas. Wykorzystywane węglowodany obejmują sialyl-lewis A (SLeA) i maltoheptaozę (MH). DHB jest używany jako macierz modelu. Wyniki pokazują, że intensywność sygnału węglowodanów i rozkład przestrzenny znacznie się poprawiły po rekrystalizacji. Taką metodę można zastosować do próbek z innymi popularnymi matrycami, w tym 2,4,6-trihydroksyacetofenonem (THAP) i kwasem α-cyjano-4-hydroksycynamonowym. Metoda ta służy jako ogólne podejście, które można łatwo zintegrować z rutyną laboratoryjną do analizy węglowodanów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wstępne kondycjonowanie płytki próbki

  1. Czyszczenie płytki z próbką
    1. Nosić rękawice nitrylowe, aby uniknąć zanieczyszczenia płytki sample podczas czyszczenia.
    2. Płytkę z próbką umyć ręcznie 100,0 ml roztworu detergentu (1,0 mg/ml).
    3. Płytkę z próbką należy umyć ręcznie wodą destylowaną dejonizowaną (DDW).
    4. Przepłukać powierzchnię płytki próbki 30,0 ml MeOH.
    5. Umieścić płytkę z próbką w zlewce o pojemności 600 ml i napełnić ją DDW, aż płytka z próbką zostanie całkowicie zanurzona w wodzie.
    6. Umieścić zlewkę w łaźni ultradźwiękowej (patrz Tabela Materiałów) i sonikować płytkę próbki przez 15 minut (200 W, 40 kHz).
    7. Wyjmij płytkę z próbką i zdmuchnij krople wody za pomocą azotu pod ciśnieniem.
    8. Umieść 0,2 μl MeOH na płytce próbki, aby sprawdzić, czy MeOH rozprzestrzenia się na inne miejsca.
      nuta: Jeśli MeOH łączy się z innymi plamami, powtórz kroki 1.1.3-1.1.5; Jeśli nie, przejdź do następnego kroku.
  2. Regulacja temperatury w komorze suszenia
    1. Użyj komory suszącej w stałych warunkach, aby wysuszyć kropelki, jak opisano wcześniej11,12,13. W szczególności należy zastosować szczegółową procedurę opisaną w krokach 2.1-2.5 Ou, Y.-M. Wsp. 201612. Krótko:
      1. Przedmuchnąć komorę suszenia azotem o temperaturze pokojowej przy stałym natężeniu przepływu, aby utrzymać środowisko o niskiej wilgotności względnej.
      2. Utrzymywać stałą temperaturę płytki próbki w warunkach regularnych (25 °C) lub szybkoschnących (50 °C), regulowanych przez blok miedziany o regulowanej temperaturze w komorze suszącej.
  3. Przygotowanie roztworów matryc i analitów
    1. Przygotowanie roztworów matrycowych
      1. Rozpuścić DHB w 50% acetonitrylu (ACN):50% DDW, aby przygotować 0,1 M roztwór.
    2. Przygotowanie analitów węglowodanowych
      1. Rozpuścić SLeA w DDW, aby przygotować 10-4 M roztwór.
      2. Rozpuścić MH w DDW, aby przygotować 10-4 M roztwór.

2. Osadzanie próbki i rekrystalizacja

Uwaga: Zoptymalizowane procedury analizy małych i regularnych ilości próbek są opisane tutaj. Upewnij się, że temperatura płytki próbki jest ustabilizowana na żądanym poziomie przed złożeniem roztworów. Jeśli próbka rozprzestrzenia się na dużym obszarze, aby pokryć inne miejsca próbki podczas rekrystalizacji, należy przygotować nową próbkę lub powtórzyć krok 1.1.

  1. Do analizy niewielkiej ilości (0,1 μl) próbki
    Uwaga:     Poniższe kroki zostały opracowane w celu zminimalizowania zużycia próbki i czasu. Nadaje się do analizy ilościowej rzeczywistych próbek z ograniczoną ilością lub szybkiego IMS do analizy ilościowej.
    1. Wymieszaj 0,25 μl roztworu DHB i 0,25 μl roztworu SLeA lub MH w probówce do mikrowirówki.
    2. Mieszaj zmieszany roztwór za pomocą mieszalnika wirowego przez 3 sekundy.
    3. Odwiruj zmieszany roztwór w mini wirówce przez 2 sekundy (2000 x g).
    4. Za pomocą pipety pobrać 0,1 μl wstępnie zmieszanego roztworu i natychmiast umieścić go na płytce z próbką.
      nuta: Podczas wrzucania niewielkiej ilości próbki NIE WOLNO przechowywać wstępnie zmieszanego roztworu na końcówce pipety przez ponad 10 sekund.
    5. Poczekaj, aż próbka wyschnie. Typowe czasy schnięcia podano w tabeli 1.
    6. Za pomocą pipety nanieść 0,2 μl MeOH bezpośrednio na wysuszone miejsce próbki. Próbka natychmiast ulegnie zamoczeniu i wyschnięciu.
      nuta: Upewnij się, że procedura osadzania została zakończona w ciągu 3 sekund, aby uniknąć znacznych strat MeOH w wyniku parowania.
    7. Zbadaj próbkę pod mikroskopem. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami (patrz Rysunek 1 jako przykład pożądanych wyników), powtórz kroki 2.1.1-2.1.6, aby przygotować nową próbkę.
    8. Założyć rękawice nitrylowe i ostrożnie wyjąć płytkę próbki z komory suszenia.
  2. Do analizy regularnej ilości (1 μl) próbki
    nuta: Poniższe kroki zostały opracowane w celu maksymalizacji jednorodności próbek węglowodanów przy typowo stosowanej ilości próbki MALDI. Proces nadaje się do analiz rutynowych i ilościowych. Proces rekrystalizacji polega na równomiernym rozprowadzaniu próbek i matryc na większych obszarach.
    1. Wymieszaj 2,5 μl roztworu DHB i 2,5 μl roztworu SLeA lub MH w probówce do mikrowirówki.
    2. Wirować wstępnie zmieszany roztwór za pomocą mieszalnika wirowego przez 5 sekund.
    3. Odwiruj zmieszany roztwór w mini wirówce przez 2 sekundy (2000 x g).
    4. Za pomocą pipety pobrać 1,0 μl wstępnie zmieszanego roztworu i natychmiast umieścić go na płytce z próbką.
      Uwaga: NIE WOLNO ponownie używać pozostałego wstępnie zmieszanego roztworu po zdeponowaniu próbek.
    5. Poczekaj, aż próbka wyschnie. Typowe czasy schnięcia podano w tabeli 1.
    6. Za pomocą pipety nanieść 1,5 μl MeOH bezpośrednio na wysuszone miejsce próbki. Próbka natychmiast ulegnie zamoczeniu i wyschnięciu.
      nuta: W przypadku wysokiej temperatury płytki próbki (50 °C) etap rekrystalizacji należy przeprowadzić w ciągu 5 sekund, aby zminimalizować parowanie MeOH w końcówce pipety.
    7. Zbadaj próbkę pod mikroskopem. Jeśli morfologia kryształów nie jest zgodna z oczekiwaniami (patrz Rysunek 1 jako przykład pożądanych wyników), powtórz kroki 2.2.1-2.2.6, aby przygotować nową próbkę.
    8. Założyć rękawice nitrylowe i ostrożnie wyjąć płytkę próbki z komory suszenia.

3. Akwizycja i analiza danych spektrometrii mas

Uwaga: Analiza jest wykonywana przy użyciu komercyjnego spektrometru mas czasu przelotu (Tabela materiałów) wyposażonego w źródło jonów MALDI. Przyrząd jest obsługiwany przez specjalne oprogramowanie sterujące (Tabela materiałów) ze wstępnie zoptymalizowanym opóźnieniem ekstrakcji i energią lasera. Widma rejestrowane są w trybie liniowym o zakresie mas m/z = 0 – 1500. Potencjał płytki próbki wynosi ±25 keV, a każde widmo ma średnio 10 strzałów laserowych. Użytkownicy powinni przeprowadzić optymalizację urządzenia i analizę próbki przy użyciu kompatybilnego oprogramowania i postępować zgodnie z instrukcjami producenta urządzenia.

  1. Otwórz oprogramowanie sterujące przyrządu (patrz Tabela materiałów).
  2. Włożyć płytkę z próbką do spektrometru masowego.
  3. Wybierz wstępnie zoptymalizowaną metodę pozyskiwania danych w oprogramowaniu.
  4. Zarejestruj cały obszar próbki dla IMS za pomocą oprogramowania do obrazowania (patrz Tabela materiałów).
    nuta: Pomiń ten krok, jeśli nie korzystasz z IMS.
  5. Rozpocznij akwizycję danych w trybie wsadowym oprogramowania sterującego.
  6. Wykreśl obrazy jonów za pomocą oprogramowania do obrazowania po zakończeniu zbierania danych.
  7. Analizuj widma masowe za pomocą oprogramowania analitycznego (patrz tabela materiałów), jeśli dane są rejestrowane bez obrazu jonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne obrazy SEM SLeA zmieszanego z DHB, przygotowanego metodą DD oraz metodą rekrystalizacji, przedstawiono na Rysunku 1. Typowa morfologia DHB przygotowanego metodą DD charakteryzuje się obecnością dużych kryształów w kształcie igieł na obrzeżach oraz drobnych struktur krystalicznych w centrum plam próbki. Typowa długość takich kryształów igłowatych wynosi ~100 µm. Po rekrystalizacji za pomocą MeOH próbka posiada większy obszar równomie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niejednorodność próbek jest kluczowym problemem w MALDI-MS. DD jest najczęściej stosowaną metodą przygotowania próbek, ale powstałe kryształy są bardzo niejednorodne. Takie próbki wykazują słabą odtwarzalność sygnału między ujęciami i próbkami. W związku z tym wyszukiwanie "słodkich punktów" w obszarach próbki podczas pozyskiwania danych jest powszechną procedurą w eksperymentach MALDI. Takie niejednorodne próbki nie nadają się do oznaczania ilościowego w rutynowych analizach.

W obecnym badani...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odczynnik
Detergent w proszkuAlconox242985
MetanolMerck106009
AcetonitrylMerck100003
Kwas 2,5-dihydroksybenzoesowy (DHB)AlfaAesar A11459
sialyl-Lewis A (SLeA)Sigma-AldrichS1782
MaltoheptaoseSigma-AldrichM7753
Końcówki do pipetMettler Toledo17005091
Probówka do mikrowirówekAxygenMCT-150-C
Equipment
Milli-QMilliporeZMQS6VFT1
Rękawice nitrylowe bezpudroweMicroflexSU-690
Zlewka 600 mlDuran2110648
Myjka ultradźwiękowaDC300H
HigrometrWisewind5330
Przepływomierz azotuDwyerRMA-6-SSV
Termopary typuK Digitron311-1670
Mieszalnik wirowyScientific Industries  SI-0236
Mini wirówkaSelect BioProductsForce Mini 
PipetaRaininpipet-lite XLS
Mikroskop stereoskopowyOlympusSZX16
Komora susząca z regulacją temperaturyTen laboratoryjny
spektrometr masowy Ultraflex II TOF/TOFBruker Daltonics
MTP 384 tarcza celownicza stal polerowana BCBruker Daltonics8280781
Flexcontrol Wersja 3.4Oprogramowanie do sterowaniadaltonikami firmy Bruker Oprogramowanie do obrazowania daltoniki
Fleximaging w wersji 2.1Oprogramowanie do obrazowaniadaltoniki firmy Bruker Oprogramowanie do analizy daltoniki
wersji 3.4
Delta w

Bibliografia

  1. Holme, D. J., Peck, H. Analytical Biochemistry. , 3rd edn, Addison Wesley Longman Limited. (1998).
  2. Costello, C. E. Time, life ... and mass spectrometry - New techniques to address biological questions. Biophysical Chemistry. 68 (1-3), 173-188 (1997).
  3. Caroff, M., Karibian, D. Structure of bacterial lipopolysaccharides. Carbohydrate Research. 338 (23), 2431-2447 (2003).
  4. Marvin, L. F., Roberts, M. A., Fay, L. B. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry in clinical chemistry. Clinica Chimica Acta. 337 (1), 11-21 (2003).
  5. Harvey, D. J. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of carbohydrates. Mass Spectrometry Reviews. 18 (6), 349-450 (1999).
  6. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydrate Research. 131 (2), 209-217 (1984).
  7. Lamari, F. N., Kuhn, R., Karamanos, N. K. Derivatization of carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometric structure analysis. Journal of Chromatography B. 793 (1), 15-36 (2003).
  8. Nishikaze, T., Amano, J. Reverse thin layer method for enhanced ion yield of oligosaccharides in matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (23), 3787-3794 (2009).
  9. Williams, T. I., Saggese, D. A., Wilcox, R. J., Martin, J. D., Muddiman, D. C. Effect of matrix crystal structure on ion abundance of carbohydrates by matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (5), 807-811 (2007).
  10. Nicola, A. J., Gusev, A. I., Proctor, A., Jackson, E. K., Hercules, D. M. Application of the fast-evaporation sample preparation method for improving quantification of angiotensin II by matrix-assisted laser desorption/ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9 (12), 1164-1171 (1995).
  11. Lai, Y. H., et al. Reducing Spatial Heterogeneity of MALDI Samples with Marangoni Flows During Sample Preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (8), 1314-1321 (2016).
  12. Ou, Y. -M., et al. Preparation of Homogeneous MALDI Samples for Quantitative Applications. Journal of Visualized Experiments. (116), e54409(2016).
  13. Lee, H., et al. Enhancing carbohydrate ion yield by controlling crystalline structures in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. , 49-55 (2017).
  14. Allwood, D. A., Perera, I. K., Perkins, J., Dyer, P. E., Oldershaw, G. A. Preparation of 'near' homogeneous samples for the analysis of matrix-assisted laser desorption/ionisation processes. Applied Surface Science. 103 (3), 231-244 (1996).
  15. Sadeghi, M., Vertes, A. Crystallite size dependence of volatilization in matrix-assisted laser desorption ionization. Applied Surface Science. 127 (Supplement C), 226-234 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spektrometria mas MALDIanaliza w glowodan wreformowanie kryszta wtraktowanie metanolemwzmocnienie sygna uobrazuj ca spektrometria masmetoda wysychaj cej kroplik piel ultrad wi kowabadanie mikroskopowe

Powiązane artykuły