Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie kostniakomięsaka za pomocą zespołu Li-Fraumeni Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57664

⸱

13 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth, 3Department of Musculoskeletal Oncology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4Women's Health Institute, Cleveland Clinic Foundation, 5Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for the Prevention of Human Diseases, The University of Texas Health Science Center at Houston, 6Center for Precision Health, School of Biomedical Informatics and School of Public Health, The University of Texas Health Science Center at Houston

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z fibroblastów pochodzących od pacjentów z zespołem Li-Fraumeni (LFS), różnicowania iPSC poprzez mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) do osteoblastów oraz modelowania nowotworzenia in vivo przy użyciu osteoblastów pochodzących od pacjentów z LFS.

Streszczenie

Zespół Li-Fraumeni (LFS) jest dziedziczną chorobą nowotworową dziedziczoną autosomalnie dominująco. Pacjenci z LFS są predysponowani do różnego rodzaju nowotworów, w tym kostniakomięsaka - jednego z najczęstszych pierwotnych nowotworów niehematologicznych w dzieciństwie i okresie dojrzewania. Dlatego LFS stanowi idealny model do badania tego nowotworu. Korzystając z metodologii iPSC, kostniakomięsak związany z LFS można z powodzeniem modelować poprzez różnicowanie iPSC pacjentów z LFS do mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), a następnie do osteoblastów - komórek pochodzenia kostniakomięsaków. Te osteoblasty LFS podsumowują onkogenne właściwości kostniakomięsaka, zapewniając atrakcyjny system modelowy do nakreślenia patogenezy kostniakomięsaka. W artykule przedstawiono protokół wytwarzania iPSC z fibroblastów pacjentów z LFS, różnicowania iPSC do MSC, różnicowania MSCs do osteoblastów oraz nowotworzenia in vivo z wykorzystaniem osteoblastów LFS. Ten model choroby iPSC można rozszerzyć w celu identyfikacji potencjalnych biomarkerów lub celów terapeutycznych kostniakomięsaka związanego z LFS.

Wprowadzenie

Między 2006 a 2007 rokiem, kilka przełomowych odkryć z laboratoriów doktorów Shinya Yamanaka i Jamesa A. Thomsona doprowadziło do rozwoju indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC)1,2,3. Przeprogramowując komórki somatyczne ze zdefiniowanymi czynnikami transkrypcyjnymi w celu utworzenia iPSC, naukowcy byli w stanie wygenerować komórki o kluczowych cechach, a mianowicie pluripotencji i samoodnawianiu, które wcześniej uważano, że występują tylko w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC). IPSC mogą być generowane od dowolnej osoby lub pacjenta i nie muszą być pozyskiwane z embrionów, co znacznie rozszerza repertuar dostępnych chorób i środowisk dla badania. Od tego czasu iPSC pochodzące od pacjentów są używane do podsumowania fenotypu różnych chorób człowieka, od choroby Alzheimera4 i stwardnienia zanikowego bocznego5 do zespołu długiego odstępu QT6,7,8.

Te postępy w badaniach nad iPSC otworzyły również nowe możliwości dla badań nad rakiem. Kilka grup wykorzystało ostatnio iPSC pacjentów do modelowania rozwoju raka na podatnym tle genetycznym9,10,11, z powodzeniem zademonstrowanym do tej pory zastosowaniem w kostniakomięsaku9, leukemia10,11,12, oraz rak jelita grubego13. Chociaż modele nowotworów pochodzące z iPSC są wciąż w powijakach, wykazały ogromny potencjał w fenokopii nowotworów złośliwych związanych z chorobą, wyjaśnianiu mechanizmów patologicznych i identyfikowaniu związków terapeutycznych14.

Zespół Li-Fraumeni (LFS) jest dziedzicznym nowotworem dziedzicznym autosomalnym dominującym spowodowanym mutacją genu zarodkowego TP5315. Pacjenci z LFS są predysponowani do różnych rodzajów nowotworów złośliwych, w tym kostniakomięsaka, co sprawia, że iPSC LFS i ich komórki pochodne szczególnie dobrze nadają się do badania tego nowotworu16. Model kostniakomięsaka oparty na iPSC został po raz pierwszy opracowany w 2015 r. przy użyciu iPSCs pochodzących od pacjentów LFS9 następnie zróżnicowanych w mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), a następnie w osteoblasty, komórki pierwotne kostniakomięsaka. Te osteoblasty LFS podsumowują związane z kostniakomięsakiem defekty różnicowania osteogennego i właściwości onkogenne, demonstrując potencjał modelu jako platformy "guza kości w naczyniu". Co ciekawe, analizy transkryptomu całego genomu ujawniają aspekty sygnatury genu kostniakomięsaka w osteoblastach LFS oraz że cechy tego profilu ekspresji genu LFS są skorelowane ze złym rokowaniem w kostniakomięsaku9, co wskazuje na potencjał modeli choroby iPSC LFS do ujawniania cech o znaczeniu klinicznym.

Ten manuskrypt zawiera szczegółowy opis sposobu wykorzystania iPSC pochodzących od pacjentów LFS do modelowania kostniakomięsaka. Szczegółowo opisano w nim wytwarzanie iPSC LFS, różnicowanie iPSC do MSC, a następnie do osteoblastów, a także wykorzystanie modelu ksenoprzeszczepu in vivo z wykorzystaniem osteoblastów LFS. Model choroby LFS ma kilka zalet, w szczególności zdolność do generowania nieograniczonej liczby komórek na wszystkich etapach rozwoju kostniakomięsaka do badań mechanistycznych, identyfikacji biomarkerów i badań przesiewowych leków9,14,16.

Podsumowując, model kostniakomięsaka oparty na LFS iPSC stanowi atrakcyjny system uzupełniający dla postępu badań nad kostniakomięsakiem. Platforma ta zapewnia również dowód słuszności koncepcji modelowania nowotworów przy użyciu iPSC pochodzących od pacjentów. Tę opisaną poniżej strategię można łatwo rozszerzyć na modelowe nowotwory złośliwe związane z innymi zaburzeniami genetycznymi z predyspozycjami nowotworowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ta praca została zatwierdzona przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Teksańskiego w Houston (UTHealth). Eksperymenty są przeprowadzane w ścisłej zgodności ze standardami ustanowionymi przez UTHealth Center for Laboratory Animal Medicine & Care (CLAMC), które jest akredytowane przez American Association for Laboratory Animal Care (AAALAC International). Uczestnicy tego badania podlegają scenariuszowi A ("Brak badań z udziałem ludzi") zgodnie z definicją zawartą w dokumentacji NIH SF424. W związku z tym nie wymaga on żadnego zatwierdzenia przez komisję etyczną UTHealth ds. badań na ludziach.

1. Generacja iPSC LFS (Rysunek 1A)

  1. W dniu -2 należy umieścić na płytce 2 x 104 fibroblasty pacjenta z LFS w jednym dołku na 6-dołkowej płytce i wyhodować komórki z pożywką fibroblastową (Tabela 1) w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Upewnij się, że fibroblasty osiągną 50 - 60% zbiegu w dniu transdukcji (dzień 0).
  2. Wykonaj transdukcję wirusa Sendai w dniu 0. Aby to zrobić, zastąp zużyte podłoże wstępnie podgrzanym podłożem fibroblastowym. Rozmrozić komercyjny zestaw do przeprogramowania wirusa Sendai (patrz tabela materiałów) na lodzie. Zakażone fibroblasty LFS mieszanymi wirusami Sendai należy zainfekować zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Utrzymanie transdukowanych komórek w pożywce fibroblastowej (dzień 1 - 6):
    1. W dniu 1, 24 godziny po transdukcji należy usunąć pożywkę fibroblastową zawierającą pozostałości wirusa Sendai i zastąpić ją 2 ml świeżej pożywki fibroblastowej. Hodowla transdukowanych fibroblastów w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    2. Zmieniaj pożywkę z pożywką fibroblastów co drugi dzień od 2 do 6 dnia.
  4. Utrzymanie transdukowanych komórek w stanie hodowli paszowej (dzień 7 - 28):
    1. Przygotuj napromieniowane szalki z hodowli fibroblastów zarodkowych myszy CF1 (MEF) w dniu 6. W tym celu pokryj sześć naczyń do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm, dodając 5 ml 0,1% żelatyny do każdej płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Odessać 0,1% żelatyny po powlekaniu.
    2. Wyjmij MEF z pojemnika na ciekły azot. Rozmrażaj MEF-y za pomocą dostępnego na rynku systemu rozmrażania zgodnie z instrukcjami producenta. Płytki na płytkach pokrytych żelatyną pokryć pożywką hodowlaną MEF/MSC (tabela 1) przy gęstości wysiewu około 6,7 x 105 komórek na 100 mm naczynie do hodowli tkankowych.
    3. Zaszczepić transdukowane komórki na płytkach MEF (dzień 7): Trypsynizować transdukowane komórki za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA na 100 mm naczynie przez 2 - 4 minuty w temperaturze pokojowej. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 9 ml pożywki z fibroblastów. Przenieść komórki do probówek stożkowych i odwirować komory w temperaturze 230 x g w temperaturze 37 °C przez 4 minuty. Umieść transdukowane fibroblasty na sześciu szalkach MEF przygotowanych w dniu 6 i hoduj je w 8 ml pożywki fibroblastowej na talerzu.
      UWAGA: Zbieg MEF wynosi około 20% przed wysiewem transdukowanej komórki na płytkach MEF.
    4. W 8 dniu należy wyrzucić pożywkę z fibroblastów i zastąpić ją pożywką hESC (Tabela 1).
    5. Poczekaj na pojawienie się klonów iPS od 9 do 28 dni (Rysunek 1C). Zmieniaj zużytą pożywkę hESC co drugi dzień i monitoruj pojawianie się klonów iPS pod mikroskopem. Poczekaj, aż klony iPSC będą wystarczająco duże, aby można je było zaobserwować gołym okiem, a następnie przystąp do ekspansji klonów iPS w warunkach hodowli bez karmienia.
  5. Ekspansja wyłonionych klonów iPS w warunkach hodowli bez karmnika (Dzień 29 - 79 ~ 99):
    1. Aby przygotować płytkę pokrytą matrycą, należy pokryć 48-dołkową płytkę 120 μl roztworu do powlekania matrycy membrany podstawnej (tabela 1) na studzienkę. Upewnij się, że roztwór do powlekania matrycy membrany podstawnej zakrywa studzienkę i pokrywa powierzchnię naczynia hodowlanego. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 1 godzinę. Bezpośrednio przed użyciem odessać roztwór powlekający i dodać 250 μl pożywki hESC do dołka z inhibitorem 2 μM ROCK tiazowiwiną.
    2. W dniu 28 odessać zużytą pożywkę hESC i przemyć klony iPS 1x DPBS. Pobrać widoczne klony iPS za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml i przenieść do dołka na 48-dołkowej płytce poddanej działaniu środka (krok 1.4.1). Wysiewaj jedną kolonię na dołek 48-dołkowej płytki.
    3. Odwirować płytkę o masie 230 x g przez 4 minuty, aby ułatwić dołączenie komórki. Hodowla klonów iPS w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
    4. Następnego dnia (dzień 29) należy usunąć zużytą pożywkę hESC i dodać 250 μl dostępnej w handlu pożywki iPSC do każdej studzienki.
    5. Utrzymuj klony iPS w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i zmieniaj pożywkę iPSC co drugi dzień.
    6. Gdy klony iPS osiągną 85% konfluencji, subkulturuj komórki w stosunku 1:10 na obszar hodowli. Dodać 60 μl dostępnego w handlu roztworu pasażującego w celu odłączenia komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
    7. Wysiewaj połowę oderwanych iPSC na 12-dołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej w 1 ml pożywki hESC z 2 μM inhibitorem ROCK tiazowiwiną. Klony iPS należy hodować na 12-dołkowej płytce z 1 ml dostępnego na rynku podłoża iPSC na studzienkę i subkultury iPSC w stosunku 1:10, aż osiągną pasaż 10,
      UWAGA: iPSC są hodowane sub co 5 - 7 dni w stosunku 1:10. Klony iPS potrzebują do 10 tygodni, aby osiągnąć przejście 10. Charakterystyki iPSC, w tym morfologia komórek, aktywność fosfatazy alkalicznej (AP) oraz ekspresja czynników pluripotencji i markerów hESC, można zbadać po potwierdzeniu usunięcia wirusa Sendai w iPSC (zwykle wykazywane po około 10 pasażach) (Figura 1B-E). Informacje o przeciwciałach i starterach do charakterystyki iPSC znajdują się w Tabelach 2 i 4.

2. Różnicowanie iPSC LFS do mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) (Rysunek 2A)

  1. Hodowla klonów iPSC na płytkach MEF przez co najmniej 2 tygodnie (dzień ~ -14 - 0): Przygotować szalki MEF (100 mm szalki do hodowli tkankowej) zgodnie z wcześniejszym opisem (1.3.1 - 1.3.2). Utrzymuj iPSC w pożywce hESC i zmieniaj pożywkę co drugi dzień. Za każdym razem, gdy iPSC osiągają 90% konfluencji, subkultura iPSC o rozcieńczeniu 1:10.
  2. Usunięcie MEF z iPSC (Dzień 0):
    1. Po utrzymaniu iPSC na MEF przez 2 tygodnie, hoduj iPSC w 100 mm szalkach do hodowli tkankowej, aż komórki osiągną 80-90% konfluencji. Usunąć zużytą pożywkę hESC i przemyć iPSC 5 ml 1x DPBS. Dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek, aby odłączyć komórki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
    2. Dodać 9 ml pożywki hodowlanej MEF/MSC do płytki, aby zneutralizować aktywność roztworu do odrywania komórek i przenieść oderwane komórki do nowego naczynia do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm bez żadnej powłoki.
    3. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić MEF-om przyczepienie się do płytki.
    4. Ostrożnie zebrać sklarowany nad osadem, który zawiera nieprzyłączone iPSC, i odwirować w temperaturze 230 x g w temperaturze 4 °C przez 4 min.
      UWAGA: Nieostrożne przepłukanie dna płyty prowadzi do odłączenia MEF-ów.
  3. Zróżnicowanie iPSC w stosunku do MSC (dzień 0 - 28):
    1. Pokryj trzy dołki 6-dołkowej płytki 1 ml 0,1% żelatyny na studzienkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    2. Usunąć supernatant zebranych iPSC z ppkt 2.2.4.
    3. Ponownie zawiesić iPSC w 6 ml pożywki różnicującej MSC (Tabela 1) i komórkach nasiennych w trzech powlekanych studzienkach po 2 ml na studzienkę (Dzień 0).
    4. Zmieniaj pożywkę różnicującą MSC co dwa dni, aby usunąć nieprzyłączone i/lub martwe komórki (dzień 1 - 28).
  4. Dojrzewanie MSC pochodzących z iPSC (dzień 28 - 45):
    1. Usunąć zużytą pożywkę różnicującą MSC i przemyć komórki 1 ml 1x DPBS.
    2. Trypsynizować MSCs za pomocą 0,5 ml 0,25% trypsyny-EDTA na studzienkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
    3. Zneutralizować trypsynę za pomocą 1,5 ml pożywki hodowlanej MEF/MSC i zebrać MSC z trzech studzienek do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 230 x g w temperaturze 4 °C przez 4 min.
    4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić MSCs w 3 ml pożywki hodowlanej MEF/MSC i rozmieścić płytkę na jednej płytce pokrytej żelatyną o średnicy 60 mm 0,1% (dzień 28).
    5. Hodowla MSC w pożywce MEF/MSC i zmiana pożywki co dwa dni. Gdy komórki osiągną 100% konfluencji, subkultura MSCs w stosunku 1:3 przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA.
      UWAGA: MSC wykazują morfologię podobną do fibroblastów (Ryc. 2B). Kiedy MSCs rosną w dużej gęstości, wydłużone MSCs mogą tworzyć wzór przypominający wir (Rysunek 2B).
    6. Wykonaj barwienie immunofluorescencyjne w celu oceny MSC pochodzących z iPSC, badając markery powierzchniowe MSC CD44, CD73, CD105 i CD166 (Rysunek 2C).
      UWAGA: Rozcieńczenie przeciwciał przedstawiono w Tabeli 2. Barwienie immunofluorescencyjne żywych komórek odbywa się zgodnie z instrukcjami producenta.
    7. Po potwierdzeniu rozprężyć MSCs w stosunku 1:3 w 100 mm szalkach do hodowli tkankowych. Zamrażać fiolki (3 fiolki na 100 mm naczynie do hodowli tkankowych) przy użyciu pożywki zamrażającej zawierającej 10% DMSO i 90% FBS.
      UWAGA: Aby wzbogacić populację MSC, MSCs można sortować za pomocą kryteriów CD105+, CD24- według cytometrii przepływowej9,17. MSCs pochodzące z iPSC, zróżnicowane przy użyciu metody opartej na PDGF-AB, zwykle mogą być utrzymywane przez 2 - 3 miesiące w hodowli bez utraty tożsamości MSC9. Zamrozić MSC od wczesnego numeru przejścia po potwierdzeniu charakterystyki MSC.

3. Różnicowanie MSCs LFS do osteoblastów (Rysunek 3A)

  1. Przygotowanie MSCs do różnicowania osteogennego (Dzień -1)
    1. Aby zapewnić odpowiednią ilość komórek do wypełnienia protokołu różnicowania osteogennego, należy rozpocząć od MSCs hodowanych w 100-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowej do 95% konfluencji. Usunąć zużytą pożywkę hodowlaną i przemyć MSCs 5 ml 1x DPBS.
    2. Trypsynizować MSCs za pomocą 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA na 100 mm naczynia w temperaturze pokojowej przez 3 min. Aby upewnić się, że komórki nie są nadmiernie trypsynizowane, przerwij trypsynizację, gdy pod mikroskopem zaobserwuje się 50% oderwania komórek.
    3. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 9 ml pożywki hodowlanej MEF/MSC i zbierz MSCs z 3 dołków do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 230 x g w temperaturze 4 °C przez 4 min.
    4. Odessać supernatant, ponownie zawiesić MSCs w 5 ml pożywki MSC i policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    5. Umieść odpowiednią liczbę MSCs na płytce hodowlanej.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat liczby komórek na płytkach 12-dołkowych, 6-dołkowych i 100-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowych podsumowano w Tabeli 3.
  2. Indukcja różnicowania kościogennego przez pożywkę różnicującą osteoblasty (ODM) (Tabela 1) (Dzień 0 - 24):
    1. Odessać pożywkę hodowlaną MEF/MSC i zastąpić ją odpowiednią objętością ODM (1 ml, 2 ml i 8 ml na każdą studzienkę płytki 12-dołkowej, każdą studzienkę płytki 6-dołkowej i odpowiednio 100 mm szalkę do hodowli tkankowej) w celu rozróżnienia MSC do osteoblastów (dzień 0).
    2. Odsysaj zużyty ODM i zastępuj go odpowiednią objętością ODM co dwa dni podczas procesu różnicowania osteogennego.
    3. Wykonaj barwienie fosfatazą alkaliczną (AP) i czerwienią alizarynową S (ARS), aby wykryć fosfatazę alkaliczną związaną z kośćmi wytwarzaną przez preosteoblasty i odkładanie się minerałów wytwarzane przez dojrzałe osteoblasty, odpowiednio, w dniu 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 i 24 (Rysunek 3B).
      UWAGA: Barwienie AP i barwienie ARS są wykonywane przy użyciu dostępnego na rynku zestawu zgodnie z protokołem producenta.
    4. Zbadanie poziomów ekspresji markerów preosteoblastów i dojrzałych osteoblastów (ALPL i COL1A1 dla preosteoblastów; PTH1R i BGLAP dla dojrzałych osteoblastów) metodą qRT-PCR (Rysunek 3C).
      UWAGA: Dodatniego barwienia AP spodziewa się po 9 dniu różnicowania osteogennego, a dodatniego barwienia ARS można spodziewać się po 21 dniu różnicowania kościogennego. MSCs rosnące w pożywce hodowlanej MEF/MSC mogą służyć jako kontrola negatywna barwienia AP i barwienia ARS.

4. Model ksenoprzeszczepu do badania in vivo nowotworzenia osteoblastów pochodzących z LFS MSC (Rysunek 4A)

  1. Różnicowanie MSCs LFS do osteoblastów:
    1. Nasiona: 3 - 4,5 x 10,5 MSCs w naczyniu do hodowli tkankowej o średnicy 100 mm. Przygotuj pięć potraw do jednego wstrzyknięcia podskórnego.
    2. Hodowla MSCs w ODM w celu różnicowania MSCs do osteoblastów, jak opisano w 3.2 do dnia 14.
  2. Przygotowanie zróżnicowanych osteoblastów do wstrzyknięcia podskórnego:
    1. Aby przygotować roztwór odrywający osteoblasty (Tabela 1), rozpuść 1 g kolagenazy typu II w 1 000 ml pożywki αMEM, aby otrzymać roztwór kolagenazy II (1 mg/ml). Roztwór kolagenazy II należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Wymieszać 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i roztworu kolagenazy II w stosunku 1:1, aby uzyskać roztwór odłączający osteoblasty.
    2. Usuń zużyty ODM i umyj zróżnicowane osteoblasty 5 ml 1x DPBS na 100 mm naczynia.
    3. Dodać 1,5 ml roztworu odłączającego osteoblasty na 100 mm szalkę i inkubować szalki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Zbadać i upewnić się, że osteoblasty zostały oderwane pod mikroskopem.
    4. Zneutralizuj roztwór odłączający osteoblasty za pomocą ODM i zbierz oderwane osteoblasty w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Wirować przy 230 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min.
    5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 25 ml pożywki ODM. Przepuść komórki przez sitko o średnicy 70 μm, aby usunąć zagregowane komórki. Policz numery komórek za pomocą hemocytometru.
    6. Przygotować 1 x 107 osteoblastów na wstrzyknięcie podskórne i odwirować komórki w temperaturze 230 x g w temperaturze 4 °C przez 4 min.
    7. Ponownie zawiesić 1 x 107 osteoblastów w 50 μl lodowatego 1x DPBS. Wymieszaj zróżnicowane osteoblasty z 50 μl macierzy błony podstawnej wolnej od czerwieni fenolowej (zawiesinę osteoblastów i macierz błony podstawnej zmieszano w stosunku 1:1) i utrzymuj osteoblasty na lodzie przed wstrzyknięciem.
  3. Model guza ksenoprzeszczepu in vivo osteoblastów pochodzących z LFS MSC:
    1. Znieczulić 8-tygodniowe samice myszy NU/NU z obniżoną odpornością w komorze dostarczającej 5% (v/v) wdychanego izofluranu w 1 l/min tlenu (dostarczanego przez CLAMC). Po tym, jak zwierzę znajdzie się w pozycji leżącej, przełącz system podawania środka znieczulającego na stożek nosowy, dostarczając 2% (v/v) wdychanego izofluranu w 200 ml/min tlenu (dostarczanego przez CLAMC). Monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając odruchy rogówki i pedałów, aby myszy były wystarczająco znieczulone i nie odczuwały dyskomfortu podczas zabiegu.
    2. Zdezynfekuj obszar, który ma być wstrzyknięty, za pomocą naprzemiennych wacików z chlorheksydyną i 70% izopropanolem. Użyj igły 26 G, aby wykonać podskórne wstrzyknięcie osteoblastów LFS z macierzą podstawną do jednej strony tylnych nóg 8-tygodniowych myszy NU/NU z obniżoną odpornością (Figura 4A).
    3. Monitoruj myszy, wykonując cotygodniowe badanie palpacyjne w miejscach wstrzyknięć pod kątem wzrostu podskórnej gęstości guzkowej. Powstawanie guza można zaobserwować około 6-10 tygodni po wstrzyknięciu (Ryc. 4B).
    4. Poddaj myszy eutanazji metodą uduszenia dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięciu szyjki macicy. Rozetnij rozwinięte guzy. Określ stopień zaawansowania guza i wskaźnik różnicowania, preosteoblasty i dojrzałe osteoblasty za pomocą różnych metod barwienia (np. barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E), barwienie czerwienią Picro Sirius i barwienie von Kossa).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół przedstawia procedury obejmujące generowanie iPSC z LFS, różnicowanie MSC, różnicowanie osteoblastów oraz badanie tumorigenizacji in vivo z wykorzystaniem osteoblastów pochodzących z LFS MSC.

Schemat generowania iPSC LFS z fibroblastów przy użyciu komercyjnie dostępnego zestawu do przeprogramowania wirusem Sendai przedstawiono na Rysunku 1A. Dostarczanie czterech czynnikó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby osiągnąć wyższą skuteczność różnicowania MSC, kluczowe znaczenie ma kilka aspektów. Jednym z nich jest stan hodowli iPSC przed rozpoczęciem różnicowania MSC. Protokół przedstawiony w manuskrypcie oparty jest na wcześniejszych badaniach 9,17. Komórki iPS muszą być hodowane na MEF-ach przez co najmniej 2 tygodnie. Utrzymanie iPSC w dobrych warunkach na MEF ma kluczowe znaczenie dla łączenia komórek na płytce pokrytej żelatyną w celu różnicowania MSC. Innym ważn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

R. Z. jest wspierany przez UTHealth Innovation for Cancer Prevention Research Training Program Pre-Doctoral Fellowship (grant Cancer Prevention and Research Institute of Texas RP160015). J.T. jest wspierany przez Program Ke Lin Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Sun Yat-sen. D.-F.L. jest stypendystą CPRIT w dziedzinie badań nad rakiem i jest wspierany przez NIH Pathway to Independence Award R00 CA181496 i CPRIT Award RR160019.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wyroby plastikowe
100 mm NaczynieCorning430107
60 mm TalerzCorning430166
6-dołkowyFalcon353046
Końcówka do pipetUSA Scientific1111-2721
200 & mikro; L Końcówka do pipetUSA Scientific1111-0706
10 & mikro; L Końcówka do pipetUSA Scientific1111-3700
Pipeta serologiczna 5 mlSARSTEDT86.1253.001
Pipeta serologiczna 10 mlSARSTEDT86.1254.001
Pipeta serologiczna 25 mlSARSTEDT86.1685.001
Probówka 50 ml, PPSARSTEDT62.547.100
Probówka 15 mL, PPSARSTEDT62.554.100
Materiały i odczynniki
CytoTune- iPS 2.0 Zestaw do przeprogramowania SendaiInvitrogenA16517Komercyjny zestaw do przeprogramowania wirusa Sendai
Corning Matryca z kwalifikacją hESCCorning354277Matryca membrany podstawnej
CF1 MEF, napromieniowaneThermoFisherA34180
DMEMSigma-AldrichD5671
DMEM/F12Corning10-090-CV
α MEMCorning10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368Komercyjne podłoże iPSC
KnockOut DMEM/F-12ThermoFisher12660012
FBS Opti-GoldGenDEPOTF0900-050
Zamiennik serum do nokautuThermoFisherA3181502
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333
MEM Aminokwasy endogenneCorning25-025-CI
Roztwór L-glutaminySigma-AldrichG7513
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM3148
Ludzki FGF-zasadowy (bFGF)PEPROTECH100-18B
Rekombinowany ludzki PDGF-ABPEPROTECH100-00AB
β-glicerofosforanSigma-AldrichG9422
DeksametazonSigma-AldrichA4902
Kwas askorbinowySigma-AldrichA5960
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, 1x (DPBS)Corning21-031-CV
StemMACS Roztwór do pasowania XFMiltenyi Biotec130-104-688Komercyjne rozwiązanie do pasażowania
Accutatse Cell Detachment SolutionCorning25-058-CIRoztwór do odłączania komórek
Tiazovivin (inhibitor ROCK)Calbiochem420220
0,25% roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT4049
Kolagenaza, typ II   ThermoFisher17101015
Ludzkie przeciwciało NANOGR& D SystemAF1997
OCT4 Przeciwciało (H-134)Santa Cruzsc-9081
Ludzkie / mysie SSEA-4 PE sprzężone przeciwciałoR& D SystemFAB1435P
Alexa Fluor 555 Mysz anty-ludzka TRA-1-81 AntygenDB Biosciences560123
Alexa Fluor 488 Oślica IgG przeciwko kozom (H + L)Jackson ImmunoResearch705-545-003
Alexa Fluor 488 Koza IgG Anty-Królik (H + L)Jackson ImmunoResearch111-545-144
PE Mysz anty-ludzka CD105eBioscience12-1057-42
Mysz FITC Anti-Human CD44DB Biosciences555478
PE Mouse Anti-Human CD73DB Biosciences550257
PE Mouse Anti-Human CD166DB Biosciences560903
FITC Mouse Anti-Human CD24DB Biosciences555427
Surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-121
Kozia surowicaJackson ImmunoResearch005-000-121
Zestaw do barwienia fosfatazy alkalicznej IIStemgent00-0055
Alizarin Red SSigma-AldrichA5533
Odczynnik trizolowyThermoFisher15596018
ChloroformThermoFisherC298-500
2-PropanolThermoFisherA416-4
Etanol, absolutny, klasa biologii molekularnejThermoFisherBP28184
DNaza I, bez RNaz (1 U/&mikro; L)ThermoFisherEN0521
Zestaw do syntezy cDNA iScript BioRad1708891BUN
iQ SYBR Green SupermixBioRad1708884
Matrigel Matrix o wysokim stężeniu (HC), bez czerwieni fenolowejCorning354262
ml strzykawka z końcówką ślizgową, 26 Gauge x 5/8 calaDB Biosciences309597
Talerz 12-dołkowy Falcon 353043 Talerz 48-dołkowy Falcon 353078 1 ml 1

Bibliografia

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  4. Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
  5. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  6. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  7. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  8. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  9. Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
  10. Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
  11. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  12. Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  13. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
  14. Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
  15. Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
  16. Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
  17. Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
  18. Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

dyferencjacja iPSCmezenchymalne kom rki macierzystedyferencjacja osteoblast wtumorigenno in vivobarwienie na fosfataz alkalicznbarwienie Alizarin Red Sbarwienie immunofluorescencyjneiniekcja podsk rnamodel myszy nagojnych
Modelowanie kostniakomięsaka za pomocą zespołu Li-Fraumeni Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste pochodzące od pacjenta
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.