Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57672

⸱

28 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, University of Southern California, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, LAC+USC Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Zakaźne zapalenie płuc jest jedną z najczęstszych infekcji u ludzi. Odpowiedni model in vivo ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogenezy choroby i testowania skuteczności nowych terapii. Dzięki temu mysiemu modelowi aspiracyjnego zapalenia płuc w jamie ustnej i gardle można zbadać patogenezę i nowe metody leczenia tych śmiertelnych infekcji.

Streszczenie

Modele infekcji mysich są kluczowe dla zrozumienia patogenezy choroby i testowania skuteczności nowych terapii przeznaczonych do zwalczania patogenów wywołujących. Zakaźne zapalenie płuc jest jednym z najczęstszych zakażeń zgłaszanych przez pacjentów w klinice, dlatego wymaga odpowiedniego modelu in vivo. Typowe modele zapalenia płuc wykorzystują inokulację donosową, która odkłada nadmiar organizmów poza płucami, powodując niezamierzone powikłania i objawy, takie jak zapalenie zatok, zapalenie żołądka, zapalenie jelit, uraz fizyczny lub mgła mikrocząsteczkowa, aby naśladować rozprzestrzenianie się aerozolu bardziej typowe dla wirusowego, gruźliczego lub grzybiczego zapalenia płuc. Modele te nie odzwierciedlają dokładnie patogenezy typowego bakteryjnego zapalenia płuc nabytego w społeczności lub opiece zdrowotnej. W przeciwieństwie do tego, ten mysi model zachłystowego zapalenia płuc w jamie ustnej i gardle naśladuje drogę kropelkową w zapaleniu płuc nabytym w opiece zdrowotnej. Zaszczepienie 50 μl zawiesiny bakterii do jamy ustnej gardła znieczulonych myszy powoduje odruchowe aspirację, co skutkuje zapaleniem płuc. Dzięki temu modelowi można badać patogenezę patogenów wywołujących zapalenie płuc i nowe metody leczenia tych chorób.

Wprowadzenie

Infekcja dolnych dróg oddechowych jest najbardziej śmiertelną chorobą zakaźną na świecie i najczęstszą przyczyną zgonów w krajach rozwijających się1. Na całym świecie infekcje te odpowiadają za ponad 3,2 miliona zgonów1. Ponadto szpitalne zapalenie płuc jest jedną z najczęstszych i najbardziej śmiertelnych form zakażeń nabytych w opiece zdrowotnej i jest wywoływane przez najbardziej oporne na antybiotyki patogeny2,3. Typową drogą nabycia bakteryjnego zapalenia płuc zarówno w przypadku pozaszpitalnego, jak i szpitalnego zapalenia płuc jest aspiracja treści ustno-gardłowej do pęcherzyków płucnych. Mysie modele używane do badania tych chorób często używają inokulacji donosowej4, odkładając większość bakterii poza płucami, powodując niezamierzone powikłania i objawy, takie jak zapalenie zatok i uraz fizyczny, które są niezgodne z postępem choroby u człowieka, do naśladowania którego zostały zaprojektowane modele. Inne modele mogą wykorzystywać komory inhalacyjne i urządzenia do mikrozamgławiania, które dokładniej naśladują wirusowe, gruźlicze i grzybicze zapalenie płuc, ale nie odwzorowują dokładnie normalnej drogi nabycia typowych bakteryjnych zapaleń płuc.

Model mysiego zapalenia płuc z aspiracją ustno-gardłową może być wykorzystany do symulacji naturalnej drogi i patogenezy bakteryjnego zapalenia płuc. Poprzez zaszczepienie 50 μl zawiesiny bakteryjnej do jamy ustnej gardła znieczulonych myszy za pomocą pipety, następuje odruchowe aspiracja, która powoduje zakaźne zapalenie płuc. Korzystając z tego modelu, można badać patogenezę patogenów wywołujących zapalenie płuc i nowe metody leczenia tych chorób za pomocą modelu o wyższej wierności, bardziej analogicznego do zakażeń zachłystowego zapalenia płuc obserwowanych u ludzi. Dodatkowo, w przeciwieństwie do podobnych modeli, które infekują przez jamę ustną5,6, ten model zapewnia, że pełne inokulum dociera do płuc zamiast do jelit, gdzie może powodować stan zapalny i infekcje poza miejscem zdarzenia, takie jak zapalenie żołądka i zapalenie jelit. Wreszcie, w przeciwieństwie do innego opublikowanego modelu, który wymaga laryngoskopu i zaszczepia przez trachea7, ten model nie blokuje dróg oddechowych za pomocą igły do zgłębnika i nie wymaga wstrzyknięcia w celu podania inokulum. Zamiast tego inokulacja opiera się na naturalnym odruchu aspiracji myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt muszą być zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).

1. Przygotowanie inokulum bakteryjnego

  1. Wyizoluj kolonie bakterii.
    1. Szczep bakteryjny (np. A. baumannii "HUMC1") należy rozprowadzić na odpowiednim sterylnym podłożu agarowym (np. Tryptycznym agarze sojowym), uważając, aby wytworzyć izolowane kolonie.
    2. Inkubować w odpowiednich warunkach (np. przez noc w temperaturze 37 °C).
  2. Uprawiaj kulturę z dnia na dzień.
    1. Wybrać reprezentatywną, wyizolowaną kolonię z płytki agarowej ze sterylną pętlą zaszczepiającą i użyć jej do zaszczepienia 10 ml odpowiedniego sterylnego podłoża bulionowego (np. Tryptycznego bulionu sojowego).
    2. Pozwolić, aby próbka dotarła do fazy stacjonarnej w odpowiednich warunkach (np. w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez noc w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml z wentylowaną nakrętką).
  3. Rozwijaj subkulturę.
    1. Przenieś 100 μl nocnej kultury do 10 ml świeżego sterylnego bulionu za pomocą pipety.
    2. Pozostawić do osiągnięcia fazy wykładniczej/logarytmicznej w odpowiednich warunkach (np. 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 3 godziny w stożkowej fiolce o pojemności 50 ml z odpowietrzoną nakrętką).
  4. Umyj subkulturę.
    1. Usuń subkulturę z jej inkubującego środowiska.
    2. Wirować przy 4 000 × g przez 5 minut, aby osadzać bakterie.
    3. Odessać i wyrzucić supernatant.
    4. Dodać 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do osadu i energicznie mieszać, aż do całkowitego zawieszenia.
    5. Powtórz kroki 1.4.2 - 1.4.4 dwukrotnie, w sumie 3 prania.
  5. Dostosuj stężenie zawiesiny bakteryjnej.
    1. Za pomocą spektrofotometru, który mierzy gęstość optyczną przy 600 nm (OD600), zmierz gęstość optyczną zawiesiny bakteryjnej.
    2. Dodać sterylny PBS do zawiesiny bakteryjnej, aż gęstość optyczna inokulum spadnie do OD600 0,5, stosując równanie Ci×Vi = Cf×Vf, gdzie "C" to stężenie, "V" to objętość, "i" to wartość początkowa, a "f" to wartość końcowa. *Cf powinno zawsze wynosić 0,5; Vf jest zmienną do rozwiązania.
    3. Jeśli zawiesina bakteryjna spadnie poniżej OD600 wynoszącego 0,5, odwirować ją przy 4,000 × g przez 5 minut, aby osadzać bakterie i usunąć odpowiednią ilość supernatantu, aby osiągnąć OD600 0,5.
    4. Wykonaj seryjne rozcieńczenia w sterylnym PBS (np. trzy rozcieńczenia 1:100, aby uzyskać 1 × 10-6) i płytkę na sterylnym agarze w celu wyznaczenia współczynnika korelacji, który ujawnia stężenie bakterii w jednostkach tworzących kolonie na ml (jtk/ml) przy OD600 0,5,5,
      Uwaga: Wartość tego współczynnika korelacji będzie różna dla każdego szczepu każdego gatunku i musi być określona przed przygotowaniem inokulum na infekcję.
    5. Po ustaleniu współczynnika korelacji, użyć go do stworzenia inokulum o pożądanym stężeniu (np. 2 × 108-1 × 109 CFUs/mL); jeśli pożądane inokulum jest większe niż OD600 0,5, odwirować zawiesinę bakteryjną o stężeniu 4000 × g przez 5 minut w celu osadzenia bakterii i usunąć odpowiednią ilość supernatantu, aby osiągnąć pożądane stężenie.
    6. Wykonaj badania pilotażowe in vivo, aby określić zjadliwość każdego izolatu bakteryjnego w każdym szczepie myszy, ponieważ wartości te będą się różnić między izolatami bakteryjnymi tego samego gatunku a myszami o różnym pochodzeniu genetycznym. Dla różnych gatunków Gram-ujemnych LD100 u myszy wynosi na ogół 1 - 5 × 108 CFU / mysz, chociaż niektóre szczepy są śmiertelne przy niższych inokulach.
  6. Zamroź identyczne porcje do wykorzystania w przyszłości jako precyzyjny inokula na żądanie, jak wcześniej opublikowano8 (opcjonalnie).
    1. Przygotować 1 l inokulum bakteryjnego zgodnie z powyższym opisem, przenieść do dwóch stożkowych fiolek o pojemności 500 ml i odwirować przy 4 000 × g przez 5 minut.
    2. Odrzucić 450 ml supernatantu z każdej stożkowej fiolki i ponownie zawiesić granulki bakterii w pozostałym supernatantze.
    3. Przenieść skoncentrowane inokulum bakteryjne do zlewki o pojemności 250 ml zawierającej mieszadło magnetyczne i ciągle mieszać na płytce mieszającej z prędkością 300 obr./min.
    4. Ostrożnie przenieść dokładnie 600 μl skoncentrowanego inokulum bakteryjnego (np. 1 ×10 10 CFUs/ml) za pomocą pipety do 1,6 ml fiolki kriogenicznej zawierającej dokładnie 300 μl sterylnegoH2Oi 300 μL sterylnego glicerolu; wymieszać i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      Uwaga: Glicerol niezbędny do przechowywania może zakłócić wyniki eksperymentów i spowodować nadmierną śmiertelność, dlatego konieczne jest jej wypłukanie.
    5. Gdy próbka jest gotowa do użycia, rozmrażać ją przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Przenieś 1 ml do stożkowej fiolki o pojemności 50 ml, dodaj 9 ml sterylnego PBS i odwiruj przy 4 000 × g przez 5 minut, aby otoczkować bakterie. Odessać supernatant i ponownie zawiesić wcześniej określoną ilość jtk (1 ml × stężenie zamrożonego materiału w jtk/ml) w odpowiedniej objętości PBS, aby osiągnąć pożądane stężenie dla inokulum zakaźnego.

2. Myszy anestezjologiczne

  1. Ketamina/Ksylazyna
    Uwaga: Znieczulenie ketaminą/ksylazyną trwa długo, co daje badaczowi, który jest nowy w tej technice, wystarczająco dużo czasu na zakończenie procedury inokulacji, zanim mysz się obudzi.
    1. Przygotować 10 ml roztworu do wstrzykiwań, łącząc 8,5 ml PBS klasy farmaceutycznej, 1 ml 100 mg/ml roztworu podstawowego ketaminy (końcowe stężenie 10 mg/ml) i 0,5 ml 20 mg/ml roztworu podstawowego ksylazyny (końcowe stężenie 10 mg/ml).
    2. Podawać 10 μl/g we wstrzyknięciu dootrzewnowym (IP) (np. 250 μl dla myszy 25 g).
    3. Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy znieczulonych ketaminą/ksylazyną, ponieważ ich oczy są podatne na uszkodzenia podczas dłuższych okresów znieczulenia.
    4. Umieść mysz w klatce i monitoruj, aż wybudzi się ze znieczulenia.
      Uwaga: Zwierzę nie powinno być pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku.
  2. Izofluran
    Uwaga: Myszy szybko budzą się ze znieczulenia wywołanego izofluranem po wyjęciu z komory indukcyjnej, więc ta metoda znieczulenia powinna być stosowana dopiero po osiągnięciu biegłości w procedurze inokulacji.
    1. Umieść naiwne myszy w odpowiedniej wielkości komorze indukcyjnej z przepływającym tlenem.
    2. Po zamknięciu komory znieczulij myszy za pomocą precyzyjnego waporyzatora, aby dodać izofluran w stężeniu 4% (v/v) przez co najmniej 5 minut; potwierdź znieczulenie, wyjmując mysz z komory indukcyjnej i mierząc, ile czasu zajmuje wybudzenie się z narkozy (~60 s).
      Uwaga: Należy pamiętać, że czas znieczulenia może się różnić w zależności od wytycznych instytucjonalnych, a niektóre zwierzęta mogą potrzebować więcej niż 5 minut, aby w pełni się znieczulić.
    3. Utrzymuj znieczulenie do 10 minut, dostosowując stężenie izofluranu do 2 - 3%; jeśli całkowity czas znieczulenia wynosi >15 minut, nałóż maść okulistyczną na oczy znieczulonych myszy.
    4. Umieść mysz w klatce i monitoruj, aż obudzi się ze znieczulenia, jak w kroku 2.1.

3. Zaszczepianie/zarażanie myszy

  1. Zawieś znieczuloną mysz, zawieszając ją za górne siekacze na mocnym, cienkim sznurku (np. nici dentystycznej) przymocowanym do nieruchomego przedmiotu na wysokości około dwukrotności długości ciała myszy (np. 20 cm) nad powierzchnią roboczą (np. ławką laboratoryjną).
  2. Delikatnie wyciągnij język myszy z ust za pomocą sterylnych, tępo zakończonych kleszczy. Przenieś język na sterylny palec w rękawiczce, aby zapobiec przypadkowemu zmiażdżeniu języka myszy. Trzymaj język na zewnątrz jamy ustnej, umożliwiając dostęp do części ustnej gardła i zapobiegając połknięciu inokulum na bok.
  3. Trzymając język myszy, umieść 50 μl inokulum (zawiesiny bakteryjnej) w jamie ustnej i gardle za pomocą mikropipety; część ustna znajduje się na styku jamy ustnej i gardła w kierunku tylnej części jamy ustnej.
    Uwaga: Bardzo ważne jest, aby dostarczać płyn wyłącznie pipetując do pierwszego przystanku mikropipety. Mysz przestanie oddychać na kilka sekund, gdy inokulum zostanie umieszczone w jamie ustnej gardła; W końcu odruchowe aspiracja spowoduje, że mysz wdycha zawiesinę bakteryjną, na co wskazuje charakterystyczny trzask płynu dostającego się do płuc, co skutkuje infekcją zapalenia płuc.
  4. Jeśli inokulum nie jest umieszczone wystarczająco daleko z tyłu, aby zablokować normalne oddychanie, ściśnij nozdrza kleszczami, aby wymusić odruchowe aspirację przez usta, a następnie wdychanie inokulum.
  5. Po zaszczepieniu zwolnij język, zdejmij mysz ze sznurka do zawieszenia, umieść ją w klatce i monitoruj, aż wybudzi się ze znieczulenia, jak w kroku 2.1.

4. Monitorowanie postępu choroby

Uwaga: Ze względu na cierpienie zwierząt, różne wskaźniki powinny być używane do wskazania, kiedy myszy stają się w stanie agonalnym; eutanazja powinna być przeprowadzona po tym ustaleniu, zgodnie z wcześniej zatwierdzonym protokołem IACUC; różne markery umierania obejmują temperaturę ciała, utratę wagi, wygląd, chód i inne biomarkery, które można uzyskać z krwi (np. za pomocą iSTAT)9,10,11,12,13,14,15,16.

  1. Poddać myszy eutanazji zgodnie z wcześniej zatwierdzonym protokołem IACUC (np. CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy).
  2. Usuń płuca z uśpionej myszy, przecinając tchawicę, tętnicę płucną i żyłę płucną w pobliżu płuc.
    1. mikroskopia
      1. Umieść płuca (lub część) w formie na próbkę.
      2. Wypełnij formę próbki związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (O.C.T.), całkowicie zanurzając tkankę.
      3. Zamrażać próbkę w temperaturze -80 °C.
      4. Wyślij próbkę do laboratorium patomorfologicznego, aby ją przeciąć i zamontować na szkiełkach do mikroskopii.
    2. Obciążenie bakteryjne
      1. Zważyć tkankę płucną na wadze analitycznej.
      2. Przenieść tkankę płucną do stożkowej fiolki o pojemności 50 ml zawierającej 2 - 5 ml sterylnego PBS (w zależności od wielkości tkanki).
      3. Homogenizować tkankę płucną za pomocą homogenizatora tkankowego.
      4. Wykonać seryjne rozcieńczenia homogenatu w sterylnym PBS, aby osiągnąć około 1,000 CFU/ml, w oparciu o oczekiwane obciążenie bakteryjne w płucach.
        1. Na przykład, jeśli spodziewane jest 1 × 109 CFUs/mg, wykonaj trzy rozcieńczenia 1:100: Przenieś 100 μl homogenatu do 9,9 ml PBS i odwiruj; jest to pierwsze rozcieńczenie 1:100. Przenieść 100 μl pierwszego rozcieńczenia w stosunku 1:100 do 9,9 ml PBS i zawirować; Jest to drugie rozcieńczenie 1:100. Przenieść 100 μl drugiego rozcieńczenia 1:100 do 9,9 ml PBS i wirować; Jest to trzecie i ostatnie rozcieńczenie 1:100.
        2. Jeśli obciążenie bakteryjne w płucach jest nieznane, wykonaj szereg rozcieńczeń, aby uchwycić oczekiwany zakres.
      5. Rozcieńczenie (rozcieńczenia) płytki na sterylnym agarze
        1. Przygotuj sterylny bulion sojowy tryptyczny (TSB) z płytkami agarowymi (TSA): Połącz 30 g TSB, 15 g agaru i 1 l wody, wymieszaj z mieszadłem magnetycznym i podgrzewaj do wrzenia w temperaturze ~100 °C przez 5 minut. Pozostaw do ostygnięcia, a następnie sterylizuj w autoklawie w cyklu płynnym przez 15 minut. Pozostaw do ostygnięcia do ~55 °C, przenieść 10 ml świeżo autoklawizowanego TSA na sterylne szalki Petriego i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Pozostaw do wyschnięcia na blacie przez 2 - 5 dni lub bez przykrycia pod szafką bezpieczeństwa biologicznego przez 10 minut.
        2. Przenieść 100 μl rozcieńczenia na szalkę Petriego zawierającą sterylny TSA i rozprowadzić na TSA za pomocą rozsiewacza lub szklanych kulek.
        3. Przechowywać szalkę Petriego przez noc w temperaturze 37 °C w nawilżanym inkubatorze (tj. inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym odkrytą 1-litrową zlewkę wypełnioną wodą)
      6. Oznaczyć homogenat płuc jtk/ml na podstawie posiewu agarowego (np. 100 jtk na płytce TSA ze 100 μl trzeciego i końcowego rozcieńczenia opisanego powyżej wyniesie 100 jtk/100 μl × 100dil#1 × 100dil#2 × 100dil#3 = 1×109 jtk/ml).
      7. Obliczać jtk jtk/mg tkanki płucnej na podstawie podzielenia homogenatu płuc jtk/ml przez mg homogenatu tkanki płucnej/ml (np. jeśli w próbce opisanej powyżej użyto 100 mg tkanki płucnej homogenizowanej w 5 ml PBS, to 1 × 109 jtk/ml ÷ 100 mg/5 ml = 5 × 107 jtk/mg).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poprzez dokładne przestrzeganie protokołu można łatwo uzyskać powtarzalne i wiarygodne dane. W przypadku eksperymentów porównawczych kluczowe jest ścisłe stosowanie spersonalizowanego protokołu przygotowania szczepionki. Ważne jest również prawidłowe obchodzenie się z myszami podczas procedury zakażania. Należy umieścić myszy w komorze anestezjologicznej pozbawionej izofluranu. Myszy mogą wpaść w panikę, jeśli zostaną umieszczone w komorze uprzednio wypełnionej izofluranem, co może wywoła...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Z pewnością myszy nie są miniaturowymi ludźmi. Wyniki uzyskane z modeli mysich muszą być rozpatrywane w kontekście, a następnie interpretowane pod kątem możliwości zastosowania u ludzi, w oparciu o różnice i podobieństwa między tymi dwoma gatunkami6. Ważne jest również, aby wybrać odpowiednią odmianę myszy, ponieważ niektóre są bardziej podatne na niektóre infekcje niż inne; To samo dotyczy szczepu patogenu z wyboru16.

Niezbędne jest przeprowadza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych w Narodowym Instytucie Zdrowia [Granty o numerach R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 i R42 AI106375 do BS] oraz Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków [Umowa HHSF223201710199C do BML].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarBD214530Połącz z TSB, aby zrobić
koraliki TSA, szkło borokrzemianoweKimble135003Sterylizuj przez pieczenie lub autoklawowanie przed każdym użyciem
Zlewka, 250 mlPyrex1003Używany podczas precyzyjnego porcjowania skoncentrowanego inokulu bakteryjnego
WirówkaSorvallST 40RZdolny do 4,000 i razy; g przy 4& stopniach; C
Komora do znieczuleniaKent Scientific CorporationVetFlo-0720Może pomieścić do 5 myszy
Cryomold, średni rozmiarSakura Tissue-Tek4566Jednorazowe formy do próbek winylowych, 15 i razy; 15 razy;
Nić dentystyczna5 mm Oral-B37000469537Przywiązać do stabilnego słupka ok. 6 cali nad wysokością stołu
KleszczeVWR82027-440Służy do delikatnego wyciągania języka z ust myszy
Homogenizator do tkanki płucnej AutoklawOmni InternationalTM125-115przed pierwszym użyciem; płukać między próbkami
Izofluran do znieczuleniaAbbott10015516Można zastosować alternatywny lek; odpowiednio zmodyfikuj procedurę
Wkład iSTATAbbott03P79-25Dostępne są różne wkłady dostosowane do Twoich potrzeb
Ketamina, 100 mg / mlWestern Medical Supply4165Rozcieńczyć 1:10 w PBS do 1 mg / ml i połączyć z ksylazyną w 1 mg / ml
Maść do oczuAkornTears OdnowioneUnikaj dotykania oka końcówką dozownika
Optymalna temperatura cięcia (O.C.T.) ZwiązekFisher Scientific23-730-571Służy do zamrażania próbek płuc w temperaturze -80 & stopni; C do przygotowania do sekcji patologicznej
szalka PetriegoVWR25384-302Polistyren, jednorazowy, sterylizowany, 100 i razy; 15 mm
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Corning21-031-CMPBS firmy Dulbecco bez końcówek do pipet z wapniem i magnezem
, 200-μ LVWR10017-044Autoklaw przed użyciem
Pipet, 200-μ LGilsonPipetman P200i kalibracja przed użyciem
Rozsiewacz, komórka bakteryjnaBel-ArtF377360006Sterylizuj przez pieczenie lub autoklawowanie przed każdym użyciem
Mieszadło, magnetyczne, średnica 7,9 mm i czasy; długość 38,1 mmVWR58948-150Służy do mieszania skoncentrowanej inokulacji bakteryjnej podczas porcjowania
Płytka mieszająca, magnetycznaCorningPC-620DSłuży do mieszania skoncentrowanych inokulantów bakteryjnych podczas porcjowania
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)BD211822Połącz z agarem, aby uzyskać
TSA Fiolka, stożkowa, sterylna, 50 mlCorning431720Służy do przygotowania inokulacji bakteryjnej
Fiolka, stożkowa, sterylna, 500 mlCorning 431123Służy do zagęszczania inokulantu do przygotowania mrożonej inokuli
Fiolka, kriogeniczna, 2,0 mlCorning430659Służy do kriogenicznego przechowywania skoncentrowanej inokuli bakteryjnej
Ksylazyna, 20 mg/mlAkornAnaSed IniekcjaRozcieńczyć w stosunku 1:20 w PBS do 1 mg/ml i połączyć z ketaminą w stężeniu 1 mg/ml
Autoklaw

Bibliografia

  1. Media Centre, W. H. O. World Health Organization. Fact Sheet - Top 10 Causes of Death. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/ (2017).
  2. Spellberg, B., Talbot, G. H. Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia. Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).
  3. Kalil, A. C., et al. Management of Adults With Hospital-acquired and Ventilator-associated Pneumonia: 2016 Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clinical Infectious Diseases. 63 (5), e61-e111 (2016).
  4. Medina, E. Murine model of pneumococcal pneumonia. Methods in Molecular Biology. , 405-410 (2010).
  5. Azoulay-Dupuis, E., et al. In vivo efficacy of a new fluoroquinolone, sparfloxacin, against penicillin-susceptible and -resistant and multiresistant strains of Streptococcus pneumoniae in a mouse model of pneumonia. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (12), 2698-2703 (1992).
  6. Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (3), L387-L398 (2008).
  7. Rayamajhi, M., et al. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (51), (2011).
  8. Nielsen, T. B., Bruhn, K. W., Pantapalangkoor, P., Junus, J. L., Spellberg, B. Cryopreservation of virulent Acinetobacter baumannii to reduce variability of in vivo studies. BMC Microbiology. 15, 252(2015).
  9. Trammell, R. A., Toth, L. A. Markers for predicting death as an outcome for mice used in infectious disease research. Comparative Medicine. 61 (6), 492-498 (2011).
  10. Bast, D. J., et al. Novel murine model of pneumococcal pneumonia: use of temperature as a measure of disease severity to compare the efficacies of moxifloxacin and levofloxacin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (9), 3343-3348 (2004).
  11. Hankenson, F. C., et al. Weight loss and reduced body temperature determine humane endpoints in a mouse model of ocular herpesvirus infection. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (3), 277-285 (2013).
  12. Adamson, T. W., Diaz-Arevalo, D., Gonzalez, T. M., Liu, X., Kalkum, M. Hypothermic endpoint for an intranasal invasive pulmonary aspergillosis mouse model. Comparative Medicine. 63 (6), 477-481 (2013).
  13. Nielsen, T. B., et al. Diabetes Exacerbates Infection via Hyperinflammation by Signaling through TLR4 and RAGE. mBio. 8 (4), (2017).
  14. Nielsen, T. B., et al. Monoclonal Antibody Protects Against Acinetobacter baumannii Infection by Enhancing Bacterial Clearance and Evading Sepsis. Journal of Infectious Diseases. 216 (4), 489-501 (2017).
  15. Cheng, B. L., et al. Evaluation of serotypes 5 and 8 capsular polysaccharides in protection against Staphylococcus aureus in murine models of infection. Human Vaccine Immunotherapy. 13 (7), 1609-1614 (2017).
  16. Wong, D., et al. Clinical and Pathophysiological Overview of Acinetobacter Infections: a Century of Challenges. Clinical Microbiology Reviews. 30 (1), 409-447 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mysi model zapalenia płucventilator-associated pneumonia (zapalenie płuc związane z wentylacją mechaniczną)homogenizacja tkanki płucnejjednostki tworzące kolonieanaliza histopatologicznaoptimal cutting temperature (optymalna temperatura cięcia)rozcieńczenia seryjneagar sojowy z tryptonem
Mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.