Test infekcji roślin: inokulacja w sprayu i za pośrednictwem ran patogenem roślinnym Magnaporthe Grisea

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do testowania zjadliwości roślin z patogenem roślinnym Magnaporthe grisea. Raport ten przyczyni się do zakrojonych na szeroką skalę badań przesiewowych patotypów izolatów grzybów i posłuży jako doskonały punkt wyjścia do zrozumienia mechanizmów oporności roślin podczas hodowli molekularnej.

Streszczenie

Rośliny posiadają potężny system obrony przed potencjalnymi zagrożeniami ze strony chorobotwórczych grzybów. Jednak w przypadku roślin ważnych z rolniczego punktu widzenia obecne środki zwalczania takich patogenów okazały się zbyt konserwatywne, a tym samym niewystarczająco skuteczne, a ponadto mogą potencjalnie stanowić zagrożenie dla środowiska. Dlatego niezwykle konieczne jest zidentyfikowanie czynników odporności gospodarza, aby pomóc w naturalnym zwalczaniu chorób roślin poprzez identyfikację opornej plazmy zarodkowej, izolację i charakterystykę genów odporności oraz hodowlę molekularną odpornych odmian. W związku z tym istnieje potrzeba ustanowienia dokładnej, szybkiej i zakrojonej na szeroką skalę metody inokulacji w celu rozmnażania i rozwijania genów odporności roślin. Patogen grzybowy zatruwki ryżu Magnaporthe grisea powoduje poważne objawy chorobowe i straty w plonach. Ostatnio M. grisea pojawił się jako organizm modelowy do badania mechanizmów interakcji patogenów roślinnych i grzybowych. W związku z tym informujemy o opracowaniu metody badania wirulencji roślin, która jest specyficzna dla M. grisea. Metoda ta przewiduje zarówno inokulację w sprayu zawiesiną konidialną, jak i inokulację raniącą kostkami grzybni lub kropelkami zawiesiny konidialnej. Kluczowym etapem metody inokulacji zranień dla oderwanych liści ryżu jest wykonanie ran na liściach roślin, co pozwala uniknąć wszelkich zakłóceń spowodowanych odpornością na penetrację żywiciela. Ten protokół rozpylania/ranienia przyczynia się do szybkiego, dokładnego i zakrojonego na szeroką skalę badania przesiewowego patotypów izolatów M. grisea. Ta zintegrowana i systematyczna metoda infekcji roślin będzie doskonałym punktem wyjścia do uzyskania szerokiej perspektywy zagadnień z zakresu patologii roślin.

Wprowadzenie

Podmuch ryżu, wywołany przez M. grisea, jest jedną z najpoważniejszych chorób odmian ryżu na świecie^1,2. Proces, w którym M. grisea infekuje rośliny żywicielskie, obejmuje produkcję konidiów i przyczepianie się do powierzchni, kiełkowanie konidiów i tworzenie appressorium, tworzenie kołka penetracyjnego i różnicowanie strzępek zakaźnych oraz rozprzestrzenianie się choroby³. Wszystkie te etapy są powszechne w wielu innych grzybach chorobotwórczych dla roślin i rzeczywiście, blokada dowolnego pojedynczego etapu zapobiega infekcji roślin żywicielskich. Ze względu na swoje znaczenie gospodarcze i wykonalność genetyczną, M. grisea stał się organizmem modelowym do badania mechanizmów interakcji patogenów roślinnych i grzybowych^1,4. W związku z tym badanie molekularnych podstaw tych etapów rozwojowych u M. grisea pomoże wyjaśnić mechanizmy molekularne leżące u podstaw patogeniczności grzybów oraz zidentyfikować potencjalne geny docelowe do badań przesiewowych i projektowania nowych fungicydów⁵.

Ostatnie raporty dotyczące infekcji M. grisea skupiały się na molekularnych mechanizmach etapów poprzedzających penetrację, zwłaszcza na konidycji, tworzeniu się appressorium, kołkach penetracyjnych i wzroście zakaźnym^3,6. Dlatego konieczne jest opracowanie szczegółowego protokołu testowania zakażenia M. grisea. W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółową metodę testu infekcji, która wykorzystuje testy infekcji za pośrednictwem sprayu z zawiesiną konidialną i inokulacją ran czopami grzybni M. grisea. W tym raporcie protokół koncentruje się na hodowli szczepów, przygotowaniu roztworu do konidyacji do opryskiwania oraz inokulacji roślin M. grisea za pośrednictwem czopów grzybniowych. Kroki te zostały szczegółowo opisane poniżej, a schematyczny widok przedstawiający cały przebieg metody i typową zmianę przedstawiono odpowiednio na rysunkach 1 i 2.

Protokół

1. Inokulacja w sprayu z zawiesiną konidiów M. grisea

1. Kultura grzybów dla M.grisea
   1. Przygotuj pożywkę do hodowli pomidorów owsianych (OTA) dla szczepów grzybów.
   2. Zważ 30 - 50 g płatków owsianych, dodaj je do 800 ml wody destylowanej/dejonizowanej (ddH₂O) i gotuj mieszaninę przez 30 minut w garnku elektrycznym.
   3. Przefiltruj ugotowany sok owsiany do zlewki przez kawałek gazy.
   4. Dodać 150 ml soku pomidorowego i 20 g agaru do filtratu w zlewce i dodać ddH₂O do 1 000 ml.
2. Przygotowanie materiałów doświadczalnych
   1. Namocz około 50 nasion ryżu (Oryza sativa) odmiany Lijiangxintuan-heigu (LTH) w ddH₂O przez 3 dni lub namocz około 50 nasion jęczmienia (Hordeum vulgare cv Golden Promise) w ddH₂O przez około 1 d.
   2. Zawinąć nasiona ryżu lub jęczmienia w wilgotną gazę i wykiełkować je na wilgotnej bibule filtracyjnej na około 30 szalkach Petriego o średnicy 10 cm x 10 cm w temperaturze 28 °C. Czas kiełkowania nasion ryżu wynosi około 2 - 3 dni, czas kiełkowania nasion jęczmienia wynosi około 2 dni. Wilgotność względna w szklarni wynosi około 70%.
   3. Posadź sadzonki ryżu lub jęczmienia w doniczkach, używając autoklawowanej ziemi doniczkowej i podlewania, a następnie przykryj je warstwą wermikulitu.
   4. Umieść rośliny w odpowiedniej szklarni lub komorze wzrostowej w temperaturze 25 °C na około 1 ~ 2 tygodnie.
   5. Wytnij 3 warstwy bibuły filtracyjnej w kółkach sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi (każde kółko powinno mieć średnicę 8 cm) i umieść je na sterylnych plastikowych płytkach o średnicy 100 mm.
   6. Dodaj ddH₂O do każdego naczynia, aby namoczyć bibułę filtracyjną.
   7. Upewnij się, że bibuła filtracyjna jest całkowicie mokra, ale nie dodawaj dodatkowej wody.
   8. Usuń nadmiar wody za pomocą pompy próżniowej.
   9. Umieść 2 sterylne wykałaczki w naczyniu hodowlanym, aby podeprzeć liście ryżu/jęczmienia; rozmieść wykałaczki w odległości ~2 - 3 cm od siebie.
   10. Liście ryżu należy zebrać 2 tygodnie po wysianiu nasion lub pobrać liście jęczmienia 7 dni po wysianiu nasion.
   11. Używając 4- do 6-listnych sadzonek ryżu/jęczmienia, odetnij dolną część łodygi w odległości ~5 cm od góry i zbierz liście.
3. Protokół inokulacji w sprayu
   1. Hodowla szczepu grzyba na płytkach OTA w inkubatorze termostatycznym (25 °C) przez ~4 dni.
   2. Dodaj ~2 ml ddH₂O za pomocą pipety 0,5 - 5 ml do każdej 4-dniowej płytki.
   3. Za pomocą pętli inokulacyjnej zeskrob grzybnię szczepu M. grisea typu dzikiego i zmutowany szczep do szczątków grzybni.
   4. Zbierz resztki grzybni i przenieś je na nową płytkę tubą optyczną. Weź resztki grzybni i wysusz je suszarką na czystej ławce.
   5. Przykryj płytkę 3 warstwami gazy, aby zapewnić wilgotność wymaganą do wzrostu konidiów w szklarni w temperaturze 25 °C w dzień (14 h) i 23 °C w nocy (10 h) przez 24 - 48 h.
   6. Dodaj 2 ml ddH₂O do każdego naczynia i delikatnie zeskrob konidia sterylnymi bawełnianymi wacikami, a następnie przefiltruj przez 2 warstwy bibuły do soczewek. Uważaj, aby nie zarysować powierzchni pożywki hodowlanej.
   7. Przenieść zawiesinę konidiów do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 100 - 1 000 μl.
   8. Wirować przez 5 minut przy minimalnej sprężystości 5 000 x g w temperaturze 25 °C.
   9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad, aby uzyskać 2 x 10⁴ konidiów na ml w 0,025% (v/v) roztworze Tween-20. Roztwór Tween-20 ma zwykle około 10 - 20 ml.
   10. Wlej zawiesinę zarodników do ręcznego opryskiwacza.
   11. Spryskać około 10 ml zawiesiny konidialnej na liście ryżowe 2-tygodniowych siewek ryżu lub liście jęczmienia 7-dniowych sadzonek jęczmienia i inkubować je w temperaturze 25 °C w ciemnej, wilgotnej komorze przez ~24 godziny. Spryskać rośliny kontrolne 0,025% (v/v) roztworem Tween-20.
   12. Przenieść liście do innej wilgotnej komory pod wpływem światła fluorescencyjnego w temperaturze 25 °C przez 12 godzin fotoperiodu.
   13. Objawy choroby należy zapisać po 5 dniach od inokulacji. Zbadaj chore źdźbła ryżu/jęczmienia o długości ~6 cm. Standard oceny jest zgodny z systemem punktacji za odporność na wybuchy Międzynarodowego Instytutu Badań nad Ryżem (IRRI). Szczegółowe informacje na temat systemu punktacji w zakresie odporności na wybuch przedstawiono w tabeli 1.
   14. Sfotografuj liście, aby ocenić infekcję badanych szczepów. Zakażenie oceniano na podstawie liczby zmian na 3,6^cm2.

2. Ranienie Inokulacja kostkami grzybni lub kropelkami konidialnej zawiesiny M. grisea

1. Za pomocą anatomicznej igły zeskrob trzy rany o długości 2-3 cm w głównych żyłach oderwanych liści ryżu/jęczmienia; uważając, aby nie przebić liści.
2. Połóż zeskrobane liście na wykałaczkach i spryskaj liście 0,02% (v/v) roztworem Tween-20 na liście, aby utworzyć warstwę kropelek.
3. Wytnij korek grzybni o wymiarach 0,5 cm x 0,5 cm dla każdego szczepu M. grisea (szczepy typu dzikiego, zmutowanego, dopełniacza lub innych szczepów testowych) z płytki OTA.
4. Umieścić korki grzybniowe lub 25 μl kropelek zawiesiny konidialnej na zranionych liściach i inkubować liście w temperaturze 25 °C w wilgotnej komorze przez 3 - 8 dni.
5. Zbadaj zmiany w 5 - 7 dniu po inokulacji. Metoda badania jest taka sama, jak w przypadku metody inokulacji w aerozolu (patrz krok 1.3.13).
6. Zbadaj chore źdźbła ryżu/jęczmienia o długości ~6 cm i sfotografuj je, aby ocenić infekcję badanych szczepów. Zakażenie oceniano na podstawie liczby zmian na 3,6^cm2.

Wyniki

Cały schemat postępowania dla tej techniki przedstawiono na Rysunku 1. Testy infekcji roślin przeprowadzono na 14-dniowych podatnych siewkach ryżu (O. sativa cv CO-39) lub podatnych 7-dniowych liściach jęczmienia (H. vulgare cv Golden Promise)^7,8,9. Aby przetestować infekcję liści ryżu, przygotowano zawiesinę konidiów (1,0 x 10⁵ zarodnikó...

Dyskusja

Geny odporności roślin na choroby odgrywają zasadniczą rolę w zapobieganiu zakażeniom patogenami, w tym patogenami grzybiczymi ^1,12. Podmuch ryżu został wykorzystany jako model do zrozumienia natury struktur populacji patogenów i identyfikacji genów odporności roślin⁴. Dlatego konieczne jest zbadanie na dużą skalę genotypu odporności na choroby i genotypów wirulencji głównych odmian roślin rolniczych w celu zidentyfikowania roślin odpornyc...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bibuła filtracyjna	marki GE Healthcare (Szwecja)
Probówka 50 ml	CORNING(Amercia)	430290
Wirówka	Eppendorf(Amercia)	5804R
Naczynie hodowlane	Thermofisher(Amercia)	150326
Pipeta 0,5-5 mL	Eppendorf
Pipeta 100-1000uL	Eppendorf	4920000083
Pompa próżniowa	Leybold	D25B
Igła preparcyjna	FST	26000-35
Inkubator	MEMMERT	PYX313
Pierścień do zaszczepiania	Greiner Bio One	731175

103113874920000105