Artykuł metodologiczny

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

9.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57685

⸱

7 czerwca 2018

 ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Baylor College of Medicine, 2Interdepartmental Graduate Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Streszczenie

Mikrośrodowisko immunologiczne guza (TIME) zostało ostatnio uznane za krytyczny mediator odpowiedzi na leczenie guzów litych, szczególnie w immunoterapiach. Ostatnie postępy kliniczne w immunoterapii podkreślają potrzebę powtarzalnych metod w celu dokładnego i dokładnego scharakteryzowania guza i związanego z nim nacieku immunologicznego. Trawienie enzymatyczne guza i analiza cytometrii przepływowej pozwalają na szeroką charakterystykę wielu podzbiorów i fenotypów komórek odpornościowych; Jednak głębokość analizy jest często ograniczona przez ograniczenia fluoroforowe dotyczące projektowania paneli i konieczność pobierania dużych próbek guzów w celu obserwacji rzadkich populacji immunologicznych będących przedmiotem zainteresowania. W ten sposób opracowaliśmy skuteczną i wysokoprzepustową metodę oddzielania i wzbogacania nacieku immunologicznego guza od nieimmunologicznych składników nowotworu. Opisana technika trawienia guza i separacji opartej na gęstości odśrodkowej pozwala na oddzielną charakterystykę guza i frakcji nacieku immunologicznego guza oraz zachowuje żywotność komórek, a tym samym zapewnia szeroką charakterystykę stanu immunologicznego guza. Metoda ta została wykorzystana do scharakteryzowania rozległej przestrzennej heterogeniczności immunologicznej w guzach litych, co dodatkowo wskazuje na potrzebę spójnych technik profilowania immunologicznego całego guza. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta zapewnia skuteczną i elastyczną technikę immunologicznej charakterystyki podskórnych litych guzów mysich; W związku z tym narzędzie to może być wykorzystane do lepszego scharakteryzowania cech immunologicznych guza oraz do przedklinicznej oceny nowych strategii immunoterapeutycznych.

Wprowadzenie

Tłumiący CZAS został niedawno uznany za cechę charakterystyczną raka i jest znany z tego, że odgrywa znaczącą rolę w rozwoju, progresji i ochronie nowotworów litych, a także łagodzi ich podatność na immunoterapię1. TIME składa się z licznych podzbiorów komórkowych i fenotypów, z których wszystkie zapewniają krytyczny wgląd w stan immunologiczny guza. Te podzbiory immunologiczne mogą być dalej stratyfikowane na komórki pochodzenia limfocytowego lub szpikowego, które razem stanowią większość wrodzonych i nabytych odpowiedzi immunologicznych2,3. Ostatnie postępy w dziedzinie immunoterapii nowotworów wykazały, że strategie immunoterapeutyczne (tj. inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych, limfocyty T chimerycznego receptora antygenowego itp.) mogą potencjalnie wywołać trwałe regresje raka; Pozostają one jednak stosunkowo nieskuteczne w przypadku nowotworów litych4,5. Wiele grup wykazało krytyczną przeszkodę, jaką TIME może odegrać dla powodzenia leczenia6,7, a zatem pozostaje potrzeba dokładnej oceny nowych immunoterapii w warunkach przedklinicznych, w szczególności koncentrując się na ich zdolności do modulowania lub przezwyciężania TIME8.

Obecne wysiłki mające na celu scharakteryzowanie CZASU zazwyczaj wykorzystują mikroskopię lub cytometrię przepływową wraz ze strategiami znakowania przeciwciał w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych i ich cech9,10. Te dwie strategie dostarczają wyjątkowo różnych informacji, ponieważ mikroskopia umożliwia przestrzenną ocenę podzbiorów komórkowych, a cytometria przepływowa zapewnia wysoką przepustowość i szerszą kwantyfikację zmian komórkowych. Pomimo ostatnich ulepszeń w immunohistochemii fluorescencyjnej multipleksów, optymalizujących systemy obrazowania spektralnego, które obecnie mogą obsługiwać do 7 parametrów, ograniczony rozmiar panelu utrudnia profilowanie immunologiczne na szerokim poziomie, a zatem technika ta jest często zarezerwowana dla bardziej ukierunkowanych analiz. W rezultacie cytometria przepływowa pozostaje jedną z najczęściej stosowanych technik profilowania immunologicznego. Pomimo jego powszechnego zastosowania w charakterystyce TIME, metody stosowane do przetwarzania i barwienia są dość zmienne. Najczęściej protokoły wykorzystują enzym dysocjujący guz (tj. kolagenazy, DNazę itp.) i ręczne metody dysocjacji w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, a następnie barwienie i analizę przeciwciał7. Pomimo korzyści płynących z każdej metody, liczne grupy wykazały dużą zmienność, którą można wywołać za pomocą tych technik11. To sprawia, że porównania między badaniami profilowania mikrośrodowiska guza są niezwykle trudne, nawet w przypadku oceny tego samego mysiego modelu guza. Co więcej, metody te dają ograniczony potencjał do niezależnej oceny składników nacieku komórkowego guza i układu immunologicznego guza, ponieważ oba składniki są przeplatane po trawieniu. Ilość próbki ogranicza następnie barwienie i analizę wielopanelową, co staje się głównym problemem przy próbie scharakteryzowania rzadkich podzbiorów immunologicznych (tj. limfocytów T specyficznych dla nowotworu)12. Nowsze techniki, takie jak cytometria masowa lub cytometria według czasu przelotu (CyTOF), umożliwiają wielowymiarową analizę fenotypową podzbiorów komórkowych, przy czym niektóre systemy obsługują projekty paneli o więcej niż 42 niezależnych parametrach13. Pomimo ogromnej mocy technologii CyTOF w profilowaniu immunologicznym, pozostaje ona ograniczona ze względu na koszty, wiedzę analityczną i dostęp do sprzętu. Ponadto wiele protokołów CyTOF zaleca oczyszczanie podzbiorów immunologicznych w celu poprawy stosunku sygnału do szumu14, a zatem sugerujemy, że nasza metoda wzbogacania może być stosowana przed analizą CyTOF w celu poprawy jakości danych.

Tutaj opisujemy metodę trawienia i analizy mikrośrodowiska guza, która obejmuje separację nacieków immunologicznych guza. Celem tej metody jest umożliwienie niezależnego, wysokoprzepustowego profilowania nacieku immunologicznego guza i frakcji komórkowych guza w celu szerszej charakterystyki mikrośrodowiska guza. Korzystając z tej metody, dodatkowo pokazujemy znaczenie przeprowadzenia analizy całego guza, ponieważ stwierdzono, że podskórny model guza litego ma znaczną przestrzenną heterogeniczność immunologiczną. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może dokładniej i bardziej spójnie porównywać próbki, ponieważ wzbogaca o podzbiory komórek odpornościowych w guzie i pozwala na niezależne profilowanie komórek nowotworowych i frakcji immunologicznych guza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Baylor College of Medicine.

1. Zbieranie i trawienie nowotworów

UWAGA: Czas potrzebny na zbiór to ~3 - 5 min/guz, a czas potrzebny na przetwarzanie to ~1 h + 2 - 3 min/guz.

  1. Poddaj myszy eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla i spryskaj każdą mysz 70% etanolem przed zbiorem, aby zapobiec zanieczyszczeniu włosów. Chirurgicznie usuń guzy podskórne od myszy i upewnij się, że guzy są wolne od jakiejkolwiek zanieczyszczającej tkanki (tj. włosów, skóry, otrzewnej itp.). Umieść każdy guz w 1,8 ml podłoża bazowego RPMI-1640 bez płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na 24-dołkowej płytce. W przypadku większych zbiorów utrzymuj talerze w chłodnym miejscu na lodzie, aby zachować żywotność komórek.
    UWAGA: Jeśli wymagana jest sterylność, wszystkie wycięcia guza będą musiały zostać wykonane w komorze bezpieczeństwa biologicznego ze sterylnymi narzędziami chirurgicznymi (tj. nożyczkami, kleszczami itp.), a także wszelkie dalsze kroki. Guzy o najdłuższej średnicy między 0,5 - 1 cm są optymalne, a większe lub mniejsze guzy będą wymagały skalowania odczynników.
  2. Użyj nożyczek, aby pociąć guzy na mniej niż 1 mm3 kawałki w każdym dołku.
  3. Przygotuj 10-krotny koktajl trawienny, rozpuszczając kolagenazę I w stężeniu 10 mg/ml, kolagenazę IV w stężeniu 2,500 U/ml i DNazę I w stężeniu 200 U/ml w pożywce zasadowej RPMI-1640 (bez FBS).
    UWAGA: Koktajl na trawienie można przygotować dzień wcześniej i przechowywać w temperaturze -20 °C; Nie zaleca się jednak długotrwałego przechowywania, ponieważ enzymy po rozpuszczeniu z czasem tracą aktywność.
  4. Dodaj 200 μl 10x koktajlu dysocjacyjnego zawierającego kolagenazę I, kolagenazę IV i DNazę I do każdej studzienki z 1 mm3 kawałkami.
  5. Pozostawić próbki do trawienia przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, lekko wstrząsając przy 60–100 obr./min za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
    UWAGA: Podniesienie temperatury do 37 °C podczas trawienia enzymatycznego może spowodować aktywację komórek odpornościowych.
  6. Po 1 godzinie zneutralizować reakcję, dodając do każdej studzienki 1 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 5% FBS i 2 mM EDTA.
  7. Pipetować trawienie guza i pozostałe kawałki guza do sitka do komórek o wielkości 40 μm umieszczonego na górze probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby ułatwić przenoszenie trawienia guza do sitka.
  8. Użyj tłoka strzykawki o pojemności 10 ml, aby mechanicznie zdezagregować kawałki guza przez sitko. Okresowo płukać sitko 2 ml uzupełnionej pożywki RPMI-1640 (zawierającej 5% FBS) i powtarzać, aż sitko komórkowe będzie wolne od guza.
    UWAGA: Około 4 - 10 ml całkowitej pożywki powinno wystarczyć do odpowiedniego przepłukania sitka guza.
    UWAGA: Umieść próbki na lodzie do momentu zakończenia tego etapu dla wszystkich próbek, aby zachować żywotność komórek.
  9. Ustaw każdą probówkę wirówkową o pojemności 50 ml do tej samej objętości za pomocą uzupełnionej pożywki RPMI-1640.
    UWAGA: Regulacja objętości ma kluczowe znaczenie dla równoważenia wirówki. Pominięcie tego kroku może spowodować uszkodzenie wirówki lub obrażenia ciała.
  10. Zawiesiny komórek odwirować (5 min, 805 x g, 4 °C), odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić w 2 ml uzupełnionej pożywki RPMI-1640.
    UWAGA: W wyniku wirowania może powstać agregat komórek, który jest trudny do ponownego zawieszenia. Użyj pipety serologicznej o pojemności 5 ml i szybko wymieszaj, aby ją rozdrobnić przed kontynuowaniem.

2. Rozdział frakcji immunologicznej i nowotworowej

UWAGA: Czas potrzebny na ten krok to około 1 godziny.

  1. Dodać 3 ml pożywki o gradiencie gęstości na dno probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przygotuj i oznacz wystarczającą ilość probówek dla każdego guza.
  2. Ułóż 2 ml zawiesiny komórek nowotworowych na pożywce o gradiencie gęstości, pipetując powoli bok probówki, aby zapobiec mieszaniu się dwóch warstw.
  3. Ostrożnie umieścić warstwowe probówki w wirówce i wirować przez 20 minut w temperaturze 805 x g, 20 °C, bez hamulca.
    UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby sprawdzić prawidłowe wyważenie i upewnić się, że podczas wirowania nie jest używany hamulec. Jakiekolwiek zakłócenie tego procesu spowoduje wymieszanie warstw, a pełne odzyskanie próbki będzie trudne.
  4. Ostrożnie przenieś warstwę leukocytów naciekających guz (TIL) i górną warstwę pożywki do nowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety transferowej. Wyrzuć całą pozostałą pożywkę o gradiencie gęstości i ponownie zawieś osad guza na dnie probówki w 2 ml uzupełnionego RPMI-1640.
    UWAGA: Po odwirowaniu będą widoczne cztery warstwy od góry do dołu, które odpowiednio odpowiadają: pożywce, TIL, pożywce o gradiencie gęstości i osadowi komórek nowotworowych. Zobacz Rysunek 2A dla przykładu różnych warstw.
  5. Odwirować zarówno TIL, jak i próbki guza w oddzielnych probówkach (5 min, 805 x g, 4 °C) i odrzucić supernatant.
  6. Ponownie zawiesić próbkę TIL w 200 μl, a osad nowotworowy w 2 ml uzupełnionej pożywki RPMI-1640. Przechowywać na lodzie, aby zachować żywotność.

3. Poszycie i barwienie

Uwaga: Czas potrzebny na posiew to 30 s/guz; czas potrzebny na barwienie powierzchni to 1 h; czas potrzebny na barwienie wewnątrzkomórkowe to 40 minut; czas potrzebny na analizę cytometrii przepływowej to 1 - 4 min/guz.

  1. Przygotuj i oznacz 96-dołkową płytkę dolną w kształcie litery U dla każdego panelu barwienia immunologicznego oraz dodatkową płytkę do liczenia komórek.
    UWAGA: Zazwyczaj przygotowuje się w sumie trzy płytki: płytkę panelową skoncentrowaną na limfocytach, płytkę panelową skoncentrowaną na szpiku i płytkę do zliczania komórek.
  2. Zawiesiny jednokomórkowe należy rozdzielić na każdą z płytek panelu barwiącego, a określoną objętość na płytkę policzniową.
    UWAGA: Płytka zliczająca służy do obliczania całkowitej liczby komórek dodanych do każdego panelu barwienia, umożliwiając w ten sposób dokładne zliczanie populacji komórek. Cytometr przepływowy z możliwością pobierania próbek na płytkach 96-dołkowych i analizy objętościowej może podać liczbę komórek na μl w każdej próbce, a tym samym obliczyć liczbę komórek dodanych do każdego panelu barwienia. Płytki zliczające można pobrać następnego dnia po utrwaleniu przez noc w temperaturze 4 °C, przepłukaniu buforem FAC (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 2% FBS) i ponownym umieszczeniu w ustalonej objętości buforu FAC.
  3. Przepłukać komórki dwukrotnie 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco na próbkę, odwirowując (5 min, 805 x g, 4 °C) i odrzucając supernatant między każdym płukaniem w celu usunięcia wolnego FBS.
  4. Dodać 50 μl bloku Fc, wymieszać próbki za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Dodać 50 μl 2x skoncentrowanego zewnątrzkomórkowego przeciwciała ukierunkowanego i możliwej do utrwalenia mieszaniny barwienia żywotności, wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
    UWAGA: Dokładne warunki barwienia przeciwciała zależą od instrukcji producenta. Wszystkie rozcieńczenia barwienia muszą być w DPBS, bez dodatku FBS, aby zapobiec nasyceniu możliwego do utrwalenia barwnika żywotności. Prosimy o zapoznanie się z Tabelą materiałów/sprzętu w celu uzyskania informacji na temat optymalnych rozcieńczeń panelu barwiącego użytego w tym manuskrypcie. Przeciwciało i dający się utrwalić roztwór barwiący o żywotności przygotowuje się w stężeniu 2x, aby zapewnić końcowe stężenie barwiące 1x w 100 μl całkowitej objętości barwienia po dodaniu do bloku Fc.
  6. Przepłukać próbki dwukrotnie buforem FAC przez odwirowanie (5 min, 805 x g, 4 °C) i odrzucenie supernatantów między każdym płukaniem.
  7. Zawiesić ponownie w 200 μl 1x roztworu utrwalającego/przepuszczalnego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
    UWAGA: W tym momencie eksperyment można przerwać na noc: próbki należy chronić przed światłem w temperaturze 4 °C.
  8. Następnego dnia odwirować płytki (5 min, 805 x g, 4 °C) i odrzucić supernatant.
  9. Przepłukać raz 200 μl 1x buforu permeabilizacyjnego, odwirować (5 min, 805 x g, 4 °C) i odrzucić supernatant.
  10. Dodać 100 μL 1x skoncentrowany wewnątrzkomórkowy panel do barwienia przeciwciał przygotowany w 1x buforze permeabilizacyjnym i inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze RT lub 4 °C (zależy to od zaleceń producenta dotyczących barwienia).
  11. Przepłukać raz 1x buforem permeabilizacyjnym (5 min, 805 x g, 4 °C), wyrzucić supernatant i przepłukać po raz drugi buforem FAC (PBS z 2% FBS).
  12. Zawiesić próbki w 300 μl buforu FAC (PBS z 2% FBS), przenieść próbki do probówek do cytometrii przepływowej i przeprowadzić analizę cytometrii przepływowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasze wyniki wykazują istotną korzyść z oddzielenia TIL od nieimmunologicznych składników guza, zgodnie z opisem w protokole. Ponadto, stosując opisaną metodę, wykazaliśmy znaczną heterogenność immunologiczną ugruntowanych guzów litych.

Istotnym problemem wielu technik dysocjacji guzów jest utrata żywotności próbek, najczęściej w wyniku drastycznych warunków trawienia (np. podwyższonych temperatur, niewystarczającej pod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

TIME składa się z różnorodnych i złożonych składników komórkowych i molekuł. Najnowsze dowody sugerują, że dokładna charakterystyka tego środowiska może zapewnić lepsze zrozumienie sukcesu lub niepowodzenia leczenia, a nawet może pomóc w identyfikacji mechanizmów oporności terapeutycznej. Na przykład zwiększenie poziomu wewnątrz guza różnych komórek immunosupresyjnych (tj. MDSC, komórek regulatorowych T itp.) może złagodzić efektorową odpowiedź immunologiczną i znieść efekty immunoterapeutyczne. Z drugi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

JMN dziękuje za wsparcie finansowe od National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) oraz National Institute of Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) należących do National Institutes of Health. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Projekt ten był również wspierany przez Cytometry and Cell Sorting Core w Baylor College of Medicine dzięki finansowaniu z NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 i S10 RR024574) oraz pomocy eksperta Joela M. Sederstroma.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6 do 12 tygodniowy samiec myszy C57BL/6Jackson Laboratory Myszy N/Aużywane w naszych badaniach nowotworów
Linia komórkowa mysiego raka syngenicznego MEERPozyskana od współpracownika N/AE6/E7 Antygen HPV wyrażający linię komórkową mysiego nabłonka raka migdałków 
70% alkohol izopropylowy EMD Milipore PX1840
Zestaw narzędzi chirurgicznych MysiaWorld Precision InstrumentsMOUSEKITPrzede wszystkim potrzebne są tylko nożyczki, pęseta i skalpel.
Płytka 24-dołkowa Denville Scientific Inc.T1024Lub dowolna 24-dołkowa płaska płyta dolna.
RPMI-1640 MediaSigma-AldrichR0883
Kolagenaza I EMD Milipore234153
Kolagenaza IVWorthington Biochemical CorporationLS004189
DNaza I Sigma-Aldrich11284932001
Wolnoobrotowa wytrząsarka orbitalnaBioExpress (dostawca: Genemate) S-3200-LSLub dowolny wytrząsarka orbitalna. 
Inkubator termoregulacyjnyFisher Scientific13-255-27Lub dowolny inny inkubator termoregulowany
FBSSigma-AldrichF8192
EDTAAMRESCOE177
1 mL Pipeta i końcówkiEppendorf13-690-032Lub dowolna inna pipeta i końcówki
40 um Sitka do komórekFisher Scientific22363547
50 ml probówki wirówkoweDenville Scientific Inc.C1062-P
15 ml Probówki stożkoweDenville Scientific Inc.C1012
10 ml Strzykawka Luer-Lok bez igiełBD309604
Lymphoprep Density Gradient MediumPipety transferowe STEMCELL Technologies7811
Denville Scientific Inc.P7212
96-dołkowe płyty dolne w kształcie litery U,Denville Scientific Inc.
DPBSSigma Aldrich D8573
Zestaw barwiących czynnik transkrypcyjny FoxP3 ThermoFisher Scientific00-5523-00buforem i buforem permeabilizacji Fix/permeabilization
Eppendorf 5810 R
Attune NxT Cytometr przepływowyThermoFisher ScientificN/ADo 96-dołkowego zliczania objętościowego komórek 
Oczyszczony szczur Anti-Mouse CD16/CD32 (blok BD Fc myszy)  Klon 2.4G2 ThermoFisher Scientific553141Fc Block
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy niebieskich barwników martwych komórek, do wzbudzenia UVThermoFisher ScientificL34962Możliwe do naprawienia barwienie
Przeciwciało monoklonalne CD45 (30-F11), APC-eFluor 780ThermoFisher Scientific47-0451-80
Przeciwciało monoklonalne beta TCR (H57-597), APCThermoFisher Scientific17-5961-82
CD8-&alfa; Przeciwciało (KT15), PESanta Cruz Biotechnologysc-53473 
Przeciwciało monoklonalne CD4 (GK1.5), PE-cyjanina5ThermoFisher Scientific15-0041-81
MHC klasa II (I-A/I-E) Przeciwciało monoklonalne (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700ThermoFisher Scientific56-5321-82
CD11c Przeciwciało monoklonalne (N418), PE-cyjanina5ThermoFisher Scientific15-0114-82
F4/80 Przeciwciało monoklonalne (BM8), eFluor 450Przeciwciało monoklonalne ThermoFisher Scientific48-4801-80
CD11b (M1/70), APCThermoFisher Scientific17-0112-81
Przeciwciało monoklonalne Ly-6G (Gr-1) (RB6-8C5), PEThermoFisher Scientific12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Przeciwciało monoklonalne (MIH5), PE-cyjanina7ThermoFisher Scientific25-5982-80
Przeciwciało monoklonalne CD273 (B7-DC) (122), PerCP-eFluor 710ThermoFisher Scientific46-9972-82
Przeciwciało monoklonalne Ki-67 (B56), BV711BD Biosciences563755
Wirówka termoregulowana z żywotności

Bibliografia

  1. Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
  2. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  3. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  4. Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
  5. Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106(2016).
  6. Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
  7. Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
  8. Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
  9. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
  10. Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
  11. Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
  12. Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
  13. Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
  14. Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
  15. Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunologiczne mikro rodowisko nowotworuanaliza cytometrycznaenzymatyczne trawienie nowotworuseparacja w gradiencie g sto ciwzbogacanie kom rek odporno ciowychleukocyty naciekaj ce nowotw rkom rki CD45 dodatnieocena ywotno ci kom rekpanel immunofenotypowy

Powiązane artykuły