Tutaj opisujemy skalowalną metodę, wykorzystującą prostą kombinację Activiny A i nadekspresji Id1 za pośrednictwem lentiwirusa, do generowania pierwszych komórek progenitorowych serca podobnych do pola serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Generacja pierwszych sercopodobnych progenitorów serca i kardiomiocytów komorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Generowanie dużych ilości funkcjonalnych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, pochodzących z komórek progenitorowych serca i kardiomiocytów o określonym pochodzeniu z pola serca, jest warunkiem wstępnym dla terapii kardiologicznych opartych na komórkach i modelowania chorób. Niedawno wykazaliśmy, że geny Id są zarówno niezbędne, jak i wystarczające do określenia pierwszych komórek progenitorowych pola serca podczas rozwoju kręgowców. Ten protokół różnicowania wykorzystuje te odkrycia i wykorzystuje nadekspresję Id1 w połączeniu z aktywiną A jako silne sygnały określające do wytworzenia pierwszych progenitorów podobnych do pola serca (FHF-L). Co ważne, uzyskane w ten sposób komórki progenitorowe skutecznie różnicują się (~70–90%) w kardiomiocyty przypominające komory. Tutaj opisujemy szczegółową metodę 1) generowania hPSC z nadekspresją Id1 i 2) różnicowania skalowalnych ilości kriokonserwowalnych progenitorów FHF-L i kardiomiocytów podobnych do komór.
Wprowadzenie
Produkcja na dużą skalę ludzkich komórek macierzystych i kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) jest warunkiem wstępnym dla terapii opartych na komórkach macierzystych1, modelowanie choroby2,3 oraz szybka charakterystyka nowych szlaków regulujących różnicowanie serca4,5,6 oraz fizjologia7,8. Chociaż wiele badań9,10,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie i infekcja wirusa Id1
- Wygeneruj lentiwirusa z nadekspresją Id1 poprzez kotransfekcję pCMVDR8.74, pMD2.G i pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR (Addgene: plasmid #107735) do komórek HEK293T. Zebrać cząsteczki wirusa, przefiltrować, oczyścić z supernatantu i przechowywać w temperaturze -80 °C, jak w Kitamura i wsp. (2003)19. Alternatywnie, wyprodukuj lentiwirusa Id1 komercyjnie, wysyłając pCDH-EF1-Id1-PGK-PuroR do dostawcy produkującego lentiwirusa.
Uwaga: Należy przestrzegać przepisów bezpieczeństwa lentiwirusowego i standardowych protokołów operacyjnych.
Uwaga: WAŻNE: Optymalne miano wirusa powinno wynosić ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Generowanie linii hPSCId1s
hPSC są zakażane lentiwirusem pośredniczącym w nadekspresji Id1 (Rysunek 1A). Po wygenerowaniu hPSCId1 ekspresję transgenu określa się za pomocą qRT-PCR (Rysunek 1B). Do różnicowania należy wykorzystać wyłącznie linie hPSCId1 wykazujące poziom mRNA Id1 przekraczający 0,05-kr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Aby skutecznie różnicować, postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi powyżej. Ponadto w tym miejscu podkreślamy kluczowe parametry, które mają duży wpływ na wyniki różnicowania. Przed rozpoczęciem różnicowania należy obserwować następujące trzy parametry morfologiczne: morfologię łodygi hPSCId1, wysokie zagęszczenie komórek i wysoką konfluencję (>90%) kultury w dniu 0. W związku z tym optymalne warunki różnicowania najlepiej tworzy się poprzez posiewanie zdysocjowanychhPSCs Id1 jako pojedynczych komó.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy członkom laboratorium Colas za pomocne dyskusje i krytyczne recenzje manuskryptu. Badanie to było wspierane przez granty NIH/NIEHS R44ES023521-02 i CIRM DISC2-10110 dla dr Colasa.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało ACTC1 | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antybiotyk Przeciwgrzybiczy (Anty-Anty) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Suplement B27 | Suplement Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 w/o - insulina | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| Suplement witaminy B27 bez witaminy A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| przeciwciało CDH5 | R& D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Odczynnik do kriokonserwacji |
| DMEM o wysokiej zawartości glukozy | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS z Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| Zestaw potencjału membranowego FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | Aby uzyskać informacje na temat optycznego pozyskiwania potencjału czynnościowego, zapoznaj się z McKeithan i in. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Coating | |||
| reagent mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicylina-Streptomycyna | Gibco | ||
| Puromycyna | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Bezenzymatyczny odczynnik dysocjacyjny |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| Przeciwciało TAGLN | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | Inhibitor szlaku RHO/ROCK |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X odczynnik dysocjacyjny zawierający enzym |
| Pakiety mieszanek roztworów Tyrodes | Sigma | T2145-10X1L | (Aby uzyskać informacje na temat optycznego potencjału czynnościowego, patrz McKeithan i in. 2017) |
Bibliografia
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
