Method Article

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

DOI:

10.3791/57690

⸱

June 30th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1School of Biology, University of Osnabrück, 2Center of Cellular Nanoanalytics, Integrated Bioimaging Facility, University of Osnabrück, 3Department of Biology, WWU Münster

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiedza na temat lokalizacji białek w podkompartmentach komórkowych jest kluczowa dla zrozumienia ich specyficznej funkcji. W tym miejscu przedstawiamy technikę super-rozdzielczości, która pozwala na określenie mikrokompartmentów, które są dostępne dla białek, poprzez generowanie map lokalizacji i śledzenia tych białek. Co więcej, za pomocą wielokolorowej mikroskopii lokalizacyjnej uzyskuje się jednocześnie profile lokalizacji i śledzenia białek w różnych podprzedziałach. Technika ta jest specyficzna dla żywych komórek i opiera się na powtarzalnym obrazowaniu pojedynczych ruchomych białek błonowych. Interesujące nas białka są genetycznie łączone ze specyficznymi, tak zwanymi znacznikami samoznakującymi. Te znaczniki są enzymami, które reagują z substratem w sposób kowalencyjny. Sprzężone z tymi podłożami są barwniki fluorescencyjne. Reakcja białek znakowanych enzymatycznie z substratami znakowanymi fluorescencyjnie prowadzi do powstania znakowanych białek. W tym przypadku tetrametylorodamina (TMR) i rodamina krzemu (SiR) są stosowane jako barwniki fluorescencyjne przyłączone do substratów enzymów. Wykorzystując stężenia substratów w zakresie od pM do nM, uzyskuje się znakowanie substechiometryczne, które daje wyraźne sygnały. Sygnały te są zlokalizowane z precyzją ~15–27 nm. Technika ta pozwala na wielokolorowe obrazowanie pojedynczych cząsteczek, przy czym liczba kolorów jest ograniczona dostępnymi barwnikami przepuszczalnymi dla błony oraz repertuarem enzymów samoznakujących. Pokazujemy wykonalność techniki, określając lokalizację kinazy 1 indukowanej enzymem kontroli jakości (Pten) (PINK1) w różnych przedziałach mitochondrialnych podczas jej przetwarzania w stosunku do innych białek błonowych. Test na prawdziwe fizyczne interakcje między różnie znakowanymi pojedynczymi białkami za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET lub co-tracking jest jednak ograniczony, ponieważ niskie stopnie znakowania zmniejszają prawdopodobieństwo znakowania dwóch sąsiednich białek w tym samym czasie. Chociaż technika ta jest skuteczna w obrazowaniu białek w przedziałach błonowych, w większości przypadków nie jest właściwe określanie lokalizacji wysoce ruchomych rozpuszczalnych białek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest dostarczenie metody obrazowania do lokalizacji i śledzenia pojedynczych białek błonowych wewnątrz żywych komórek. Nazywamy tę metodę Mikroskopią Śledzenia i Lokalizacji (TALM)1,2. Podobnie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)3 i mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji ((F)PALM)4,5, TALM jest techniką lokalizacji fluorescencji opartą na pojedynczej cząsteczce. Różni się jednak tym, że ruchliwość białek błonowych w połączeniu z powtarzającym się obrazowaniem tej samej znakowanej cząsteczki w różnych pozycjach ujawnia mikroprzedział, który jest dostępny dla białka ruchomego. Innymi słowy, możliwe lokalizacje białka są ustalane przez architekturę organelli i ruchliwość białka1. Metoda ta jest komplementarna z różnymi innymi technikami superrozdzielczości6,7,8, ponieważ ujawnia mapy lokalizacji i trajektorii poprzez obrazowanie białek ruchomych. Znakowanie opiera się na użyciu genetycznie modyfikowanych białek fuzyjnych, które same w sobie nie są fluorescencyjne. Te białka fuzyjne są samoznakującymi się enzymami, które reagują kowalencyjnie z substratem sprzężonym z barwnikiem. Ta procedura ma tę zaletę, że stopień etykietowania może być kontrolowany przez ilość dodanego substratu. Ponadto pozwala na zmianę barwy fluorescencji, w zależności od wybranego barwnika sprzężonego. Dostępnych jest kilka samoetykietujących się znaczników enzymatycznych9. Kolejną zaletą stosowania samoznakujących się znaczników enzymatycznych jest to, że sprzężone barwniki są zwykle bardziej stabilne i jaśniejsze niż białka fluorescencyjne1, a zatem poszczególne białka mogą być rejestrowane dłużej i dokładniej, dopóki nie zostaną wybielone. Pozwala to na rejestrację trajektorii ruchomych białek i ekstrakcję współczynników dyfuzji10,11.

Tutaj pokazujemy wykonalność TALM z mitochondrialnymi białkami błonowymi, ale może być również stosowany do innych białek błony wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej, w tym różnych typów komórek12,13. Pokazujemy, że wielokolorowy TALM pozwala na jednoczesne rozróżnianie białek w różnych podprzedziałach w uzupełnieniu do istniejących technik mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości14,15,16. TALM jest kompatybilny z obrazowaniem żywych komórek17. Fotofizyka wybranych rodamin Tetramethylrhodamine (TMR) i Silicon-Rhodamien (SiR), a w szczególności ich jasność i stabilność, pozwala na rejestrację pojedynczych białek błonowych w wielu ramkach, zapewniając mapy lokalizacji (i trajektorii). Jednak TALM jest ograniczony do lokalizacji rozpuszczalnych białek o wysokich współczynnikach dyfuzji, ponieważ rozmycie ruchu jest zbyt wysokie, a zebrane fotony na klatkę są zbyt niskie, aby zapewnić prawidłową lokalizację. Poza tym TALM wymaga mniejszej mocy wzbudzenia niż na przykład mikroskopia STORM lub STED (Stimulated Emission Depletion)6,7, co zmniejsza efekty fototoksyczne. Jest to ważne, ponieważ stres fototoksyczny często wpływa na morfologię organellarów18, a tym samym na analizę mobilności19. Podsumowując, przedstawiamy wielobarwny TALM w żywych komórkach jako technikę, która wypełnia lukę między metodami mikroskopii lokalizacyjnej STORM/STED/(F)PALM a technikami analizującymi ruchliwość białek, takimi jak odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)20,21, spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS)22, oraz spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS)11,23.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi lokalnej komisji etyki badań.

1. Metody

  1. Hodowla komórkowa
    1. Hodować komórki, na przykład komórki HeLa (ludzki rak szyjki macicy), w kolbie do hodowli komórek T25 zawierającej 5 ml pożywki wzrostowej w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: W celu obrazowania podziel komórki na przygotowane szkiełka nakrywkowe (patrz kroki 1.3 i 1.4) i przechowuj w podłożu do obrazowania.
  2. Transfekcja komórkowa
    UWAGA: Używaj linii komórkowych, które stabilnie wyrażają oznaczone białka, gdy tylko jest to możliwe24, aby uniknąć silnej nadekspresji. W przypadku transfekcji przejściowej należy dostosować ilość plazmidowego DNA użytego do transfekcji. Na przykład, gdy stosuje się transfekcję fosforanuCa2+25, transfekcyjne komórki (80–90% konfluencji) w 3,5-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowej z 2,5–5 μg plazmidowego DNA. Podczas wykonywania podwójnej transfekcji należy użyć 2,5 μg na każdy konstrukt plazmidowy.
    1. Do eksperymentów z dwoma kolorami należy użyć linii komórkowej ze stabilną ekspresją jednego białka samoznakującego się i przejściowo transfekować plazmidem kodującym drugie białko samoznakujące17.
      UWAGA: Tutaj, do eksperymentów z dwoma kolorami, użyto komórek HeLa, które stabilnie wyrażały samoznakujące się białka PINK1-Halo-Tag i Tom20-fSNAP-Tag.
  3. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe w zlewce. Dodać 30 mlH2Odo zlewki zawierającej szkiełka nakrywkowe i delikatnie wstrząsnąć, aby usunąć pył z ich powierzchni.
    2. Zbierz szkiełka nakrywkowe pęsetą i osusz je strumieniem azotu.
    3. Usunąć wszelkie zanieczyszczenia organiczne z powierzchni szkiełek nakrywkowych, np. poprzez czyszczenie plazmowe.
      UWAGA: Aby uniknąć dalszego zanieczyszczenia materiału szklanego, podczas obchodzenia się z szkiełkami nakrywkowymi należy nosić rękawice.
      UWAGA: Gdy szkiełka nakrywkowe są czyszczone metodą czyszczenia plazmowego, czyszczona jest tylko górna strona szkiełek nakrywkowych; użyć tej strony do powlekania glikolem poli-L-lizynowo-polietylenowym-argininą-glicyną-asparaginianem (PLL-PEG-RGD) (sekcja 1.4) i wysiewu komórek (sekcja 1.5).
  4. Powłoka szkiełka nakrywkowego z PLL-PEG-RGD
    UWAGA: PLL-PEG-RGD jest pochodną poli-L-lizyny (PLL) przyłączoną glikolem polietylenowym (3,000 Da) i peptydem cysteina-glicyna-arginina-glicyna-asparaginian-seryna (CGRGDS). PLL wiąże się z ujemnie naładowaną powierzchnią szkła i tworzy szczotkę PEG. To drastycznie zmniejsza niespecyficzne wiązanie naładowanych barwników fluorescencyjnych. Ponadto motyw RGD naśladuje peptyd sygnałowy receptora integryny, a tym samym sprzyja przyleganiu komórek za pośrednictwem integryny, które w przeciwnym razie nie przylegają łatwo.
    1. Przygotuj PLL-PEG-RGD zgodnie z wcześniejszym opisem26. Krótko mówiąc, rozpuść 0,8 mg PLL-PEG-RGD w 1 ml PBS. Dodać 10 μl roztworu PLL-PEG-RGD na górną część czystego szkiełka nakrywkowego.
    2. Weź drugie szkiełko nakrywkowe i umieść je czystą powierzchnią do góry nogami na pierwszym szkiełku nakrywkowym (z opadającym PLL-PEG-RGD na wierzchu); powoduje to umieszczenie roztworu PLL-PEG-RGD między dwoma szkiełkami nakrywkowymi.
    3. Ostrożnie umieścić ułożone szkiełka nakrywkowe w zlewce i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w suchym środowisku wolnym od kurzu.
    4. Po upływie 1 godziny dodać 30 mlH2Odo zlewki, aby całkowicie pokryć szkiełka nakrywkowe wodą.
    5. Delikatnie potrząsać zlewką, aż szkiełka nakrywkowe oderwą się od siebie.
    6. Za pomocą pęsety zbierz szkiełka nakrywkowe z wody i wysusz je pod strumieniem azotu.
      UWAGA: Powlekane szkiełka nakrywkowe można przechowywać na suchej, sterylnej szklanej szalce Petriego z pokrywką przez kilka dni.
  5. Przygotowanie próbki do obrazowania
    1. Przenieść pojedyncze powlekane szkiełka nakrywkowe do naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm, powierzchnią pokrytą PLL-PEG-RGD skierowaną do góry i dodać 2 ml pożywki do obrazowania na wierzch.
    2. Dodaj ~ 500 000 trypsynizowanych komórek (200–500 μl), które wyrażają samoznakujące się znaczniki na odpowiednich białkach błonowych, do pożywki obrazowej o pojemności 2 ml w naczyniu do hodowli komórkowej z powlekanym szkiełkiem nakrywkowym. Delikatnie wstrząśnij ręką, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie komórek w celu uzyskania jednolitej warstwy komórek.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 aż do osiągnięcia 80% zlewności.
      UWAGA: Próbki komórek należy wysiać 3 dni przed obrazowaniem i 1 dzień przed transfekcją. Komórki, które stabilnie wyrażają interesujące nas białko, można wysiać 2 dni przed obrazowaniem. Później obrazowane są tylko komórki wyhodowane na szkiełku nakrywkowym.
  6. Znakowanie oznakowanych białek
    UWAGA: Większość podłoży fluorescencyjnych musi być rozpuszczona w bezwodnym DMSO. Zalecamy stosowanie roztworów podstawowych podłoża fluorescencyjnego 1 μM, gdy końcowe stężenie na etykiecie wynosi 0,2–30 nM17. Do obrazowania białek błonowych wewnątrz komórek należy użyć przepuszczalnych dla błony substratów fluorescencyjnych.
    1. Rozgrzać podłoże do obrazowania do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
    2. Odpipetować 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża do obrazowania do probówki o pojemności 2 ml z pokrywką. Dodać 0,2–30 μl substratów fluorescencyjnych z roztworów podstawowych 1 μM, aby przygotować końcowy roztwór do znakowania (stężenie końcowe: 0,2–30 nM).
    3. Wiruj roztwór do etykietowania przez 10 sekund.
    4. Zastąpić pożywkę w naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm komórkami na szkiełku nakrywkowym (patrz krok 1.5) 1 ml przygotowanego roztworu do znakowania.
    5. Inkubować komórki w roztworze do znakowania w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 20–30 minut.
    6. Umyj komórki 2 ml PBS raz, a następnie dwukrotnie 2 ml pożywki obrazowej. Na koniec odpipetować 1 ml świeżej pożywki do obrazowania na szalkę z komórkami i umieścić próbkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 1 godzinę. Przed przystąpieniem do obrazowania należy jeszcze raz wymienić podłoże obrazowe.
      UWAGA: Przeprowadzając eksperyment po raz pierwszy, potwierdź prawidłowe kierowanie samodzielnie znakowanych białek na błony organellarów, barwiąc organelle dostępnymi na rynku barwnikami specyficznymi dla organelli27,28. W takim przypadku należy również użyć 100–200 nM substratu, aby enzymy samoznakujące się wytwarzały silne sygnały.
  7. Przygotowanie próbki kulki fluorescencyjnej
    UWAGA: W celu określenia dryfu optycznego i wyrównania obrazów różnych kanałów stosuje się wielokolorowe kulki fluorescencyjne (0,1 μm). Na podstawie zarejestrowanych obrazów zostanie wygenerowana matryca transformacji afinicznej dla dwóch kanałów emisyjnych.
    1. Rozcieńczyć roztwór kulek do 1% czystymH2O.
    2. Umieścić 5 kropli przygotowanego roztworu z kulkami fluorescencyjnymi w pięciu różnych miejscach na oczyszczonym szkiełku nakrywkowym (patrz krok 1.3).
    3. Pozostaw próbkę kulek fluorescencyjnych do wyschnięcia na czystej ławce.
      UWAGA: Próbka może być ponownie użyta; dlatego należy przykryć próbkę folią aluminiową, aby uniknąć zanieczyszczenia i utrzymywać ją w temperaturze 4 °C.

2. Mikroskopia

  1. Konfiguracja eksperymentalna
    UWAGA: Podstawowy system mikroskopowy do dwukolorowego obrazowania pojedynczych cząsteczek oparty jest na mikroskopie odwróconym: jest wyposażony w dwa lasery sprzężone za pomocą wielomodowej polaryzacji optycznej utrzymującej światłowód monomodowy w pojedynczym kondensatorze całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR), obiektyw zanurzeniowy z olejem przeznaczony do TIRF, polipasdowe filtry emisyjne, rozdzielacz obrazu i bardzo czułą kamerę (Rysunek 1). Potrzebny jest kondensator TIR, który pozwala na ciągłe dostrajanie kąta padania w celu przełączania między epi-, wysoce nachylonym i laminowanym arkuszem optycznym (wysoce nachylone cienkie oświetlenie (HILO)29) a trybem wzbudzenia TIRF ze zoptymalizowaną głębokością penetracji. Obrazy są pozyskiwane za pomocą bardzo czułego chłodzonego systemu detektorów, np. kamery EMCCD (EMCCD) z podświetlanym światłem wstecznym (quantum efficiency QE >90%) lub kamery sCMOS (QE >80–90%).
    1. Określ dryft optyczny, obrazując kulki fluorescencyjne (patrz krok 2.2) w tych samych warunkach, które zostaną później wykorzystane w eksperymencie, np. gdy w eksperymencie zarejestrowanych zostanie 10 000 klatek, zapisz również 10 000 ramek z próbką koralików. W celu wyznaczenia dryfu optycznego porównaj położenie koralików w pierwszej ramce i ostatniej uzyskanej ramce (Rysunek 1B). Jeśli to konieczne, później popraw serię obrazów pod kątem dryfu optycznego30 i/lub użyj stabilnych środowisk dryfu.
    2. Wyposaż kostkę filtracyjną w odpowiedni dichroiczny rozdzielacz wiązki, np. do fluorescencji pomarańczowej i czerwonej oraz odpowiednie filtry emisyjne do fluorescencji pomarańczowej i fluorescencji czerwonej. Wyposaż rozdzielacz obrazu w odpowiednie filtry. Sprawdź, czy nie ma możliwego wycieku sygnałów z jednego kanału do drugiego, nagrywając pojedyncze próbki kolorów w obu kanałach (Rysunek 1C).

figure-protocol-1
Rysunek 1: Układ optyczny dla wielokolorowej mikroskopii śledzenia i lokalizacji (TALM) z pomarańczowymi i czerwonymi emiterami. (A) Odwrócony mikroskop z co najmniej dwoma laserami wzbudzającymi, kondensatorem TIRF, obiektywem odpowiednim dla TIRF, rozdzielaczem obrazu i czułą kamerą. Wstawka: aby wzbudzić organelle wewnątrz komórek, kąt padającej wiązki musi być mniejszy niż kąt krytyczny dla TIRF, aby uzyskać wysoce nachylone i laminowane oświetlenie arkusza optycznego (HILO). DC1: Lustro dichroiczne 1; DC2: Lustro dichroiczne 2. EF: filtr emisji. (B) Test dryfu optycznego poprzez obrazowanie pozycji koralika fluorescencyjnego przez 10 000 klatek z taką samą liczbą klatek na sekundę, jak w następujących eksperymentach (tutaj: 15 Hz). Połączone pozycje pierwszych 500 klatek i ostatnich 500 klatek pokazują dryf. Ponadto scalony obraz z pozycją pierwszej i ostatniej klatki w kolorze czerwonym i niebieskim pokazuje minimalny dryf. Dryft to odległość między środkiem sygnałów podzielona przez całkowity czas nagrywania, tutaj 125 pm/s. (C) Sprawdź wyraźną separację sygnałów, tutaj TMR i SiR. Dla obu kanałów wygenerowano skumulowaną sumę obrazów z 3 000 klatek (TMR w Kanale 1 i SiR w Kanale 2). SiRHTL został przyłączony do Tom20-HaloTag, a TMRHTL do kompleksu OxPhos V-HaloTag. Kolory są fałszywymi kolorami. Podziałka = 100 nm (B) i 1 μm (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Fizyczne wyrównanie obrazów generowanych przez rozdzielacz obrazu
    UWAGA: Do montażu próbki przygotowanej na szkiełku nakrywkowym można użyć samodzielnie wykonanego uchwytu na próbkę (Rysunek 2A). Aby uniknąć przedostania się kurzu itp. do próbki, należy umieścić pokrywkę naczynia hodowlanego luźno na górze komory, gdy jest zamontowana. Ten sam uchwyt na próbkę może być użyty do zamocowania szkiełka nakrywkowego z fluorescencyjnymi kulkami lub ogniwami; podczas obrazowania komórek dodaj 0,5–0,8 ml pożywki do obrazowania. Rozdzielacz obrazu dzieli obraz na dwa lub więcej kanałów oddzielonych od siebie spektralnie i wyświetla je obok siebie w tej samej kamerze. Proces ten potencjalnie wprowadza systematyczne zniekształcenia między kanałami ze względu na przebyte odrębne ścieżki optyczne i utrudnia bezpośrednią analizę kolokalizacji. Dlatego najpierw wykonaj wyrównanie fizyczne, a następnie wyrównanie po korekcji za pomocą macierzy transformacji. W przypadku obu procesów wyrównywania koraliki fluorescencyjne powinny być równomiernie rozmieszczone w całym polu widzenia.
    1. Zamontuj przygotowaną próbkę z koralikami fluorescencyjnymi w uchwycie na próbkę między pierścieniem z politetrafluoroetylenu (PTFE) a czerwonym pierścieniem z gumy (Rysunek 2A).
    2. Uruchom mikroskop, wszystkie komponenty sprzętowe i całe oprogramowanie potrzebne do mikroskopii.
    3. Oczyść obiektyw i spód szkiełka nakrywkowego niestrzępiącą się chusteczką zwilżoną izopropanolem. Następnie osusz oba przedmioty świeżą, niestrzępiącą się chusteczką. Umieść kroplę olejku immersyjnego na źrenicy soczewki obiektywu.
    4. Umieść uchwyt na próbkę z próbką kulki na stoliku mikroskopu tak, aby spód szkiełka nakrywkowego stykał się z olejem. Skoncentruj się na koralikach za pomocą światła transmisyjnego lub linii laserowej.
    5. Dostosuj moc dwóch laserów wzbudzających, aby uzyskać podobną intensywność sygnału w dwóch kanałach fluorescencyjnych. Wyszukaj obszar z wieloma wyraźnymi sygnałami fluorescencyjnymi.
    6. Wygeneruj scalony widok kanałów fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania sterującego kamerą. Następnie użyj na rozdzielaczu obrazu, aby ręcznie przechylić wewnętrzne lustra rozdzielacza obrazu, aby uzyskać najlepsze nałożenie sygnałów z dwóch kanałów fluorescencyjnych (Rysunek 2B).
      UWAGA: Uwaga! Nie przekraczaj zakresu dynamicznego aparatu.
  2. Wyrównanie kanałów separowanych spektralnie za pomocą oprogramowania wykonującego transformację przestrzenną
    UWAGA: Poniższa część przedstawia procedurę wyrównania i lokalizacji po korekcie za pomocą naszej wtyczki programowej (dostępnej na żądanie).
    1. Uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem TIRF i wybierz wyświetlanie poszczególnych kanałów w trybie transmisji na żywo. Zrób migawkę obrazu wzbudzającego fluorescencję we wszystkich kanałach (Rysunek 2C).
    2. Użyj tego obrazu migawki, aby utworzyć macierz transformacji (patrz Rysunek 2).
      UWAGA: Macierz transformacji jest używana do transformacji przestrzennej, zazwyczaj afinicznej, która koryguje translację (rozbieżność sygnałów z jednego źródła punktowego między dwoma kanałami).
    3. Uruchom wtyczkę do analizy oprogramowania (można ją pobrać na żądanie z naszego laboratorium, patrz Rysunek 2C).
    4. Załaduj do oprogramowania wcześniej zarejestrowane dwukolorowe obrazy (patrz krok 2.2) koralików fluorescencyjnych. Wybierz używaną orientację kanałów fluorescencyjnych. Następnie kliknij "tak", gdy pojawi się prośba o "kalibrację obrazów" i wybierz poprzednio zrobioną migawkę.
    5. Otwórz "MENEDŻER JEDNOSTEK", aby zdefiniować współczynniki konwersji jednostek (rozmiar piksela, liczba klatek na sekundę, współczynnik konwersji fotonów).
    6. Otwórz "MENEDŻERA LOKALIZACJI". Najpierw określ funkcję rozrzutu punktowego (PSF). Naciśnij przycisk: "Promień PSF". W oknie "Estymator PSF", które zostanie otwarte, zdefiniuj aperturę numeryczną i maksimum emisji. Rozpocznij "Oszacuj promień PSF", klikając. Zaakceptuj otrzymaną eksperymentalną wartość PSF. Zdefiniuj pole oceny, liczbę pętli deflacji oraz liczbę rdzeni komputera używanych do obliczeń. Naciśnij "localize", aby rozpocząć dopasowywanie rozkładu intensywności pojedynczych cząstek za pomocą symetrycznej funkcji Gaussa 2D (Rysunek 2C).
    7. "Zaakceptuj" otrzymaną eksperymentalną PSF. Zdefiniuj pole oceny, liczbę pętli deflacji oraz liczbę rdzeni komputera używanych do obliczeń. Naciśnij "localize", aby rozpocząć dopasowywanie rozkładu intensywności pojedynczych cząstek za pomocą symetrycznej funkcji Gaussa 2D (Rysunek 2C).
    8. Otwórz "MENEDŻERA KALIBRACJI". Na renderowanym, scalonym obrazie dwóch kanałów pokazane są oryginalne sygnały i zlokalizowane środki. Wybierz tryb "afiniczny". Ręcznie połącz odpowiednie pary zlokalizowanych środków w dwóch kanałach, które pochodzą z tego samego koralika fluorescencyjnego, rysując linię łączącą.
    9. Podłącz odpowiednie sygnały rozprowadzone po całym polu widzenia. Następnie naciśnij "akceptuj". Zapisz kalibrację.
      UWAGA: Transformacja przestrzenna jest próbkowana na każdym koraliku fluorescencyjnym i interpolowana pomiędzy nimi. Wyekstrahowana funkcja transformacji reprezentuje pole przemieszczenia Δr(x,y), które jest używane do późniejszej korekty eksperymentalnych dwukolorowych lokalizacji pojedynczych cząsteczek, tak aby nakładały się one na siebie z precyzją lokalizacji. Macierz transformacji przestrzennej jest zazwyczaj afiniczną, która koryguje translację, skalowanie i rotację między kanałami z dokładnością nanometrową i można ją wywnioskować z tego ręcznego mapowania jeden do jednego (Rysunek 2C).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Przepływ pracy dla podwójnego wyrównania kolorów. (A) Szkiełko nakrywkowe z koralikami fluorescencyjnymi jest zamontowane w uchwycie na próbkę pomiędzy PTFE a gumowym pierścieniem. Następnie górna i dolna część komory są ze sobą skręcane. (B) Fizyczne wyrównanie widoków kanałów, które są generowane przez rozdzielacz obrazu. Zarejestrowane sygnały fluorescencyjne z kulek (0,1 μm) w dwóch kanałach (zielony i czerwony, fałszywe kolory) są łączone. Odpowiednie na optycznym rozdzielaczu obrazu są obracane ręcznie, aż do uzyskania najlepszego nakładania różnych sygnałów (kolor żółty, dolny panel). (C) Generowanie macierzy transformacji dla postprocesowego wyrównania kanałów. W celu precyzyjnej lokalizacji cząstki konieczne jest wyznaczenie funkcji rozproszenia punktów (PSF) w zależności od długości fali emisji i apertury numerycznej obiektywu. Środek PSF można określić na podstawie jego profilu intensywności analizowanego za pomocą symetrycznego dwuwymiarowego dopasowania Gaussa. Wynikająca z tego lokalizacja piku sygnału jest następnie rzutowana na oryginalne, rozmyte sygnały. Na scalonym obrazie zlokalizowane środki sygnałów z dwóch kanałów są połączone w celu wygenerowania macierzy transformacji, która jest później używana do postprocesywnego wyrównania danych eksperymentalnych. Podziałka = 1 μm (B, C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek białek błony mitochondrialnej
    UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Limfocyty T lub komórki nieprzylegające muszą być unieruchomione w agarozie przed obrazowaniem31.
    1. Zamontuj próbkę z przylegającymi komórkami na szkiełku nakrywkowym między gumą a pierścieniami z PTFE (Rysunek 3A). Napełnij komorę 0,5–0,8 ml pożywki obrazowej.
    2. Powtórz kroki 2.2.2–2.2.5.
    3. Dostosuj kąt oświetlenia Oprogramowanie sterujące mikroskopem TIRF, aby utworzyć kąt padania, który jest mniejszy niż kąt krytyczny dla trybu TIR w celu wzbudzenia określonego obszaru zainteresowania za pomocą arkusza HILO 32 (tryb HILO, Rysunek 1A).
      UWAGA: Unikaj bezpośredniego kontaktu wzrokowego z wiązką lasera!
    4. Ustaw wzmocnienie EM i wybierz czas ekspozycji odpowiedni dla eksperymentu, który zbiera wystarczającą ilość fotonów na klatkę.
    5. Ustaw moc lasera, aby osiągnąć wysoki stosunek sygnału do szumu (S/N) (Rysunek 3B), ponieważ precyzja lokalizacji bezpośrednio odpowiada S/N33 (Rysunek 3C).
    6. Znajdź obszar na obrzeżach komórki z nienakładającymi się, wydłużonymi mitochondriami i sygnałami pojedynczych cząsteczek (Rysunek 3D; Film uzupełniający 1). Jeśli nie są widoczne żadne sygnały pojedynczej cząsteczki, poczekaj, aż bielenie spowoduje pojawienie się sygnałów jednocząsteczkowych (Rysunek 3E).
    7. Nagrywaj do momentu, gdy liczba sygnałów będzie zbyt niska, aby można było kontynuować (zwykle 1 000–10 000 klatek, w zależności od zachowania barwnika fluorescencyjnego podczas wybielania, Rysunek 3F).
    8. Uruchom oprogramowanie do przetwarzania obrazowania i sprawdź struktury mitochondrialne, generując skumulowany renderowany obraz sumy co najmniej 1,000 zarejestrowanych klatek ( Rysunek 3G).
      UWAGA: Najszybsza możliwa liczba klatek na sekundę jest podyktowana obszarem odczytu. Pole widzenia dla jednego kanału jest zmniejszane przez dwukolorowy rozdzielacz obrazu (512 x 512 pikseli) do 256 x 512 pikseli, a dla czterokolorowego do 256 x 256 pikseli. Tak więc, aby użyć rozdzielacza obrazu dla dwóch kolorów, jest to 30 Hz. Ustaw tryb przesyłania klatek, aby uzyskać najniższy możliwy czas odczytu.
    9. Uruchom wtyczkę do analizy oprogramowania i załaduj surowe dane. Wybierz orientację kanału i załaduj obrazy. Użyj macierzy transformacji z kroku 2.3.9, gdy pojawi się prośba o "Kalibruj obrazy". Kanały będą wyświetlane osobno.
    10. Otwórz "UNIT MANAGER" jak poprzednio, aby zdefiniować współczynniki konwersji jednostek dla każdego kanału. Otwórz "MENEDŻERA LOKALIZACJI" dla każdego kanału. Następnie zdefiniuj pole oceny, liczbę pętli deflacji, dodaj teoretyczne PSF dla użytych warunków i ustaw, ile rdzeni komputera jest używanych do obliczeń. Na koniec naciśnij "localize", aby uzyskać zlokalizowane pojedyncze cząstki (Rysunek 3H; Dodatkowe wideo 2).
    11. Zauważ, że program w końcu wygeneruje skumulowany obraz w superrozdzielczości pokazujący wszystkie zlokalizowane cząstki (Rysunek 3I).
    12. Przeprowadzanie analiz, np. za pomocą oprogramowania open source lub naszego oprogramowania dostępnego na żądanie.
    13. Śledź pojedyncze cząsteczki w obu zlokalizowanych kanałach, np. za pomocą znacznika wielu celów10
      UWAGA: Krok 2.4.13 wymaga wstępnej (eksperymentalnej) wiedzy na temat dyfuzyjności badanych białek, aby prawidłowo ustawić warunki brzegowe. Zazwyczaj znalezienie właściwych warunków brzegowych jest procesem iteracyjnym.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Etapy podczas mikroskopii lokalizacji pojedynczej cząsteczki.(A) Szkiełko nakrywkowe z próbką umieszcza się między górną a dolną częścią (szarą) uchwytu na próbki domowej roboty (zaprojektowanego przez J. Bereiter-Hahna). Gumowy pierścień (czerwony) i pierścień z PTFE (biały) uszczelniają system od góry i od dołu szkiełka nakrywkowego, gdy części uchwytu próbki są ze sobą skręcone. B) Stosunek sygnału do szumu sygnału TMR. (C) Obliczony histogram precyzji lokalizacji dla wszystkich zlokalizowanych cząstek. (D) Wybór rozsądnego regionu do obrazowania, w tym przypadku obrzeża komórki z wyraźnie oddzielonymi mitochondriami. (E) Zapis i przetwarzanie obrazu: pokazana jest pojedyncza klatka z wyraźnymi sygnałami pojedynczej cząsteczki (tutaj zarejestrowano pojedyncze cząsteczki CV-HaloTag/TMRHTL). (F) Intensywność TMR w czasie nagrywania. (G) Obraz o łącznej sumie 3 000 klatek, nieprzetworzony. (H) Cząstki CV-HaloTag/TMRHTL zlokalizowane za pomocą funkcji Gaussa 2D z pojedynczej klatki. (I) Skumulowany, wyrenderowany obraz przedstawiający wszystkie zlokalizowane cząstki CV-HaloTag/TMRHTL z 3 000 klatek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie wielokolorowe i analiza kolokalizacji mogą pomóc w określeniu lokalizacji białek pod organellarami. Wykazaliśmy to wcześniej z fosfatazą cytozolową i homologiem tensyny, PINK1, który ma różne lokalizacje submitochondrialne ze względu na przetwarzanie przez proteazy mitochondrialne17. PINK1 jest ważnym czynnikiem gwarantującym funkcjonalność mitochondriów34,35. Aby określić lokalizację PINK1 w ró...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule zaprezentowano technikę dwukolorowej lokalizacji pojedynczych cząsteczek ruchomych białek błonowych. Zgodnie z protokołem, białka błonowe są łączone z samoznakującymi się białkami, które reagują z barwnikami rodaminy TMR i SiR sprzężonymi z odpowiednimi substratami. Barwniki rodaminowe są jasne i fotostabilne, a tym samym pozwalają na powtarzalne obrazowanie1. Aby zapewnić pomyślne wyniki, należy pamiętać o kilku warunkach i krytycznych tematach.

Po pierw...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować grupie Biofizyki i Jacobowi Piehlerowi z Uniwersytetu w Osnabrück za ciągłe wsparcie, Władysławowi Kohlowi za pomoc techniczną i przygotowanie materiału, a także zarządowi CellNanOs za dostarczenie mikroskopów do użytku. Projekt został sfinansowany przez SFB 944.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kwas (2-(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo)-etanosulfonowy, 1 M) (HEPES)Biochrom#1104E
DC1: Dichroidalny rozdzielacz wiązki Chroma640 dcxrNC506031
DC2: Lustro polichroiczne, rozdzielacz wiązkiChromazt405/488/561/640rpcwycofane
z produkcji Dulbecco´ s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x (bez Ca & Mg)Sigma-Aldrich & Co.
Earle´ s MEM bez czerwieni fenolowej, bez L-Glutaminy i bez NaHCO3 zawierającego 1% FBS, 0,1% HEPES, 0,1% NEAA, 0,1% Alanylo-L-Glutaminy i 34,78% wodorowęglanu sodu (NaHCO3 0,75 g / l)Podłoże obrazowe
Earle´ s minimum niezbędne podłoże (MEM) z czerwienią fenolową, zawierające 1% płodowej surowicy bydlęcej Superior (FBS), 0,1% HEPES (kwas 2-(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo)-etanosulfonowy, 1 M) i 0,1% aminokwasów endogennych (NEAA)Pożywka wzrostowa
EF: Czteropasmowy filtr emisyjnyAHF analysentechnikF72-866Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
Kamera EMCCDAndorAndor iXON 897
Filtr emisyjny QuadView kostki filtracyjne, pomarańczowyAHF analysentechnikF39-637pasmo przepustowe 582 - 619 nm
Filtr emisyjny Kostki filtracyjne QuadView, czerwonePasmo przepustowe Chroma655 - 725 nm (HQ 690/70)
FBS (Surowica bydlęca) superiorBiochromS0615
Koraliki fluorescencyjne: TetraSpeck™ Mikrosfery, 0,1 i mikro; m, fluorescencyjny niebieski/zielony/pomarańczowy/ciemnoczerwonyThermo Fisher ScientificT7279mikrosfery fluorescencyjne
GlutaminaBiochrom#0951C
Komórki HeLa DSMZACC-57Komórki raka szyjki macicy od pacjentki Henrietta Lacks
Hela cells CI::p aGFP, stabilnyMuster et al., PLOSOne 2010
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stabilnyAppelhans et al., NanoLett 2012
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stabilnyAppelhans et al., NanoLett 2012
Rozdzielacz obrazuFotometriaDual-View Emisja rozdzielacza obrazu
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu ImageJ2 / Fijifreeware
Olejek immersyjny - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)Carl Zeiss Jena GmbH444960-0000-000
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjnyOlympus IX-71/73/83
Laser 561 nm, 200 mWCrystaLaserCL-561-200emisja 561 nm
Laser 642 nm, 140 mWOmicronLuxx-642-140emisja 642 nm
MATLABMathWorkswersja R2013a
MEM z Earle's Balanced Salt Solution 2,2 g/L NaHCO3, stabilna glutamina bez PRBiochromFG-0385
MEM z Earle's Balanced Salt Solution z 2,2 g/L NaHCO3, stabilna glutamina, PhenolredBiochromFG-0325
MitoTracker® Deep Red FMThermo Fisher ScientificM22426barwnik
MitoTracker® Zielony barwnik FMThermo Fisher ScientificM7514
Wielomodowa polaryzacja optyczna utrzymująca światłowód jednomodowyPointsource/QioptiqKineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer Rapp Polymere GmbH Tü Szkiełko nakrywkowe
endogenne aminokwasy (NEAA)Biochrom#0802E
PEG 800 (Glikol polietylenowy) 10 %Carl Roth GmbHNr art 0263.1Powłoka szkiełka nakrywkowego
Penicylina/StreptomycynaBiochrom#0122E
Plazmid do ekspresji PINK1-Halo7-TagBeinlich i wsp., ACS Chemical Biology 2015
Poli-L-lizyna (1,2 mg/ml)Sigma-Aldrich & Co.kot. No.P9155powłoka szkiełka nakrywkowego
RGD Peptyd (Ac-CGRGDS-COOH)System rdzeniowy Diagnostix GmbH,powłoka szkiełka nakrywkowego Gernsheim
Rodamina krzemowa połączona z HaloTag®-Ligand (SiRHTL) osobisty prezent od Kaia Johnsonabarwnik,
wtyczka do analizy oprogramowania, napisana samodzielnie: C. P. Richter, Biophysik Osnabrü ckSLIMFAST 16g
Tetrametylorodamina / SNAP-Cell® TMR-Star połączony z SNAP-Ligand (TMRstar) Biolab Nowej Anglii ®Barwnik S9105S
Tetrametylorodamina związana z HaloTag®-Ligand (TMRHTL) Kondensator PromegaG8251barwnik
TIRFOlympusCell^TIRF MITICO SystemKondensator TIRF
Oprogramowanie sterujące mikroskopem TIRFOlympus cellSens 1.12
Obiektyw TIRFOlympus150x (ND 1,45; Olympus UAPO)
Trypsyna/EDTA 10xBiochrom#0266
Woda H2O 99,5 % Rotipuran® Niska zawartość organiczna Carl Roth GmbHArt. Nie. Zobacz materiał HN57.1
#RNBF8311QV2Bingen Powłoka / motyw receptora Intergrin, Obiektyw olejowy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
  2. Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  4. Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).
  5. Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).
  6. Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. , Available from: https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences (2016).
  7. Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).
  8. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79(2016).
  9. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740(2015).
  10. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5 (8), (2008).
  11. Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).
  12. Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).
  13. Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. , (2018).
  14. Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).
  15. Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).
  16. Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
  17. Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).
  18. Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  19. Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).
  20. Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).
  21. Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).
  22. Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).
  23. Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).
  24. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  25. Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52 (2), 456-467 (1973).
  26. Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).
  27. Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).
  28. Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).
  29. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5 (5), 455(2008).
  30. Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).
  31. Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601(2016).
  32. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  33. Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
  34. Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
  35. Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).
  36. Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).
  37. Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationMulti color MicroscopyLive Cell ImagingMitochondrial Membrane ProteinsPINK1 LocalizationTIRF MicroscopySelf labeling TagsFluorescent DyesSub stoichiometric LabelingOrganelle Tracking

Related Articles