Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57690

⸱

30 czerwca 2018

 ,  ,  ,  , 
1School of Biology, University of Osnabrück, 2Center of Cellular Nanoanalytics, Integrated Bioimaging Facility, University of Osnabrück, 3Department of Biology, WWU Münster

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Streszczenie

Wiedza na temat lokalizacji białek w podkompartmentach komórkowych jest kluczowa dla zrozumienia ich specyficznej funkcji. W tym miejscu przedstawiamy technikę super-rozdzielczości, która pozwala na określenie mikrokompartmentów, które są dostępne dla białek, poprzez generowanie map lokalizacji i śledzenia tych białek. Co więcej, za pomocą wielokolorowej mikroskopii lokalizacyjnej uzyskuje się jednocześnie profile lokalizacji i śledzenia białek w różnych podprzedziałach. Technika ta jest specyficzna dla żywych komórek i opiera się na powtarzalnym obrazowaniu pojedynczych ruchomych białek błonowych. Interesujące nas białka są genetycznie łączone ze specyficznymi, tak zwanymi znacznikami samoznakującymi. Te znaczniki są enzymami, które reagują z substratem w sposób kowalencyjny. Sprzężone z tymi podłożami są barwniki fluorescencyjne. Reakcja białek znakowanych enzymatycznie z substratami znakowanymi fluorescencyjnie prowadzi do powstania znakowanych białek. W tym przypadku tetrametylorodamina (TMR) i rodamina krzemu (SiR) są stosowane jako barwniki fluorescencyjne przyłączone do substratów enzymów. Wykorzystując stężenia substratów w zakresie od pM do nM, uzyskuje się znakowanie substechiometryczne, które daje wyraźne sygnały. Sygnały te są zlokalizowane z precyzją ~15–27 nm. Technika ta pozwala na wielokolorowe obrazowanie pojedynczych cząsteczek, przy czym liczba kolorów jest ograniczona dostępnymi barwnikami przepuszczalnymi dla błony oraz repertuarem enzymów samoznakujących. Pokazujemy wykonalność techniki, określając lokalizację kinazy 1 indukowanej enzymem kontroli jakości (Pten) (PINK1) w różnych przedziałach mitochondrialnych podczas jej przetwarzania w stosunku do innych białek błonowych. Test na prawdziwe fizyczne interakcje między różnie znakowanymi pojedynczymi białkami za pomocą pojedynczej cząsteczki FRET lub co-tracking jest jednak ograniczony, ponieważ niskie stopnie znakowania zmniejszają prawdopodobieństwo znakowania dwóch sąsiednich białek w tym samym czasie. Chociaż technika ta jest skuteczna w obrazowaniu białek w przedziałach błonowych, w większości przypadków nie jest właściwe określanie lokalizacji wysoce ruchomych rozpuszczalnych białek.

Wprowadzenie

Celem tego protokołu jest dostarczenie metody obrazowania do lokalizacji i śledzenia pojedynczych białek błonowych wewnątrz żywych komórek. Nazywamy tę metodę Mikroskopią Śledzenia i Lokalizacji (TALM)1,2. Podobnie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM)3 i mikroskopia lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji ((F)PALM)4,5, TALM jest techniką lokalizacji fluorescencji opartą na pojedynczej cząsteczce. Różni się jednak tym, że ruchliwość białek błonowych w połączeniu z powtarzającym się obrazowaniem tej samej znakowanej cząsteczki w różnych pozycjach ujawnia mikroprzedział, który jest dostępny dla białka ruchomego. Innymi słowy, możliwe lokalizacje białka są ustalane przez architekturę organelli i ruchliwość białka1. Metoda ta jest komplementarna z różnymi innymi technikami superrozdzielczości6,7,8, ponieważ ujawnia mapy lokalizacji i trajektorii poprzez obrazowanie białek ruchomych. Znakowanie opiera się na użyciu genetycznie modyfikowanych białek fuzyjnych, które same w sobie nie są fluorescencyjne. Te białka fuzyjne są samoznakującymi się enzymami, które reagują kowalencyjnie z substratem sprzężonym z barwnikiem. Ta procedura ma tę zaletę, że stopień etykietowania może być kontrolowany przez ilość dodanego substratu. Ponadto pozwala na zmianę barwy fluorescencji, w zależności od wybranego barwnika sprzężonego. Dostępnych jest kilka samoetykietujących się znaczników enzymatycznych9. Kolejną zaletą stosowania samoznakujących się znaczników enzymatycznych jest to, że sprzężone barwniki są zwykle bardziej stabilne i jaśniejsze niż białka fluorescencyjne1, a zatem poszczególne białka mogą być rejestrowane dłużej i dokładniej, dopóki nie zostaną wybielone. Pozwala to na rejestrację trajektorii ruchomych białek i ekstrakcję współczynników dyfuzji10,11.

Tutaj pokazujemy wykonalność TALM z mitochondrialnymi białkami błonowymi, ale może być również stosowany do innych białek błony wewnątrz- i zewnątrzkomórkowej, w tym różnych typów komórek12,13. Pokazujemy, że wielokolorowy TALM pozwala na jednoczesne rozróżnianie białek w różnych podprzedziałach w uzupełnieniu do istniejących technik mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości14,15,16. TALM jest kompatybilny z obrazowaniem żywych komórek17. Fotofizyka wybranych rodamin Tetramethylrhodamine (TMR) i Silicon-Rhodamien (SiR), a w szczególności ich jasność i stabilność, pozwala na rejestrację pojedynczych białek błonowych w wielu ramkach, zapewniając mapy lokalizacji (i trajektorii). Jednak TALM jest ograniczony do lokalizacji rozpuszczalnych białek o wysokich współczynnikach dyfuzji, ponieważ rozmycie ruchu jest zbyt wysokie, a zebrane fotony na klatkę są zbyt niskie, aby zapewnić prawidłową lokalizację. Poza tym TALM wymaga mniejszej mocy wzbudzenia niż na przykład mikroskopia STORM lub STED (Stimulated Emission Depletion)6,7, co zmniejsza efekty fototoksyczne. Jest to ważne, ponieważ stres fototoksyczny często wpływa na morfologię organellarów18, a tym samym na analizę mobilności19. Podsumowując, przedstawiamy wielobarwny TALM w żywych komórkach jako technikę, która wypełnia lukę między metodami mikroskopii lokalizacyjnej STORM/STED/(F)PALM a technikami analizującymi ruchliwość białek, takimi jak odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP)20,21, spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS)22, oraz spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS)11,23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Poniższy protokół jest zgodny z wytycznymi lokalnej instytucjonalnej komisji etyki badań.

1. Metody

  1. Hodowla komórek
    1. Hodować komórki, na przykład komórki HeLa (rak szyjki macicy człowieka), w kolbie do hodowli komórkowej T25 zawierającej 5 ml pożywki wzrostowej w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22.
      UWAGA: W celu przeprowadzenia obrazowania należy przenieść komórki na przygotowane szkiełka podstawowe (patrz kroki 1.3 i 1.4) i przechowywać je w medium do obrazowania.
  2. Transfekcja komórek
    UWAGA: W miarę możliwości należy stosować linie komórkowe stabilnie ekspresujące białka z tagiem24 aby uniknąć silnej nadekspresji. W przypadku transfekcji przejściowej należy dostosować ilość plazmidowego DNA użytego do transfekcji. Na przykład, gdy Ca2+ transfekcja fosforanowa25 stosuje się, transfekować komórki (80–90% konfluencji) w naczyniu hodowlano w rozmiarze 3,5 cm z 2,5–5 µg DNA plazmidowego. Podczas przeprowadzania podwójnej transfekcji należy użyć 2.5 µg dla każdego konstruktu plazmidowego.
    1. W przypadku eksperymentów dwukolorowych należy użyć linii komórkowej ze stabilną ekspresją jednego białka samoznakującego i przeprowadzić przejściową transfekcję plazmidem kodującym drugie białko samoznakujące.17.
      UWAGA: W tym przypadku, dla eksperymentów dwukolorowych, wykorzystano komórki HeLa stabilnie wykazujące ekspresję białek samoznakujących PINK1-Halo-Tag oraz Tom20-fSNAP-Tag.
  3. Czyszczenie szkiełek nakrywek
    1. Umieść szkiełka nakrywki w zlewce. Dodaj 30 ml H2Wlej do zlewki zawierającej szkiełka nakrywki i delikatnie potrząśnij, aby usunąć z ich powierzchni kurz.
    2. Zebrać szkiełka podstawowe za pomocą pęsety i osuszyć je strumieniem azotu.
    3. Usuń wszelkie zanieczyszczenia organiczne z powierzchni szkiełek podstawowych, np.poprzez czyszczenie plazmowe.
      UWAGA: Aby uniknąć dalszego zanieczyszczenia materiału szklanego, podczas manipulowania skrawkami szkiełka nakładczego należy używać rękawiczek.
      UWAGA: Podczas czyszczenia szkiełek cover-slip za pomocą plazmy oczyszczana jest tylko ich górna strona; należy używać tej strony do powlekania poli-L-lizyną-glikolem polietylenowym-argininą-glicyną-asparaginianem (PLL-PEG-RGD) (sekcja 1.4) oraz do wysiewu komórek (sekcja 1.5).
  4. Powlekanie szkiełek nakrywkowych PLL-PEG-RGD
    UWAGA: PLL-PEG-RGD jest pochodną poli-L-lizyny (PLL) z przyłączonym glikolem polietylenowym (3 0 Da) oraz peptydem cysteina-glicyna-arginina-glicyna-asparaginian-seryna (CGRGDS). PLL wiąże się z ujemnie naładowaną powierzchnią szkła, tworząc tzw. szczotkę PEG. Znacznie ogranicza to niespecyficzne wiązanie naładowanych barwników fluorescencyjnych. Ponadto motyw RGD naśladuje peptyd sygnałowy receptora integrynowego, a tym samym wspomaga integrynową adhezję komórek, które w przeciwnym razie nie przylegają łatwo do powierzchni.
    1. Przygotować PLL-PEG-RGD zgodnie z wcześniejszym opisem26W skrócie, należy rozpuścić 0,8 mg PLL-PEG-RGD w 1 ml PBS. Dodać 10 µL roztworu PLL-PEG-RGD na górnej stronie czystego szkiełka nakrywkowego.
    2. Weź drugie szkiełko nakrywki i połóż je czystą powierzchnią do dołu na pierwsze szkiełko nakrywki (na którym znajduje się kropla PLL-PEG-RGD); w ten sposób roztwór PLL-PEG-RGD zostanie zamknięty pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkami.
    3. Ostrożnie umieść zestaw sklejonych lamalek w zlewce i inkubuj przez 1 h w temperaturze pokojowej w suchym środowisku wolnym od kurzu.
    4. Po 1 h dodać 30 mL H2Dolej wody do zlewki, aby całkowicie przykryć szkiełka nakładki.
    5. Delikatnie potrząsaj zlewkiem, aż szkiełka nakrywowe oddzielą się od siebie.
    6. Za pomocą pęsety wyjmij krawetki z wody i wysusz je strumieniem azotu.
      UWAGA: Powlekane szkiełka coverglass można przechowywać przez kilka dni w suchej, sterylnej szklanej płytce Petri z pokrywką.
  5. Przygotowanie preparatu do obrazowania
    1. Przenieś pojedyncze powlekane szkiełka nakrywkowe do 35 mm naczynia hodowlano-kulturowego, tak aby powierzchnia powleczona PLL-PEG-RGD była skierowana do góry, a następnie dodaj na wierzch 2 ml medium do obrazowania.
    2. Dodaj około 50 0 utrawionych trypsyną komórek (20–500 µL) wykazujące ekspresję znaczników samomarkujących przy odpowiednich białkach błonowych, do 2 ml medium obrazującego w naczyniu hodowlanym z pokrywką szkiełka przedmiotu pokrytą powłoką. Delikatnie wymieszać ręcznie, aby zapewnić jednorodny rozkład komórek w celu uzyskania równomiernej warstwy komórkowej.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 do momentu osiągnięcia 80% konfluencji.
      UWAGA: Próbki komórek należy wysiać 3 dni przed obrazowaniem i 1 dzień przed transfekcją. Komórki stabilnie wykazujące ekspresję badanego białka można wysiać 2 dni przed obrazowaniem. Następnie obrazowaniu poddawane są wyłącznie komórki hodowane na szkiełku nakrywkowym.
  6. Oznakowanie białek z tagami
    UWAGA: Większość substratów fluorescencyjnych musi zostać rozpuszczona w bezwodnym DMSO. Zalecamy stosowanie roztworów stokowych 1 µM podłoże fluorescencyjne, gdy końcowe stężenie znakowania wynosi 0,2–30 nM17Do obrazowania białek błonowych wewnątrz komórek należy stosować przepuszczalne przez błony substraty fluorescencyjne.
    1. Podgrzej medium obrazujące do 37 °C w kąpieli wodnej.
    2. Pipetować 1 ml uprzednio ogrzanego medium obrazującego do probówki o pojemności 2 ml z zakrętką. Dodać 0,2–30 µL podłoży fluorescencyjnych z 1 µM roztwory zapasowe do przygotowania końcowego roztworu znakującego (stężenie końcowe: 0,2–30 nM).
    3. Wymieszaj roztwór znakujący na vortexie przez 10 s.
    4. Wymień medium w naczyniu hodowlanym 35 mm z komórkami na szkiełku nakrywkowym (patrz krok 1.5) na 1 ml przygotowanego roztworu znakującego.
    5. Inkubować komórki w roztworze znakującym w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez 20–30 min.
    6. Przemyj komórki raz 2 ml PBS, a następnie dwukrotnie 2 ml medium do obrazowania. Na koniec nanieś pipetą 1 ml świeżego medium do obrazowania do naczynia z komórkami i umieść próbkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C oraz 5% CO22 przez co najmniej 1 h. Przed obrazowaniem należy ponownie wymienić medium do obrazowania.
      UWAGA: Podczas pierwszego przeprowadzenia eksperymentu należy potwierdzić prawidłowe kierowanie białek oznakowanych samodzielnie do błon organelli poprzez barwienie organelli dostępnymi komercyjnie barwnikami specyficznymi dla danych organelli27,28W tym przypadku należy również zastosować 10–20 nM substratu dla enzymów samoznakujących, aby uzyskać silne sygnały.
  7. Przygotowanie próbki z fluorescencyjnymi kuleczkami
    UWAGA: W celu określenia dryftu optycznego oraz wyrównania obrazów z różnych kanałów zastosowano wielokolorowe koraliki fluorescencyjne (0.1 µm) są wykorzystywane. Na podstawie zarejestrowanych obrazów zostanie wygenerowana macierz przekształcenia afinicznego dla dwóch kanałów emisji.
    1. Rozcieńczyć roztwór kulek do stężenia 1% czystym H2O2O.
    2. Nanieś 5 kropli przygotowanego roztworu z kuleczkami fluorescencyjnymi w pięciu różnych miejscach na oczyszczonej szkiełku nakrywce (patrz krok 1.3).
    3. Pozostaw próbkę kulek fluorescencyjnych do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
      UWAGA: Próbkę można wykorzystać ponownie; dlatego należy przykryć ją folią aluminiową, aby uniknąć kontaminacji, i przechowywać w 4 °C.

2. Mikroskopia

  1. Układ eksperymentalny
    UWAGA: Podstawowy system mikroskopowy do obrazowania pojedynczych cząsteczek w dwóch kolorach opiera się na mikroskopie odwróconym: jest on wyposażony w dwa lasery sprzężone za pomocą wielomoduowego światłowodu jednomodowego z zachowaniem polaryzacji z jednym kondensorem do całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR), obiektyw imersyjny olejowy przeznaczony do TIRF, filtry emisyjne wielopasmowe, rozdzielacz obrazu oraz wysoce czułą kamerę (Rysunek 1). Wymagany jest kondensor TIR umożliwiający ciągłą regulację kąta padania w celu przełączania pomiędzy trybem epi-, trybem o dużym nachyleniu i laminowanej warstwy optycznej (oświetlenie cienką warstwą o dużym nachyleniu (HILO)29) oraz trybem wzbudzenia TIRF z optymalną głębokością penetracji. Obrazy są pozyskiwane za pomocą wysoce czułego chłodzonego systemu detekcyjnego, np. kamery z urządzeniem ładunkowo-sprzężonym z mnożnikiem elektronów z podświetleniem tylnym (EMCCD) (wydajność kwantowa QE >90%) lub kamery sCMOS (QE >80–90%).
    1. Wyznacz dryf optyczny poprzez obrazowanie kulek fluorescencyjnych (patrz krok 2.2) w tych samych warunkach, które zostaną później zastosowane w eksperymencie, np. jeśli w eksperymencie rejestrowanych jest 10 00 klatek, zarejestruj również 10 0 klatek z próbką kulek. Aby wyznaczyć dryf optyczny, porównaj pozycję kulek na pierwszej klatce i ostatniej pozyskanej klatce (Rysunek 1B). W razie potrzeby skoryguj później serię obrazów pod kątem dryfu optycznego30 i/lub zastosuj środowiska stabilne pod względem dryfu.
    2. Wyposaż kostkę filtracyjną w odpowiedni dichroiczny rozdzielacz wiązki, np. dla fluorescencji pomarańczowej i czerwonej, oraz w odpowiednie filtry emisyjne dla fluorescencji pomarańczowej i czerwonej. Wyposaż rozdzielacz obrazu w odpowiednie filtry. Sprawdź możliwość przenikania sygnałów z jednego kanału do drugiego, rejestrując próbki jednokolorowe w obu kanałach (Rysunek 1C).

schemat mikroskopii HILO; układ TIRF; analiza dryftu optycznego; wynik separacji dwukolorowej.
Rycina 1Układ optyczny dla mikroskopii wielokolorowego śledzenia i lokalizacji (TALM) z emiterami pomarańczowymi i czerwonymi. (A) Konfiguracja mikroskopu odwróconego z co najmniej dwoma laserami wzbudzającymi, kondensorem TIRF, odpowiednim obiektywem TIRF, rozdzielaczem obrazu oraz czułą kamerą. Wstawka: aby wzbudzić organelle wewnątrz komórek, kąt wiązki padającej musi być ustawiony na wartość mniejszą od kąta krytycznego dla TIRF, aby uzyskać oświetlenie za pomocą silnie nachylonej i laminowanej warstwy optycznej (HILO). DC1: lustro dichroiczne 1; DC2: lustro dichroiczne 2. EF: filtr emisyjny. (B) Test dryfu optycznego poprzez obrazowanie pozycji fluorescencyjnej kulki przez 10 0 klatek przy takiej samej częstotliwości klatek, jak w następujących eksperymentach (tutaj: 15 Hz). Połączone pozycje pierwszych 50 klatek i ostatnich 50 klatek wykazują dryf. Ponadto nałożony obraz z pozycją pierwszej i ostatniej klatki w kolorze czerwonym i niebieskim wykazuje minimalny dryf. Dryf to odległość między środkami sygnałów podzielona przez całkowity czas rejestracji, w tym przypadku 125 pm/s. (C) Sprawdzono wyraźną separację sygnałów, w tym przypadku TMR i SiR. Dla obu kanałów wygenerowano obrazy sumy skumulowanej z 3 0 klatek (TMR w kanale 1 i SiR w kanale 2). SiRHTL zostało przyłączone do Tom20-HaloTag i TMRHTL do kompleksu V-HaloTag łańcucha oddechowego (OxPhos). Kolory są sztuczne. Paski skali = 10 nm (B) i 1 µm (C). Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

  1. Fizyczne wyrównanie obrazów generowanych przez rozdzielacz obrazu
    UWAGA: Do montażu preparatu przygotowanego na szkiełku nakrywkowym można użyć własnoręcznie wykonowanego uchwytu na próbkę (Rysunek 2A). Aby zapobiec wpadaniu kurzu itp. do próbki, podczas montażu należy luźno położyć pokrywkę naczynia hodowlanego na komorze. Ten sam uchwyt można wykorzystać do zamocowania szkiełka nakrywkowego z kuleczkami fluorescencyjnymi lub komórkami; w przypadku obrazowania komórek należy dodać 0,5–0,8 mL medium obrazującego. Rozdzielacz obrazu rozdziela obraz na dwa lub więcej spektralnie oddzielone kanały i rzutuje je obok siebie na tę samą kamerę. Proces ten może wprowadzać systematyczne zniekształcenia między kanałami ze względu na różne przebyte drogi optyczne i utrudniać bezpośrednią analizę kolokalizacji. Dlatego w pierwszej kolejności należy przeprowadzić wyrównanie fizyczne, a następnie wyrównanie po korekcji za pomocą macierzy transformacji. W obu procesach wyrównywania kuleczki fluorescencyjne powinny być homogenicznie rozmieszczone w całym polu widzenia.
    1. Zamocować przygotowaną próbkę z kuleczkami fluorescencyjnymi w uchwycie na próbkę pomiędzy pierścieniem z politetrafluoroetylenu (PTFE) a czerwonym pierścieniem gumowym (Rysunek 2A).
    2. Uruchomić mikroskop, wszystkie komponenty sprzętowe oraz całe oprogramowanie niezbędne do mikroskopii.
    3. Wyczyścić obiektyw i spód szkiełka nakrywkowego za pomocą bezpyłowej chusteczki zwilżonej izopropanolem. Następnie osuszyć oba elementy nową bezpyłową chusteczką. Nanieść kroplę oleju imersyjnego na źrenicę obiektywu.
    4. Umieścić uchwyt z próbką kuleczek na stole mikroskopu tak, aby spód szkiełka nakrywkowego stykał się z olejem. Ustawić ostrość na kuleczkach, korzystając ze światła przechodzącego lub linii laserowej.
    5. Dostosować moc dwóch laserów wzbudzających, aby uzyskać podobną intensywność sygnału w obu kanałach fluorescencji. Odnaleźć obszar z wieloma wyraźnymi sygnałami fluorescencyjnymi.
    6. Wygenerować widok scalony kanałów fluorescencyjnych za pomocą oprogramowania sterującego kamerą. Następnie, używając śrub rozdzielacza obrazu, ręcznie przechylić wewnętrzne lustra rozdzielacza obrazu, aby uzyskać najlepsze nałożenie sygnałów z dwóch kanałów fluorescencyjnych (Rysunek 2B).
      UWAGA: Uwaga! Nie należy przekraczać zakresu dynamicznego kamery.
  2. Wyrównanie kanałów rozdzielonych spektralnie za pomocą oprogramowania wykonującego transformację przestrzenną
    UWAGA: Poniższa część przedstawia procedurę wyrównania po korekcji oraz lokalizacji z wykorzystaniem naszego wtyczki programowej (dostępnej na żądanie).
    1. Uruchomić oprogramowanie sterujące mikroskopem TIRF i wybrać wyświetlanie poszczególnych kanałów w trybie strumienia na żywo. Wykonać zdjęcie migawkowe, wzbudzając fluorescencję we wszystkich kanałach (Rysunek 2C).
    2. Wykorzystać to zdjęcie migawkowe do stworzenia macierzy transformacji (patrz Rysunek 2).
      UWAGA: Macierz transformacji jest wykorzystywana do transformacji przestrzennej, zazwyczaj afinicznej, która koryguje translację (rozbieżność sygnałów z jednego punktowego źródła pomiędzy dwoma kanałami).
    3. Uruchomić wtyczkę analityczną oprogramowania (można ją uzyskać na żądanie z naszego laboratorium, patrz Rysunek 2C).
    4. Wczytać do oprogramowania wcześniej zarejestrowane dwukolorowe obrazy kuleczek fluorescencyjnych (patrz krok 2.2). Wybrać zastosowaną orientację kanałów fluorescencyjnych. Następnie kliknąć „tak” w odpowiedzi na zapytanie o „kalibrację obrazów” (calibrate images) i wybrać wcześniej wykonane zdjęcie migawkowe.
    5. Otworzyć „UNIT MANAGER”, aby zdefiniować współczynniki przeliczeniowe jednostek (rozmiar piksela, częstotliwość klatek, współczynnik konwersji fotonów).
    6. Otworzyć „LOCALIZATION MANAGER”. Najpierw wyznaczyć funkcję rozproszenia punktu (PSF). Nacisnąć przycisk: „PSF radius”. W otwartym oknie „PSF Estimator” zdefiniować aperturę numeryczną oraz maksimum emisji. Uruchomić „Estimate PSF radius” kliknięciem. Zaakceptować uzyskaną eksperymentalną PSF. Zdefiniować ramkę oceny, liczbę pętli deflacyjnych oraz liczbę rdzeni procesora wykorzystywanych do obliczeń. Nacisnąć „localize”, aby rozpocząć dopasowanie rozkładu intensywności pojedynczych cząstek do symetrycznej funkcji Gaussa 2D (Rysunek 2C).
    7. Zaakceptować („Accept”) uzyskaną eksperymentalną PSF. Zdefiniować ramkę oceny, liczbę pętli deflacyjnych oraz liczbę rdzeni procesora wykorzystywanych do obliczeń. Nacisnąć „localize”, aby rozpocząć dopasowanie rozkładu intensywności pojedynczych cząstek do symetrycznej funkcji Gaussa 2D (Rysunek 2C).
    8. Otworzyć „CALIBRATION MANAGER”. Na wygenerowanym obrazie scalonym dwóch kanałów widoczne są oryginalne sygnały i zlokalizowane centra. Wybrać tryb „affine”. Ręcznie połączyć odpowiadające sobie pary zlokalizowanych centrów w dwóch kanałach, które pochodzą z tej samej kuleczki fluorescencyjnej, rysując linię połączenia.
    9. Połączyć odpowiadające sobie sygnały rozmieszczone w całym polu widzenia. Po wykonaniu tej czynności nacisnąć „accept”. Zapisać kalibrację.
      UWAGA: Transformacja przestrzenna jest próbkowana dla każdej kuleczki fluorescencyjnej i interpolowana pomiędzy nimi. Wyekstrahowana funkcja transformacji reprezentuje pole przesunięcia Δr(x,y), które jest następnie wykorzystywane do korekty eksperymentalnych dwukolorowych lokalizacji pojedynczych cząsteczek tak, aby nakładały się one w granicach ich precyzji lokalizacji. Macierz transformacji przestrzennej jest zazwyczaj macierzą afiniczną, która z nanometrową dokładnością koryguje translację, skalowanie i rotację między kanałami; może ona zostać wywnioskowana z tego ręcznego mapowania jeden do jednego (Rysunek 2C).

Proces wyrównania próbki z koralikami fluorescencyjnymi; dopasowanie gaussowskie 2D; macierz transformacji dla kalibracji kanałów.
Rycina 2Przebieg procedury wyrównania dwóch kolorów. (AKuweta z kuleczkami fluorescencyjnymi zostaje zamocowana w uchwycie do próbek pomiędzy pierścieniem z PTFE a pierścieniem gumowym. Następnie górna i dolna część komory zostają skręcone ze sobą.B) Fizyczne dopasowanie widoków kanałów generowanych przez rozdzielacz obrazu. Zarejestrowane sygnały fluorescencyjne z kulek (0.1 µm) w dwóch kanałach (zielonym i czerwonym, fałszywe kolory) zostają nałożone. Odpowiednie śruby w rozdzielaczu obrazu optycznego są przekręcane ręcznie do momentu uzyskania najlepszego nałożenia się różnych sygnałów (kolor żółty, dolny panel). (C) Generowanie macierzy transformacji dla dopasowania kanałów w procesie post-processingu. W celu precyzyjnej lokalizacji cząstki konieczne jest określenie funkcji rozproszenia punktu (PSF) w zależności od długości fali emisji oraz apertury numerycznej obiektywu. Środek PSF można wyznaczyć na podstawie profilu jego intensywności, analizowanego za pomocą symetrycznego dwuwymiarowego dopasowania gaussowskiego. Uzyskana lokalizacja piku sygnału jest następnie rzutowana na oryginalne, rozmyte sygnały. Na obrazie scalonym zlokalizowane środki sygnałów z dwóch kanałów są łączone w celu wygenerowania macierzy transformacji, która jest następnie wykorzystywana do dopasowania danych eksperymentalnych w procesie post-processingu. Paski skali = 1 µm (B, C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Obrazowanie pojedynczych cząsteczek białek błony mitochondrialnej
    UWAGA: Wszystkie eksperymenty są przeprowadzane w temperaturze pokojowej. Limfocyty T lub komórki nieadherentne muszą zostać unieruchomione w agarozie przed obrazowaniem31.
    1. Zamocuj preparat z adherentnymi komórkami na szkiełku nakrywnym pomiędzy pierścieniami gumowymi i PTFE (Rycina 3A). Napełnij komorę 0,5–0,8 ml medium obrazującego.
    2. Powtórz kroki 2.2.2–2.2.5.
    3. Skoryguj kąt oświetlenia w oprogramowaniu sterującym mikroskopem TIRF, aby uzyskać kąt padania mniejszy od kąta krytycznego dla trybu TIR, co pozwoli na wzbudzenie określonego obszaru zainteresowania za pomocą arkusza HILO.32 (tryb HILO, Rysunek 1A).
      OSTRZEŻENIE: Należy unikać bezpośredniego kontaktu oczu z wiązką lasera!
    4. Ustaw wzmocnienie EM (EM gain) i wybierz czas ekspozycji odpowiedni dla eksperymentu, aby zebrać wystarczającą liczbę fotonów na klatkę.
    5. Ustaw moc lasera w taki sposób, aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do szumu (S/N) (Rycina 3B), ponieważ precyzja lokalizacji bezpośrednio odpowiada stosunkowi sygnału do szumu (S/N)33 (Rycina 3C).
    6. Znajdź obszar na peryferiach komórki z niezachodzącymi na siebie, wydłużonymi mitochondriami oraz sygnałami pojedynczych cząsteczek (Rysunek 3D; Wideo uzupełniające 1). Jeśli nie są widoczne sygnały pojedynczych cząsteczek, należy poczekać, aż w wyniku blaknięcia pojawią się sygnały pojedynczych cząsteczek (Rysunek 3E).
    7. Rejestrować do momentu, gdy liczba sygnałów stanie się zbyt niska, aby dalsza kontynuacja była zasadna (zazwyczaj od 1 0 do 10 0 klatek, w zależności od charakterystyki blaknięcia barwnika fluorescencyjnego, Rycina 3F).
    8. Uruchom oprogramowanie do przetwarzania obrazów i sprawdź obecność struktur mitochondrialnych poprzez wygenerowanie obrazu sumarycznego (cumulative rendered sum image) z co najmniej 10 zarejestrowanych klatek (Rysunek 3G).
      UWAGA: Maksymalna częstotliwość odświeżania klatek jest określona przez obszar odczytu. Pole widzenia dla jednego kanału jest ograniczane przez dwukolorowy rozdzielacz obrazu (512 x 512 pikseli) do 256 x 512 pikseli, a w przypadku rozdzielacza czterokolorowego do 256 x 256 pikseli. Zatem przy użyciu rozdzielacza obrazu dla dwóch kolorów wartość ta wynosi 30 Hz. Ustaw tryb przesyłania klatek tak, aby uzyskać najkrótszy możliwy czas odczytu.
    9. Uruchom wtyczkę do analizy oprogramowania i wczytaj surowe dane. Wybierz orientację kanałów i wczytaj obrazy. W odpowiedzi na zapytanie „Calibrate images” (Kalibracja obrazów) zastosuj macierz transformacji z kroku 2.3.9. Kanały zostaną wyświetlone oddzielnie. 
    10. Otwórz „UNIT MANAGER”, tak jak wcześniej, aby zdefiniować współczynniki konwersji jednostek dla każdego kanału. Otwórz „LOCALIZATION MANAGER” dla każdego kanału. Następnie zdefiniuj pole ewaluacji, liczbę pętli deflacji, dodaj teoretyczną funkcję rozsyłania punktowego (PSF) dla zastosowanych warunków i ustaw liczbę rdzeni komputera wykorzystywanych do obliczeń. Na koniec naciśnij „localize”, aby uzyskać zlokalizowane pojedyncze cząsteczki (Rysunek 3H; Materiał wideo uzupełniające 2).
    11. Należy zauważyć, że program ostatecznie wygeneruje skumulowany obraz o superrozdzielczości, przedstawiający wszystkie zlokalizowane cząstki (Rycina 3I).
    12. Przeprowadzić analizę, np., za pomocą oprogramowania open source lub naszego oprogramowania dostępnego na żądanie. 
    13. Śledź pojedyncze cząsteczki w obu zlokalizowanych kanałach, np.z zastosowaniem znacznika wielocelowego10
      UWAGA: Krok 2.4.13 wymaga wstępnej wiedzy (eksperymentalnej) na temat dyfuzyjności badanych białek w celu prawidłowego ustalenia warunków brzegowych. Zazwyczaj wyznaczenie odpowiednich warunków brzegowych jest procesem iteracyjnym. 

Konfiguracja i analiza obrazowania komórkowego; system mikroskopowy z danymi lokalizacyjnymi i wykresami stosunku sygnału do szumu.
Rysunek 3Etapy mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek. (A) Szkiełko podstawowe z preparatem zostaje zamontowane pomiędzy górną i dolną częścią (szarą) wykonanego samodzielnie uchwytu na próbkę (zaprojektowanego przez J. Bereiter-Hahna). Pierścień gumowy (czerwony) oraz pierścień PTFE (biały) uszczelniają system powyżej i poniżej szkiełka podstawowego po skręceniu części uchwytu na próbkę śrubami. (B) Stosunek sygnału do szumu sygnału TMR. (C) Histogram obliczonej precyzji lokalizacji dla wszystkich zlokalizowanych cząstek. (D) Wybór odpowiedniego obszaru do obrazowania; w tym przypadku obrzeże komórki z wyraźnie oddzielonymi mitochondriami. (E) Rejestracja i przetwarzanie obrazu: przedstawiono pojedynczą klatkę z wyraźnymi sygnałami pojedynczych cząsteczek (tutaj pojedyncze cząsteczki CV-HaloTag/TMR)HTL zapisano). (F) Intensywność TMR w czasie rejestracji. (G) Obraz sumy skumulowanej z 3 0 klatek, nieprzetworzony. (H) Cząsteczki CV-HaloTag/TMRHTL zlokalizowano za pomocą funkcji Gaussa 2D na podstawie pojedynczej klatki. (I) Skumulowany, wyrenderowany obraz sumaryczny przedstawiający wszystkie zlokalizowane CV-HaloTag/TMRHTL cząstki z 30 klatek. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wielokolorowe obrazowanie i analiza kolokalizacji mogą pomóc w określeniu suborganellowej lokalizacji białek. Wykazaliśmy to wcześniej w przypadku cytozolowej fosfatazy i homologu tensyny, PINK1, która zajmuje różne lokalizacje submitochondrialne ze względu na przetwarzanie przez proteazy mitochondrialne17. PINK1 jest istotnym czynnikiem gwarantującym funkcjonalność mitochondriów34,35. Aby określić lokaliza...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule zaprezentowano technikę dwukolorowej lokalizacji pojedynczych cząsteczek ruchomych białek błonowych. Zgodnie z protokołem, białka błonowe są łączone z samoznakującymi się białkami, które reagują z barwnikami rodaminy TMR i SiR sprzężonymi z odpowiednimi substratami. Barwniki rodaminowe są jasne i fotostabilne, a tym samym pozwalają na powtarzalne obrazowanie1. Aby zapewnić pomyślne wyniki, należy pamiętać o kilku warunkach i krytycznych tematach.

Po pierw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować grupie Biofizyki i Jacobowi Piehlerowi z Uniwersytetu w Osnabrück za ciągłe wsparcie, Władysławowi Kohlowi za pomoc techniczną i przygotowanie materiału, a także zarządowi CellNanOs za dostarczenie mikroskopów do użytku. Projekt został sfinansowany przez SFB 944.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas (2-(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo)-etanosulfonowy, 1 M) (HEPES)Biochrom#1104E
DC1: Dichroidalny rozdzielacz wiązki Chroma640 dcxrNC506031
DC2: Lustro polichroiczne, rozdzielacz wiązkiChromazt405/488/561/640rpcwycofane
z produkcji Dulbecco´ s Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 1x (bez Ca & Mg)Sigma-Aldrich & Co.
Earle´ s MEM bez czerwieni fenolowej, bez L-Glutaminy i bez NaHCO3 zawierającego 1% FBS, 0,1% HEPES, 0,1% NEAA, 0,1% Alanylo-L-Glutaminy i 34,78% wodorowęglanu sodu (NaHCO3 0,75 g / l)Podłoże obrazowe
Earle´ s minimum niezbędne podłoże (MEM) z czerwienią fenolową, zawierające 1% płodowej surowicy bydlęcej Superior (FBS), 0,1% HEPES (kwas 2-(4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynylo)-etanosulfonowy, 1 M) i 0,1% aminokwasów endogennych (NEAA)Pożywka wzrostowa
EF: Czteropasmowy filtr emisyjnyAHF analysentechnikF72-866Brightline HC 446 nm/523 nm/600 nm/677 nm
Kamera EMCCDAndorAndor iXON 897
Filtr emisyjny QuadView kostki filtracyjne, pomarańczowyAHF analysentechnikF39-637pasmo przepustowe 582 - 619 nm
Filtr emisyjny Kostki filtracyjne QuadView, czerwonePasmo przepustowe Chroma655 - 725 nm (HQ 690/70)
FBS (Surowica bydlęca) superiorBiochromS0615
Koraliki fluorescencyjne: TetraSpeck™ Mikrosfery, 0,1 i mikro; m, fluorescencyjny niebieski/zielony/pomarańczowy/ciemnoczerwonyThermo Fisher ScientificT7279mikrosfery fluorescencyjne
GlutaminaBiochrom#0951C
Komórki HeLa DSMZACC-57Komórki raka szyjki macicy od pacjentki Henrietta Lacks
Hela cells CI::p aGFP, stabilnyMuster et al., PLOSOne 2010
Hela cells CV g::Halo7-Tag, stabilnyAppelhans et al., NanoLett 2012
Hela cells Tom20::Halo7-Tag, stabilnyAppelhans et al., NanoLett 2012
Rozdzielacz obrazuFotometriaDual-View Emisja rozdzielacza obrazu
Oprogramowanie do przetwarzania obrazu ImageJ2 / Fijifreeware
Olejek immersyjny - ImmersolTM 518 F (ne = 1.518, ve = 45)Carl Zeiss Jena GmbH444960-0000-000
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjnyOlympus IX-71/73/83
Laser 561 nm, 200 mWCrystaLaserCL-561-200emisja 561 nm
Laser 642 nm, 140 mWOmicronLuxx-642-140emisja 642 nm
MATLABMathWorkswersja R2013a
MEM z Earle's Balanced Salt Solution 2,2 g/L NaHCO3, stabilna glutamina bez PRBiochromFG-0385
MEM z Earle's Balanced Salt Solution z 2,2 g/L NaHCO3, stabilna glutamina, PhenolredBiochromFG-0325
MitoTracker® Deep Red FMThermo Fisher ScientificM22426barwnik
MitoTracker® Zielony barwnik FMThermo Fisher ScientificM7514
Wielomodowa polaryzacja optyczna utrzymująca światłowód jednomodowyPointsource/QioptiqKineFLEX
NHS-PEG-MAL, Rapp Polymer Rapp Polymere GmbH Tü Szkiełko nakrywkowe
endogenne aminokwasy (NEAA)Biochrom#0802E
PEG 800 (Glikol polietylenowy) 10 %Carl Roth GmbHNr art 0263.1Powłoka szkiełka nakrywkowego
Penicylina/StreptomycynaBiochrom#0122E
Plazmid do ekspresji PINK1-Halo7-TagBeinlich i wsp., ACS Chemical Biology 2015
Poli-L-lizyna (1,2 mg/ml)Sigma-Aldrich & Co.kot. No.P9155powłoka szkiełka nakrywkowego
RGD Peptyd (Ac-CGRGDS-COOH)System rdzeniowy Diagnostix GmbH,powłoka szkiełka nakrywkowego Gernsheim
Rodamina krzemowa połączona z HaloTag®-Ligand (SiRHTL) osobisty prezent od Kaia Johnsonabarwnik,
wtyczka do analizy oprogramowania, napisana samodzielnie: C. P. Richter, Biophysik Osnabrü ckSLIMFAST 16g
Tetrametylorodamina / SNAP-Cell® TMR-Star połączony z SNAP-Ligand (TMRstar) Biolab Nowej Anglii ®Barwnik S9105S
Tetrametylorodamina związana z HaloTag®-Ligand (TMRHTL) Kondensator PromegaG8251barwnik
TIRFOlympusCell^TIRF MITICO SystemKondensator TIRF
Oprogramowanie sterujące mikroskopem TIRFOlympus cellSens 1.12
Obiektyw TIRFOlympus150x (ND 1,45; Olympus UAPO)
Trypsyna/EDTA 10xBiochrom#0266
Woda H2O 99,5 % Rotipuran® Niska zawartość organiczna Carl Roth GmbHArt. Nie. Zobacz materiał HN57.1
#RNBF8311QV2Bingen Powłoka / motyw receptora Intergrin, Obiektyw olejowy

Bibliografia

  1. Appelhans, T., Richter, C., Wilkens, V., Hess, S., Piehler, J., Busch, K. Nanoscale organization of mitochondrial microcompartments revealed by combining tracking and localization microscopy. Nano Letters. 12 (2), 610-616 (2012).
  2. Appelhans, T., Busch, K. Single Molecule Tracking and Localization of Mitochondrial Protein Complexes in Live Cells. Methods Mol Biol. 1567, 273-291 (2017).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  4. Gould, T. J., Verkhusha, V. V., Hess, S. T. Imaging biological structures with fluorescence photoactivation localization microscopy. Nat Protoc. 4 (3), 291-308 (2009).
  5. Pennacchietti, F., Gould, T. J., Hess, S. T. The Role of Probe Photophysics in Localization-Based Superresolution Microscopy. Biophys J. 113 (9), 2037-2054 (2017).
  6. Wegel, E., Göhler, A., Lagerholm, B. C., Wainman, A. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific reports. , Available from: https://www.nature.com/articles/srep27290?WT.feed_name=subjects_physical-sciences (2016).
  7. Pellett, P., et al. Two-color STED microscopy in living cells. Biomedical Optics Express. 2 (8), (2011).
  8. Ishigaki, M., et al. STED super-resolution imaging of mitochondria labeled with TMRM in living cells. Mitochondrion. 28, 79(2016).
  9. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740(2015).
  10. Sergé, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat Methods. 5 (8), (2008).
  11. Appelhans, T., Busch, K. B. Dynamic imaging of mitochondrial membrane proteins in specific sub-organelle membrane locations. Biophysical reviews. 9 (4), 345-352 (2017).
  12. Wilmes, S., et al. Triple-color super-resolution imaging of live cells: resolving submicroscopic receptor organization in the plasma membrane. Angewandte Chemie. 51 (20), 4868-4871 (2012).
  13. Niewidok, B., et al. Single-molecule imaging reveals dynamic biphasic partition of RNA-binding proteins in stress granules. J Cell Biol. , (2018).
  14. Wurm, C. A., Jakobs, S. Differential protein distributions define two sub-compartments of the mitochondrial inner membrane in yeast. FEBS Lett. 580 (24), 5628-5634 (2006).
  15. Schmidt, R., Wurm, C. A., Punge, A., Egner, A., Jakobs, S., Hell, S. W. Mitochondrial cristae revealed with focused light. Nano Lett. 9 (6), 2508-2510 (2009).
  16. Kukat, C., Wurm, C. A., Spahr, H., Falkenberg, M., Larsson, N. G., Jakobs, S. Super-resolution microscopy reveals that mammalian mitochondrial nucleoids have a uniform size and frequently contain a single copy of mtDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (33), 13534-13539 (2011).
  17. Beinlich, F., Drees, C., Piehler, J., Busch, K. Shuttling of PINK1 between Mitochondrial Microcompartments Resolved by Triple-Color Superresolution Microscopy. ACS chemical biology. 10 (9), 1970-1976 (2015).
  18. Shim, S., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).
  19. Sbalzarini, I., Mezzacasa, A., Helenius, A., Koumoutsakos, P. Effects of Organelle Shape on Fluorescence Recovery after Photobleaching. Biophysical Journal. 89 (3), 1482-1492 (2005).
  20. Reits, E., Neefjes, J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), E145-E147 (2001).
  21. Goehring, N., Chowdhury, D., Hyman, A., Grill, S. FRAP Analysis of Membrane-Associated Proteins: Lateral Diffusion and Membrane-Cytoplasmic Exchange. Biophysical Journal. 99 (8), 2443-2452 (2010).
  22. Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harbor protocols. 2014 (7), 709-725 (2014).
  23. Sukhorukov, V., Dikov, D., Busch, K., Strecker, V., Wittig, I., Bereiter-Hahn, J. Determination of protein mobility in mitochondrial membranes of living cells. Biochimica et biophysica acta. 1798 (11), 2022-2032 (2010).
  24. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  25. Graham, F. L., van der Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52 (2), 456-467 (1973).
  26. Wedeking, T., et al. Spatiotemporally Controlled Reorganization of Signaling Complexes in the Plasma Membrane of Living Cells. Small. 11 (44), 5912-5918 (2015).
  27. Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280 (1), 715-721 (2005).
  28. Poot, M., et al. Analysis of mitochondrial morphology and function with novel fixable fluorescent stains. J Histochem Cytochem. 44 (12), 1363-1372 (1996).
  29. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells (vol 5, pg 159). Nature Methods. 5 (5), 455(2008).
  30. Elmokadem, A., Yu, J. Optimal Drift Correction for Superresolution Localization Microscopy with Bayesian Inference. Biophys J. 109 (9), 1772-1780 (2015).
  31. Barlag, B., et al. Single molecule super-resolution imaging of proteins in living Salmonella enterica using self-labelling enzymes. Sci Rep. 6, 31601(2016).
  32. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  33. Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
  34. Jin, S., Youle, R. J. PINK1- and Parkin-Mediated Mitophagy at a Glance. Journal of Cell Science. 125, 795-799 (2013).
  35. Yamano, K., Youle, R. J. PINK1 is degraded through the N-end rule pathway. Autophagy. 9 (11), 1758-1758 (2013).
  36. Wiedemann, N., et al. Machinery for protein sorting and assembly in the mitochondrial outer membrane. Nature. 424 (6948), 565-571 (2003).
  37. Thompson, R., Larson, D., Webb, W. Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes. Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Lokalizacja pojedynczych cząsteczekmikroskopia wielokolorowaobrazowanie żywych komórekbiałka błony mitochondrialnejlokalizacja PINK1mikroskopia TIRFtagi samoznakującebarwniki fluorescencyjneznakowanie substochiometryczneśledzenie organelli
Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.