Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej

Summary

Tutaj opisujemy procedurę testowania migracji komórek in vitro za pomocą automatycznego mikroskopu optycznego. Test zarysowania jest szeroko stosowany, w którym zamknięcie rysy następuje przez określony czas. Mikroskop optyczny umożliwia niezawodne i tanie wykrywanie migracji komórek.

Abstract

Migracja komórek jest ważnym procesem, który wpływa na wiele aspektów zdrowia, takich jak gojenie się ran i rak, dlatego jest kluczowy dla rozwoju metod badania migracji. Test zarysowania od dawna jest najpowszechniejszą metodą in vitro do badania związków o właściwościach anty- i promigracyjnych ze względu na niski koszt i prostą procedurę. Jednak często zgłaszanym problemem testu jest nagromadzenie komórek na krawędzi rysy. Ponadto, aby uzyskać dane z testu, należy wykonać obrazy o różnym narażeniu w okresie czasu dokładnie w tym samym miejscu, aby porównać ruchy migracji. Do opisania zarysowania można użyć różnych programów analitycznych, ale są one pracochłonne, niedokładne i wymuszają cykle zmian temperatury. W tym badaniu demonstrujemy zoptymalizowaną metodę badania efektu migracji, np. z naturalnie występującymi białkami laktoferyną ludzką i bydlęcą oraz ich N-końcowym peptydem laktoferrycyną na linii komórek nabłonkowych HaCaT. Kluczową optymalizacją jest mycie i drapanie w PBS, co eliminuje wspomniane wcześniej gromadzenie się komórek wzdłuż krawędzi. Można to wytłumaczyć usunięciem kationów, które, jak wykazano, mają wpływ na połączenie komórka-komórka keratynocytu. Aby zapewnić dokładne wykrywanie migracji, do protokołu dodano wstępne leczenie mitomycyną C, inhibitorem syntezy DNA. Na koniec demonstrujemy zautomatyzowaną kamerę optyczną, która eliminuje nadmierne cykle temperaturowe, pracę ręczną z analizą zarysowań, jednocześnie poprawiając odtwarzalność i zapewniając analizę identycznych odcinków zadrapania w czasie.

Introduction

Migracja to ważny proces, który wpływa na kilka aspektów fizjologicznych. W procesie gojenia się ran migracja ułatwia ponowną epitelizację skóry. W niegojących się ranach, takich jak rany przewlekłe, bakterie oportunistyczne powodują zakażenie rany, a otwarte rany są idealne do rozwoju bakterii i tworzenia biofilmu^1,2. Biofilm jest jedną z przyczyn rozwoju opornych bakterii, które są jednym z największych zagrożeń dla naszego współczesnego społeczeństwa³. Podczas gojenia się ran komórki odpornościowe nie mogą przeniknąć do biofilmu. W przypadku nowotworów migracja komórek nowotworowych jest kluczowym etapem przerzutów, które są główną przyczyną zgonów pacjentów z guzami litymi^4,5. Dlatego tak ważne jest, aby móc badać migracje.

Test scratch jest często używany do testowania migracji komórek, ponieważ jest tani i łatwy do przeprowadzenia na przylegających liniach komórkowych, takich jak fibroblasty, śródbłonki i nabłonkowe linie komórkowe6^,7. Obecnie istnieje kilka metod wykonywania zadrapań⁸ i zgłoszono, że używane są różne materiały, w tym wykałaczki⁹, skrobaki do komórek¹⁰, lasers¹¹ i prądy elektryczne¹². Wszystkie metody mają różne zalety i wady, a metodę należy wybrać w zależności od typu komórki, budżetu i narzędzia do analizy. Na przykład, jeśli używany typ ogniwa wymaga powlekania, ręczne usuwanie ciśnienia, np. za pomocą wykałaczki lub końcówki pipety, wpłynie na migrację w obrębie obszaru, należy zastosować inną metodę. W tym badaniu skupimy się na ręcznym skrobaniu.

Wadą ręcznego skrobania jest zmienność rozmiaru, kształtów zadrapań i nagromadzenie komórek na krawędziach rysy. Istnieje wiele protokołów, a często cytowany artykuł zaleca zwiększenie prędkości i/lub dokładne mycie po zadrapaniu¹³. Ponadto zastosowano kilka metod w celu zminimalizowania proliferacji, ponieważ proliferacji komórek nie można odróżnić od migracji, a zatem może dawać fałszywie dodatnie wyniki migracji. Niektóre zgłoszone metody to głód surowicy poprzedzający scratch¹⁴ i zmniejszanie ilości surowicy¹⁵. Jednak żadna z tych metod nie może zagwarantować, że nie dojdzie do proliferacji. Dlatego informujemy o wstępnym traktowaniu komórek mitomycyną C, aby zapewnić prawdziwe wyniki migracji. Mitomicyna C jest antybiotykiem, który hamuje syntezę DNA poprzez tworzenie wiązania kowalencyjnego z DNA, co zapobiega rozdzielaniu się DNA¹⁶. Poprzez wstępne traktowanie mitomycyną C i mycie PBS przed drapaniem, wykryte zamknięcie szczeliny pokazuje prawdziwą migrację komórek (ryc. 1).

Cechą charakterystyczną wszystkich metod jest potrzeba systemu do analizy procesu migracji¹⁷. Powszechną i niedrogą metodą analizy postępów jest użycie mikroskopu pola świetlnego do wykonania zdjęć rysy w określonych punktach czasowych, a następnie analiza zamknięcia luki w obrazie software^18,19. Ta metoda jest czasochłonna, zawodna w robieniu zdjęć w tym samym miejscu i ostrości, a ruch z inkubatora do aparatu wymusza cykle zmian temperatury podczas robienia zdjęć. Opracowano inne metody wykrywania migracji poprzez pomiar bieżącego przepływu. Prąd zmienia się, ponieważ komórki zajmują więcej miejsca na płycie, co jest odczytywane jako wzrost impedancji²⁰. Pomiar impedancji nie ma wpływu na środowisko komórek, a zatem metoda jest uważana za nieinwazyjną. Metoda ta opiera się na specjalistycznych płytkach ze złotymi elektrodami, które są drogie, ale umożliwiają wykrycie wielu procesów, takich jak przyleganie komórek, proliferacja, migracja i śmierć komórki. Dużą wadą tej metody jest to, że pomiar impedancji nie wskazuje bezpośrednio na migrację, ponieważ czynniki takie jak temperatura mają duży wpływ na impedancję. Zmiany impedancji mogą być spowodowane kilkoma czynnikami, które nie są sprawdzane przez oprogramowanie, co utrudnia analizę danych. W związku z tym brak wizualizacji wymaga konwencjonalnego mikroskopu świetlnego do weryfikacji migracji.

Aby przezwyciężyć wiele wad dostępnych technik, używamy zautomatyzowanej kamery optycznej działającej w czasie rzeczywistym. Kamera optyczna to system detekcji z mikroskopem o wysokiej przepustowości umieszczonym na małej platformie z obiektywem, jednostką oświetleniową i kamerą cyfrową. Ma wbudowane oprogramowanie, które może między innymi testować migrację i proliferację. Aby wykryć migrację, stosuje się dwa algorytmy do analizy kinetyki wzrostu i migracji komórek, które nazywane są odpowiednio analizą proliferacji i gojenia się ran. Analiza proliferacji opiera się na dwuetapowym algorytmie segmentacji obrazu, który stosuje analizę tekstury w celu wykrycia różnicy między obszarami pokrytymi komórkami (pokazanymi na żółto) a pustymi obszarami tła za pomocą zaawansowanej analizy histogramu. Analiza gojenia się ran opiera się na trzyetapowym algorytmie, który wykrywa monowarstwę komórki, lokalizuje szczelinę rany i określa szerokość szczeliny. Te kroki są wykonywane w punktach czasowych określonych przez użytkownika, a dane są prezentowane jako pokryty obszar, szerokość przerwy i obszar przerwy. Jedną z wielkich zalet tego urządzenia jest to, że umożliwia obrazowanie przylegających komórek przez ciecz ze względu na kąt nachylenia kamery²¹. Obiektyw aparatu wykonuje obrazy pod kątem, które są rzutowane na stos z pojedynczej płaszczyzny z generowane, aby upewnić się, że zdjęcia są ostre (ilustracja 2). Stosy Z są generowane poprzez scalenie serii zdjęć (np. 40) wykonanych prostopadle do krawędzi rany i w poprzek całej rany. Z-stacks umożliwia uchwycenie głębokości warstwy komórek, a także płaszczyzny ostrości w poprzek rany. Co więcej, serie obrazów można połączyć w kolekcję obrazów wideo za pomocą jednego kliknięcia przycisku.

Demonstrujemy zoptymalizowany protokół wykrywania migracji w linii komórkowej keratynocytów HaCaT. Przetestowaliśmy laktoferynę i jej N-końcowy peptyd, laktoferrycynę, pochodzące od ludzi i krów, aby przeanalizować ich wpływ na migrację, ponieważ wykazano, że cząsteczki te mają liczne zastosowania jako cząsteczki przeciwbakteryjne i modulujące odporność^22,23. Cztery związki porównano z nieleczonymi komórkami HaCaT, a jako kontrolę pozytywną zastosowano naskórkowy czynnik wzrostu (EGF).

Protocol

Eksperymentalny układ nie ma żadnych ograniczeń etycznych i prawnych i został przeprowadzony w porozumieniu z Uniwersytetem w Roskilde. Przegląd konfiguracji eksperymentalnej można zobaczyć na Rysunek 1, a mechanizmy kamery optycznej na Rysunek 2.

1. Przygotowanie

1. Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym stole laminarnym, czyszcząc stół i wszystkie urządzenia 70% etanolem przed rozpoczęciem eksperymentu.
2. Umieść kamerę optyczną w konwencjonalnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 ,} aby zapewnić optymalne warunki dla komórek.
3. Hoduj komórki HaCaT w pożywce DMEM z 10% FBS i 1x antybiotykami (penicyliną i streptomycyną) w kolbie T75.
4. Użyj 1 ml 1x trypsyny, aby oderwać komórki i hodować je co 3-4 dni, rozpraszając je w warstwie komórkowej. Przed użyciem podgrzej do temperatury pokojowej.

2. Generowanie monowarstwy komórek HaCaT w 48-dołkowej płytce mikromiareczkowej

1. Usunąć pożywkę z kolby T75 za pomocą pipety Pasteura.
2. Przemyć przylegające komórki w kolbie, dodając 5 ml 1x sterylny PBS do kolby T75.
   nuta: Upewnij się, że PBS jest wolny od wapnia i magnezu.
3. Rozprowadzić PBS w obiegu i usunąć go pipetą Pasteura.
4. Powtórz kroki 2.2-2.3.
5. Dodaj 1 ml 1x trypsyny do kolby i rozprowadź ją w warstwie komórek.
6. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C w konwencjonalnym inkubatorze aż do odłączenia komórek (5-8 minut jest wystarczające dla większości linii komórkowych).
7. View pod mikroskopem, jeśli komórki są odłączone. Po odłączeniu komórek dodaj 9 ml zwykłej pożywki hodowlanej z 10% FBS, aby dezaktywować 1x trypsynę.
8. Policz komórkę za pomocą hemocytometru, licznika redlic lub podobnego.
   nuta: Błękit trypanowy może być używany do przeglądania martwych komórek. Jednak w 1x trypsyny komórki HaCaT są idealnie okrągłe, gdy żyją.
9. Przenieś 7,5 x 10⁴ komórek/basenik w 250 μl 10% pożywki FBS na okrągłodenną 48-dołkową płytkę do hodowli tkankowej (płytka standardowa).
   Uwaga: Test można również ustawić na płytkach 6-, 12-, 24- lub 96-dołkowych, które można oznaczyć pod mikroskopem optymalnym.
10. Delikatnie przesuwaj płytkę z boku na bok, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzienkach, w przeciwnym razie komórki zgromadzą się w środku dołków. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że komórka jest równomiernie rozłożona w pożywce
11. Umieścić płytkę w konwencjonalnym inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C przez noc lub do momentu, gdy komórki przylgną do dna studzienek.

3. Dodawanie bodźców dla efektów migracji

1. Sprawdź, czy studzienki są zlewające się w 90-95% pod mikroskopem świetlnym.
2. Przygotować 10 μg/ml mitomycyny C w odpowiedniej ilości pożywki.
   nuta: W tym badaniu mitomycynę C utrzymuje się w temperaturze 4 °C w roztworze podstawowym w sstężeniu 1 mg/ml. Mitomicyna C w roztworze może być przechowywana do tygodnia w ciemności w temperaturze 2-8 °C.
3. Usuń zużytą pożywkę za pomocą pipety Pasteura z każdej studzienki.
4. Dodać 250 μl 5 μg/ml mitomycyny C do każdego dołka.
5. Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
6. Przygotuj bodźce peptydów, rozcieńczając je w odpowiedniej ilości pożywki.
   nuta: W tym badaniu zarówno ludzka, jak i bydlęca laktoferyna i laktoferrycyna były testowane w stężeniu 25 μg/ml w objętości 250 μl
7. Usunąć pożywkę z mitomycyną C za pomocą pipety Pasteura.
8. Przemyć studzienki 1x 250 μl 1x PBS (temperatura pokojowa) i usunąć płukanie pipetą Pasteura.
9. Dodaj 250 μl 1x PBS i ręcznie zdrap studzienki pionowo za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Do każdego dołka należy użyć nowej końcówki do pipety.
10. Usuń PBS i dodaj 250 μl bodźców peptydowych.
11. Zamontuj płytkę w systemie kamery optycznej, regulując po obu stronach płyty. Pozostaw pokrywkę na płytce do mikromiareczkowania.
    nuta: W razie potrzeby kamera może pracować z otwartą pokrywą.

4. Konfiguracja programu dla kamery optycznej na komputerze

1. Kliknij przycisk Pobierz na pasku zadań po lewej stronie.
2. Wybierz funkcję Gojenie ran na pasku zadań po lewej stronie.
3. Wybierz typ blachy, klikając poniżej ilustracji Blacha.
4. Odznacz nieużywane studnie, zaznaczając je i klikając Włącz w lewym górnym rogu ekranu.
   nuta: Wszystkie studnie są zaznaczone domyślnie.
5. Dostosuj ostrość soczewki na studzienkach, aby dopasować ją do położenia komórek, klikając prawym przyciskiem myszy jedną z studzienek.
   nuta: Autofokus można również regulować ręcznie, przesuwając pasek w prawo od ilustracji na płycie.
6. Ustaw przedział czasu dla obrazów w obszarze Interwał zdjęć (np. (00:30:00)).
7. Ustaw liczbę powtórzeń tak, aby pasowała do żądanego okresu (np. 97 powtórzeń).
8. Rozpocznij bieg, klikając przycisk Start w prawym dolnym rogu.

Results

HaCaT to linia komórkowa keratynocytów, jeden z najliczniejszych typów komórek w skórze. Kiedy pojawia się rana, komórki skóry zaczynają się namnażać i migrować do łożyska rany, aby zamknąć ranę (Ryc. 3). Oba procesy mają zatem ogromne znaczenie dla prawidłowego gojenia.

Kamera optyczna może śledzić oba procesy w czasie rzeczywistym. W przypadku migracji system podaje trzy zestawy danych: obszar pokry...

Discussion

Znaczenie migracji w badaniach nad rozwojem, gojeniem się ran, immunologią i rakiem doprowadziło do powstania kilku różnych metod badania migracji. Migracja może być wyrazem ekspansji lub zamykania luki przez komórki. Najczęściej testowane jest zamknięcie rysy, ponieważ łatwiej jest wyhodować komórki w monowarstwie, a następnie zrobić rysę, niż wyhodować komórki w określonej formie⁸. Nasze badanie pokazuje zoptymalizowaną metodę ręcznego drapania, ponieważ technika ta jest łatwa do opanowania i ta...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
oCelloScope	BioSense Solution ApS Kamera		optyczna
Oprogramowanie UniExplorer	BioSense Solution ApS		(8.0.0.7144 (RL3))Komórka
		HaCaT	Przekazana ze Szpitala Bispebjerg
DMEM (1x) + GlutaMAX	Gibco	31966-021	Pożywka dla HaCaT
FBS	Gibco	10270	Płodowa surowica bydlęca
PBS	Gibco	D837	Bez Mg+ i Ca2+
Pencillin-Streptomycyna	Sigma	P0781	Antybiotyki
Trypsyna (10x)	Sigma	T3924
Mitomycyna C	Tocris	3258	Hamuje proliferację
Płytka mikromiareczkowa	Greiner Bio-one	677 180
Inkubator	Panasonic		37° C, 5% CO2
Hemocytometr	wspomagający		Tü rk (0,1 mm)
Chłopiec do pipet	Accu-Jet pro