Tutaj opisujemy procedurę testowania migracji komórek in vitro za pomocą automatycznego mikroskopu optycznego. Test zarysowania jest szeroko stosowany, w którym zamknięcie rysy następuje przez określony czas. Mikroskop optyczny umożliwia niezawodne i tanie wykrywanie migracji komórek.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zoptymalizowany test zarysowań do testowania migracji komórek in vitro za pomocą zautomatyzowanej kamery optycznej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Migracja komórek jest ważnym procesem, który wpływa na wiele aspektów zdrowia, takich jak gojenie się ran i rak, dlatego jest kluczowy dla rozwoju metod badania migracji. Test zarysowania od dawna jest najpowszechniejszą metodą in vitro do badania związków o właściwościach anty- i promigracyjnych ze względu na niski koszt i prostą procedurę. Jednak często zgłaszanym problemem testu jest nagromadzenie komórek na krawędzi rysy. Ponadto, aby uzyskać dane z testu, należy wykonać obrazy o różnym narażeniu w okresie czasu dokładnie w tym samym miejscu, aby porównać ruchy migracji. Do opisania zarysowania można użyć różnych programów analitycznych, ale są one pracochłonne, niedokładne i wymuszają cykle zmian temperatury. W tym badaniu demonstrujemy zoptymalizowaną metodę badania efektu migracji, np. z naturalnie występującymi białkami laktoferyną ludzką i bydlęcą oraz ich N-końcowym peptydem laktoferrycyną na linii komórek nabłonkowych HaCaT. Kluczową optymalizacją jest mycie i drapanie w PBS, co eliminuje wspomniane wcześniej gromadzenie się komórek wzdłuż krawędzi. Można to wytłumaczyć usunięciem kationów, które, jak wykazano, mają wpływ na połączenie komórka-komórka keratynocytu. Aby zapewnić dokładne wykrywanie migracji, do protokołu dodano wstępne leczenie mitomycyną C, inhibitorem syntezy DNA. Na koniec demonstrujemy zautomatyzowaną kamerę optyczną, która eliminuje nadmierne cykle temperaturowe, pracę ręczną z analizą zarysowań, jednocześnie poprawiając odtwarzalność i zapewniając analizę identycznych odcinków zadrapania w czasie.
Wprowadzenie
Migracja to ważny proces, który wpływa na kilka aspektów fizjologicznych. W procesie gojenia się ran migracja ułatwia ponowną epitelizację skóry. W niegojących się ranach, takich jak rany przewlekłe, bakterie oportunistyczne powodują zakażenie rany, a otwarte rany są idealne do rozwoju bakterii i tworzenia biofilmu1,2. Biofilm jest jedną z przyczyn rozwoju opornych bakterii, które są jednym z największych zagrożeń dla naszego współczesnego społeczeństwa3. Podczas gojenia się ran komórki odpornościowe nie mogą przeniknąć do biofilmu. W przypadku nowotworów migracja komórek nowotworowych ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymentalny układ nie ma żadnych ograniczeń etycznych i prawnych i został przeprowadzony w porozumieniu z Uniwersytetem w Roskilde. Przegląd konfiguracji eksperymentalnej można zobaczyć na Rysunek 1, a mechanizmy kamery optycznej na Rysunek 2.
1. Przygotowanie
- Wykonaj wszystkie kroki w sterylnym stole laminarnym, czyszcząc stół i wszystkie urządzenia 70% etanolem przed rozpoczęciem eksperymentu.
- Umieść kamerę optyczną w konwencjonalnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby zapewnić optymalne warunki dla komórek.
- Hoduj komórki....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
HaCaT to linia komórkowa keratynocytów, jednego z najliczniejszych typów komórek w skórze. W przypadku powstania rany komórki skóry zaczynają proliferować i migrować w stronę łoża rany, aby ją zamknąć (Rysunek 3). Oba te procesy są zatem niezwykle istotne dla prawidłowego gojenia.
Kamera optyczna pozwala na śledzenie obu procesów w czasie rzeczywistym. W przypadku migracji system dostarcza trzy zest.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Znaczenie migracji w badaniach nad rozwojem, gojeniem się ran, immunologią i rakiem doprowadziło do powstania kilku różnych metod badania migracji. Migracja może być wyrazem ekspansji lub zamykania luki przez komórki. Najczęściej testowane jest zamknięcie rysy, ponieważ łatwiej jest wyhodować komórki w monowarstwie, a następnie zrobić rysę, niż wyhodować komórki w określonej formie8. Nasze badanie pokazuje zoptymalizowaną metodę ręcznego drapania, ponieważ technika ta jest łatwa do opanowania i ta.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Duńska Rada ds. Niezależnych Badań, Technologii i Produkcji, grant #4005-00029
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| oCelloScope | BioSense Solution ApS Kamera | optyczna | |
| Oprogramowanie UniExplorer | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3))Komórka | |
| HaCaT | Przekazana ze Szpitala Bispebjerg | ||
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Pożywka dla HaCaT |
| FBS | Gibco | 10270 | Płodowa surowica bydlęca |
| PBS | Gibco | D837 | Bez Mg+ i Ca2+ |
| Pencillin-Streptomycyna | Sigma | P0781 | Antybiotyki |
| Trypsyna (10x) | Sigma | T3924 | |
| Mitomycyna C | Tocris | 3258 | Hamuje proliferację |
| Płytka mikromiareczkowa | Greiner Bio-one | 677 180 | |
| Inkubator | Panasonic | 37° C, 5% CO2 | |
| Hemocytometr | wspomagający | Tü rk (0,1 mm) | |
| Chłopiec do pipet | Accu-Jet pro |
Bibliografia
- Frykberg, R. G., Banks, J. Challenges in the Treatment of Chronic Wounds. Advances in wound care. 4 (9), 560-582 (2015).
- da Silva, L., Carvalho, E., Cruz, M. T. Role of neuropeptides in skin inflammation and its involvement in diabetic wound healing.....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
