Tutaj opisana jest metoda izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Protokół ten ma wyraźną zaletę polegającą na wytwarzaniu wzbogaconych próbek mikronaczyń o akceptowalnej wydajności białka od poszczególnych zwierząt. Próbki można następnie wykorzystać do solidnych analiz białek w śródbłonku mikronaczyniowym mózgu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Bariera krew-mózg (BBB) to dynamiczna tkanka barierowa, która reaguje na różne bodźce patofizjologiczne i farmakologiczne. Takie zmiany wynikające z tych bodźców mogą znacznie modulować dostarczanie leków do mózgu, a co za tym idzie, powodować znaczne wyzwania w leczeniu chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Wiele zmian bariery krew-mózg, które wpływają na farmakoterapię, dotyczy białek, które są zlokalizowane i ulegają ekspresji na poziomie komórek śródbłonka. Rzeczywiście, taka wiedza na temat fizjologii BBB w zdrowiu i chorobie wzbudziła znaczne zainteresowanie badaniami nad tymi białkami błonowymi. Z punktu widzenia badań podstawowych oznacza to zapotrzebowanie na prostą, ale solidną i powtarzalną metodę izolacji mikronaczyń krwionośnych z tkanki mózgowej pobranej od zwierząt doświadczalnych. W celu przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń konieczne jest, aby preparaty próbek były wzbogacone w komórki śródbłonka, ale ograniczone w obecności innych typów komórek jednostki nerwowo-naczyniowej (tj. astrocytów, mikrogleju, neuronów, perycytów). Dodatkową korzyścią jest możliwość przygotowania próbek od pojedynczych zwierząt w celu uchwycenia prawdziwej zmienności ekspresji białek w populacji eksperymentalnej. W tym manuskrypcie przedstawiono szczegółowe informacje dotyczące metody stosowanej do izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Wzbogacanie mikronaczyń z otrzymanych próbek uzyskuje się poprzez zastosowanie czterech etapów wirowania, w których dekstran jest zawarty w buforze próbki. Protokół ten może być łatwo dostosowany przez inne laboratoria do ich własnych specyficznych zastosowań. Wykazano, że próbki wygenerowane za pomocą tego protokołu dostarczają solidnych danych eksperymentalnych z eksperymentów analizy białek, które mogą znacznie pomóc w zrozumieniu odpowiedzi BBB na bodźce fizjologiczne, patofizjologiczne i farmakologiczne.
Wprowadzenie
Bariera krew-mózg (BBB) istnieje na styku ośrodkowego układu nerwowego (OUN) z krążeniem ogólnoustrojowym i odgrywa istotną rolę w utrzymaniu homeostazy mózgu. W szczególności bariera krew-mózg działa w celu precyzyjnego kontrolowania stężeń substancji rozpuszczonych w płynie zewnątrzkomórkowym mózgu i skutecznego dostarczania tych składników odżywczych, które są wymagane przez tkankę mózgową do zaspokojenia znacznych wymagań metabolicznych klasy CNS1. Role te oznaczają, że bariera krew-mózg, która istnieje głównie na poziomie komórki śródbłonka mikronaczyniowego, musi posiadać dyskretne mechanizmy, które umożliwiają niektórym substancjom dostęp do m....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i są zgodne z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) i Animal Research: Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE). Przebieg proceduralny protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1.
1. Przygotowanie do procedury
- Przygotuj bufor mikronaczyń mózgowych (BMB). Zacznij od zważenia 54,66 g D-mannitolu, 1,90 g EGTA i 1,46 g zasady 2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiolu (tj. Tris) do czystej zlewki. Dodaj 1,0 l wody dejonizowanej. Wymieszać składniki bufora BMB za ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przebieg eksperymentalny izolacji mikronaczyń mózgu szczura oraz przygotowania próbek błon mikronaczyniowych przedstawiono na Rysunku 1. Zastosowanie opisanej tutaj procedury pozwala na pomyślną izolację nienaruszonych mikronaczyń z mózgu szczura (Rysunek 2A). Naczynia te uzyskano po zakończeniu wirowania z dekstranem, bezpośrednio przed rozpoczęciem ultrawirowania w celu przygotowania próbek błon (tj. po zakończeniu kroku 4.10)........
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W artykule opisano prostą i skuteczną metodę przygotowania próbek białek błonowych z mikronaczyń świeżo wyizolowanych z tkanki mózgowej szczura. W literaturze opisano kilka podejść do izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i/lub wytwarzania preparatów błonowych z izolowanego mikrokrążenia 13,20,21,22,24. Chociaż opisany powyżej protokół izolacji mikronaczyń j.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health (R01-NS084941) i Arizona Biomedical Research Commission (ADHS16-162406) dla PTR. WA otrzymała wcześniejsze wsparcie w postaci nominacji przeddoktorskiej do grantu szkoleniowego National Institutes of Health (T32-HL007249).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Koktajl inhibitorów proteazy | Sigma-Aldrich | #P8340 | Składnik buforu mikronaczyń mózgowych |
| D-mannitol | Sigma-Aldrich | #M4125 | Składnik buforu mikronaczyń mózgowych |
| EGTA | Sigma-Aldrich | #E3889 | Składnik buforu mikronaczyń mózgowych |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | #T1503 | Składnik bufora mikronaczyń mózgowych |
| Dekstran (MW 75,000) | Spectrum Chemical Mftg Corp | #DE125 | Dekstran stosowany w etapach wirowania w celu oddzielenia mikronaczyń od miąższu mózgu |
| Zetamin | MWI Animal Health | #501072 | Znieczulenie ogólne |
| Ksylazyna | Western Medical Supply | #5530 | Znieczulenie ogólne |
| 0,9% roztwór soli | Western Medical Supply | N/A | Znieczulenie ogólne Rozcieńczalnik |
| Bibuła filtracyjna (średnica 12,5 cm) | VWR | #28320-100 | Służy do usuwania opon mózgowych z tkanek mózgowych |
| Probówki wirówkowe | Sarstedt | #60.540.386 | Jednorazowe probówki używane do etapów wirowania dekstranu |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Test | ThermoFisher Scientific | #23236 | Pomiar stężenia białka w preparatach membranowych |
| Wheaton Overhead Power Homogenizer | DWK Life Sciences | #903475 | Wymagany do homogenizacji próbek |
| 10,0 ml szklany moździerz i tłuczek do mielenia tkanek | DWK Life | Sciences#358039 | Wymagany do homogenizacji próbek |
| Kwas solny | Sigma-Aldrich | #H1758 | Wymagane do regulacji pH |
| Albumina surowicy bydlęcej | ThermoFisher Scientific | #23210 | Wzorzec białka do testu Bradforda |
| Standardowe kleszcze | Narzędzia Fine Science Tools | #91100-12 | Używany do preparacji tkanki mózgowej |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | #16020-14 | Używany do otwierania czaszki w celu wyizolowania mózgu |
| Stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml | ThermoFisher Scientific | #352070 | Służy do pobierania tkanki mózgowej po izolacji |
| Szklane pipety Pasteura | ThermoFisher Scientific | #13-678-20C | Służy do aspiracji resztek komórkowych po spinach dekstranu |
| Etanol, bezwodny | Sigma-Aldrich | #459836 | Służy do czyszczenia młynka do tkanek; rozcieńczony do 70% wodą |
| destylowanąProbówki do ultrawirówek | Beckman-Coulter | #41121703 | Służy do ultrawirowania próbek |
Bibliografia
- Rolfe, D. F., Brown, G. C. Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals. Physiol Rev. 77 (3), 731-758 (1997).
- Brzica, H., Abdullahi, W., Ibbotson, K., Ronaldson, P. T.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
