Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena żywotności konsorcjum bakterii syntetycznych na granicy faz gospodarz-mikroorganizm w jelitach in vitro

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57699

⸱

4 lipca 2018

 ,  , 
1Center for Microbial Ecology and Technology (CMET), Ghent University

W tym artykule

Podsumowanie

Interakcje między gospodarzem a mikroorganizmem jelitowym zostały ocenione przy użyciu nowatorskiego podejścia łączącego syntetyczną społeczność doustną, trawienie in vitro przewodu pokarmowego i model nabłonka jelita cienkiego. Przedstawiamy metodę, którą można zaadaptować do oceny inwazji komórek patogenów i biofilmów wielogatunkowych, a nawet do badania przeżywalności preparatów probiotycznych.

Streszczenie

Wzajemne oddziaływanie między gospodarzem a mikrobiotą zostało już dawno rozpoznane i obszernie opisane. Jama ustna jest podobna do innych odcinków przewodu pokarmowego, ponieważ występuje w niej mikrobiota rezydentna, która zapobiega kolonizacji przez bakterie egzogenne. Rzeczywiście, w jamie ustnej znajduje się ponad 600 gatunków bakterii, a jedna osoba może w dowolnym momencie nosić około 100 różnych. Bakterie jamy ustnej mają zdolność przylegania do różnych nisz w ekosystemie jamy ustnej, integrując się w ten sposób z zamieszkanymi społecznościami drobnoustrojów i sprzyjając wzrostowi i przetrwaniu. Sugeruje się jednak, że przepływ bakterii do jelit podczas połykania zaburza równowagę mikrobioty jelitowej. W rzeczywistości doustne podawanie P. gingivalis zmieniło skład bakteryjny mikroflory jelita krętego. Wykorzystaliśmy syntetyczną społeczność jako uproszczoną reprezentację naturalnego ekosystemu jamy ustnej, aby wyjaśnić przetrwanie i żywotność bakterii jamy ustnej poddanych symulowanym warunkom pasażu żołądkowo-jelitowego. Wybrano czternaście gatunków, poddano je procesom trawienia in vitro śliny, żołądka i jelit, a następnie przedstawiono wielokompartmentowemu modelowi komórkowemu zawierającemu komórki Caco-2 i HT29-MTX w celu symulacji nabłonka błony śluzowej jelit. Model ten posłużył do rozwikłania informacji na temat wpływu połkniętych bakterii na komórki zaangażowane w krążenie jelitowo-wątrobowe. Wykorzystanie syntetycznych zbiorowisk pozwala na kontrolę i odtwarzalność. W związku z tym metodologia ta może być dostosowana do oceny żywotności patogenu i późniejszych zmian związanych ze stanem zapalnym, zdolności kolonizacyjnej mieszanin probiotycznych, a ostatecznie potencjalnego wpływu bakterii na krążenie przedsystemowe.

Wprowadzenie

Ludzie współżyją z bakteriami, których liczba jest taka sama jak komórek ludzkich1. Dlatego tak ważne jest uzyskanie kompleksowego zrozumienia ludzkiego mikrobiomu. Jama ustna jest wyjątkowym środowiskiem, ponieważ jest podzielona na kilka mniejszych siedlisk, zawierających w ten sposób dużą różnorodność bakterii i biofilmów w tych różnych miejscach. Będąc otwartym ekosystemem, niektóre gatunki w jamie ustnej mogą być tymczasowymi gośćmi. Jednak niektóre mikroorganizmy kolonizują wkrótce po urodzeniu i tworzą zorganizowane biofilmy2. Znajdują się one na powierzchni zębów nad szczeliną dziąsłową, szczelinie poddziąsłowej, języku, powierzchniach błony śluzowej oraz protetyce i wypełnieniach dentystycznych3. Bakterie mogą być również obecne w postaci kłaczków i komórek planktonowych w świetle kanału zęba, zmieszanych z martwiczą tkanką miazgi lub zawieszonych w fazie płynnej.

Istnieje aktywna, ciągła wymiana między komórkami gospodarza a mikrobiotą rezydenta4. Bakterie komunikują się wewnątrz i między gatunkami i tylko niewielka część naturalnych kolonizatorów może przylegać do tkanek, podczas gdy inne bakterie przyczepiają się do tych pierwotnych kolonizatorów. Na przykład, wiązanie komórka-komórka między mikroorganizmami jest kluczem do integracji wtórnych kolonizatorów z biofilmami jamy ustnej i budowania złożonych sieci oddziałujących na siebie komórek mikrobiologicznych4. Około 70% agregatów bakteryjnych w próbce śliny tworzy Porphyromonas sp., Streptococcus sp., Prevotella sp., Veillonella sp. i niezidentyfikowane Bacteroidetes. F. nucleatum jest pośrednim kolonizatorem w biofilmie poddziąsłowym i agreguje się z późnymi kolonizatorami P. gingivalis, T. denticola i Tannerella forsythia, które są zaangażowane w zapalenie przyzębia5. Ponadto Streptococcus mitis zajmuje zarówno błony śluzowe, jak i zęby, podczas gdy S. sanguinis i S. gordonii preferują kolonizację zębów3. Tak więc S. sanguinis jest obecny w dolnych siekaczach i kłach, podczas gdy Actinomyces naeslundii został znaleziony w górnych przednich częściach ciała6.

Ponadto, rodzimy mikrobiom odgrywa rolę w utrzymaniu ludzkiego zdrowia2. Mikrobiota rezydentów uczestniczy w edukacji immunologicznej i zapobieganiu ekspansji patogenów. Ta odporność na kolonizację występuje, ponieważ rodzime bakterie mogą być lepiej przystosowane do przyczepiania się do powierzchni i bardziej wydajne w metabolizowaniu dostępnych składników odżywczych do wzrostu. Chociaż szczepy probiotyczne przeżywają pasaż żołądkowo-jelitowy i pozostają aktywne, trwałość bakterii autochtonicznych połykanych z górnej lokalizacji przewodu pokarmowego nie została w pełni opisana. W ten sposób poddaliśmy sztuczną społeczność, reprezentatywną dla ekosystemu jamy ustnej, symulowanym warunkom pasażu żołądkowo-jelitowego. Żywotność komórek bakteryjnych oceniano za pomocą modelu wielokompartmentowego przypominającego nabłonek jelitowy. Obecne symulatory jelit oferują odpowiednią odtwarzalność pod względem analizy społeczności mikroorganizmów luminalnych7. Jednak adhezja bakteryjna i interakcja gospodarz-mikroorganizm są omawiane oddzielnie, ponieważ połączenie linii komórkowych ze społecznościami drobnoustrojów jest trudne8. W przeciwieństwie do tego, przedstawiamy ramy, które zapewniają potencjalne mechanistyczne wyjaśnienie udanych zdarzeń kolonizacyjnych zgłaszanych na granicy jelit. Rzeczywiście, model ten może być używany wspólnie ze statycznym modelem jelitowym do oceny wpływu społeczności drobnoustrojów na sygnalizację na powierzchni gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Szczepy i warunki hodowli

UWAGA: Syntetyczna społeczność jamy ustnej składała się ze szczepów powszechnie występujących w mikrobiomie jamy ustnej3.

  1. Otrzymać następujące szczepy z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Typowych (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) i Streptococcus mitis (ATCC 49456).
  2. Zdobądź Veillonella parvula z Instytutu Leibniza DSMZ-Niemiecką Kolekcję Mikroorganizmów i Kultur Komórkowych (DSM 2007), Streptococcus sanguinis z Kolekcji Bakterii BCCM/LMG (LMG 14657) i użyj szczepu Streptococcus salivarius TOVE-R9 oraz Streptococcus oralis10.

2. Rozwój wielogatunkowej społeczności reprezentującej mikrobiom jamy ustnej

UWAGA: Wygeneruj syntetyczną społeczność, aby symulować potencjalną zdolność przylegania bakterii jamy ustnej do nabłonka jelitowego in vitro. Hoduj bakterie na płytkach z agarem z krwią uzupełnionymi 5 μg/ml heminy, 1 μg/ml menadionu i 5% sterylnej zdefibrynowanej krwi konia, jak opisano w Hernandez-Sanabria i in. (2017)11. W skrócie:

  1. Rozpuścić 100 mg heminy w 2 ml 1 M NaOH, dodać 100 ml destylowanej wody autoklawowanej. Przechowywać w ciemnym pojemniku. Wysterylizuj przez filtr 0,22 μm przed dodaniem do pożywki.
  2. Rozpuść 100 mg menadionu w 20 ml 96% etanolu. Wysterylizuj przez filtr 0,22 μm przed dodaniem do pożywki.
  3. Przygotować 1 l pożywki z agarem z krwią (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i autoklawu. Pozostaw do ostygnięcia przed dodaniem krwi końskiej i suplementów. Wymieszaj i wlej talerze.
  4. Przygotuj zmodyfikowany bulion z naparu z mózgu i serca (BHI), jak wcześniej zgłoszono12. Dodać 5 μg/ml heminy i 1 μg/ml menadionu po autoklawowaniu.
  5. Dozować 9 ml pożywki do probówek Hungate i zamknąć gumowym korkiem i aluminiową nakrętką. Przepłukać probówki roztworem N2/CO2 (90%/10%).
  6. Pobrać 1 ml pożywki beztlenowej za pomocą strzykawki i umieścić ją w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Zbierz pojedyncze kolonie każdego gatunku bakterii, ponownie zawieś w pożywce i przenieś z powrotem do beztlenowego zmodyfikowanego BHI. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, z wyjątkiem S. salivarius, który musi być inkubowany przez 24 godziny.
  7. W razie potrzeby należy potwierdzić czystość kultur przed złożeniem syntetycznego zbiorowiska. W skrócie:
    1. Ekstrahować DNA z płynnych kultur, jak w Hernandez-Sanabria et al. (2010)13 i amplifikować gen 16S rRNA za pomocą starterów 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) i 1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT) oraz następującego programu: 5 minut w temperaturze 95 °C, 30 cykli po 95 °C przez 1 min, 55 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 1,5 min, po którym następuje końcowy etap przedłużania trwający 5 minut w temperaturze 72 °C.
    2. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu handlowego (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Przeprowadzić reakcję sekwencjonowania oczyszczonych produktów w 10 μl całkowitej objętości zawierającej 0,5 μl barwnika (patrz tabela materiałów), 3,2 pmol startera M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2,0 μl 5x buforu sekwencjonującego i 20 ng matrycy, używając komercyjnego systemu sekwencjonowania z zestawem (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Zlecaliśmy wykonanie tego zabiegu komercyjnie.
    4. Przeprowadź wyszukiwanie BLAST we wszystkich sekwencjach (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), aby określić najbliższy znany takson i porównaj go z sekwencją oryginalnego szczepu za pomocą narzędzia online RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/) i usługi SINA Alignment (https://www.arb-silva.de/aligner/).
  8. Zmierz liczbę komórek pod koniec inkubacji, używając cytometrii przepływowej i barwienia SYBR Green/Propidium jodku, jak opisano w Hernandez-Sanabria et al. (2017)11. Rozcieńczyć kultury do 105 komórek mL-1, używając zmodyfikowanego BHI.
  9. Dodać 1 ml S. mitis do 75 ml beztlenowego BHI i inkubować do fazy stacjonarnej (6 godzin). Następnie zbierz 0,75 ml każdego rozcieńczonego szczepu i wymieszaj w warunkach beztlenowych.
  10. Gdy wszystkie kultury zostaną wymieszane, weź 1 ml mikrokosmosu i dodaj do 75 ml BHI. Inkubować zbiorowisko syntetyczne w temperaturze poniżej 10% CO2, 10 % H2, 80 % N2 przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 200 obr./min (patrz tabela materiałów).
  11. Zmierz gęstość komórek, jak w 2.8. przed przedstawieniem społeczności modelowi komórkowemu. Skład społeczności można ocenić za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, przy użyciu starterów i temperatur wyżarzania w tabeli 1 Slomka et al. (2017)10. Ponadto użyj sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA, aby uzyskać informacje o obecnych początkowych członkach13,14. W przypadku obu protokołów potwierdzania tożsamości użyj cDNA jako matrycy, aby wskazać bakterie aktywnie transkrybujące białka, i użyj DNA jako matrycy, aby ujawnić obecność/brak szczepów.

3. Ogólne praktyki hodowli komórkowej

UWAGA: Aby zapoznać się z ogólnymi aspektami hodowli komórkowej, autorzy odsyłają do Master and Stacey (2007)15. Pozyskanie linii komórkowych wykorzystywanych z Europejskiego Zbioru Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych (Caco-2 ECACC 86010202 i HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, Public Health England, Wielka Brytania). Można zakupić odczynniki do hodowli komórkowych (patrz tabela materiałów), chyba że określono inaczej.

  1. Utrzymanie i pasażowanie linii komórkowych Caco-2 i HT29-MTX
    UWAGA: Komórki Caco-2 i HT29-MTX są rutynowo hodowane w kolbach do hodowli tkankowych o średnicy 25cm2 zawierających uzupełnioną pożywkę DMEM (Tabela 1). Komórki są trypsynizowane po osiągnięciu 60–70% zbiegu.
    1. Wyjąć pożywkę do hodowli komórkowych z kolb. Przemyć dwukrotnie 5 ml PBS bez Ca++/Mg++.
    2. Dodać 2 ml roztworu trypsyny o stężeniu 0,5 mg/l i 0,22 g/l kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Rozprowadzić roztwór trypsyny, delikatnie przesuwając kolbę. Usunąć 1,5 ml roztworu trypsyny i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    3. Sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki są oderwane od powierzchni kolby. W razie potrzeby inkubować przez dodatkowe 5 minut.
    4. Dodać 5 ml uzupełnionej pożywki do hodowli komórkowej do kolby w celu dezaktywacji trypsyny. Pipetować w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową.
    5. Natychmiast pobrać 50 μl podwielokrotności zawiesiny komórek i wymieszać ze sterylnym 0,4% roztworem błękitu trypanowego w proporcji 1:1 (v/v) dla komórek Caco-2 lub 1:5 v/v dla HT29-MTX. Wymieszać za pomocą pipetowania i załadować do komory zliczającej (patrz tabela materiałów).
    6. Policz żywe komórki (białe, jasne komórki) pod mikroskopem (patrz instrukcje producenta).
    7. Wysiew w nowej kolbie o gęstości 4 x 105 komórek/cm2 i 1 x 104 komórek/cm2, odpowiednio dla Caco-2 i HT29-MTX.
      UWAGA: (1) Komórki Caco-2 różnicują się i tworzą ścisłe połączenia po osiągnięciu zbiegu. Niezwykle ważne jest, aby przed trypsynizacją unikać nadmiernej konfluencji. Przerost komórek w kolbie może spowodować niepowodzenie w odwarstwianiu komórek po trypsynizacji i/lub grudkach komórek. (2) Komórki HT29-MTX są komórkami wytwarzającymi śluz o wysokiej aktywności metabolicznej16. Cechy te mogą powodować szybkie zakwaszenie pożywki do hodowli komórkowych, zwłaszcza jeśli komórki mają dużą gęstość. Bufor HEPES można dodać do pożywki do hodowli komórkowej (Tabela 1) w celu utrzymania pH między 7 a 7,2. Jeśli pH spadnie, pożywkę można wymienić, gdy konfluencja jest mniejsza niż 50%. Jeśli jednak konfluencja >50%, kultura komórkowa musi zostać podzielona.

4. Montaż wielokompartmentowego modelu komórkowego symulującego interfejs gospodarz-mikrob jelitowy

UWAGA: Zakończ kokulturę w studzienkach dwukomorowych (średnica 24 mm, wielkość porów 0,4 μm; zobacz Tabelę Materiałów).

  1. Dodać 1,5 ml kompletnej pożywki do hodowli komórkowej do komory wierzchołkowej i 2 ml do podstawy. Wstępną inkubację należy wykonywać przez 20–30 minut, aby uzyskać równomierne rozprowadzenie zawiesiny komórek podczas siewu.
  2. Trypsynizować hodowlę komórkową Caco-2 i HT29-MTX, jak opisano w punkcie 3. Procedura trypsynizacji musi być dokładnie przestrzegana, aby uzyskać jednorodny rozkład obu linii komórkowych, w zawiesinie pojedynczej komórki, bez grudek.
  3. Policz żywotne komórki zgodnie z opisem w ppkt 3.1.8.
  4. Dostosuj gęstość komórek do 6,5 x 104 komórek/cm2 w proporcji 90/10 komórek Caco-2 / HT29-MTX.
  5. Homogenizować zawiesiny komórkowe i dodać odpowiednią objętość komórek Caco-2 i HT29-MTX do wstępnie napełnionego sterylnego pojemnika z uzupełnioną pożywką do hodowli komórkowych. Usunąć wstępnie inkubowaną pożywkę z wierzchołkowej strony komory przez aspirację.
  6. Delikatnie wymieszać zawiesinę komórek przez pipetowanie i przenieść 1,5 ml do komory wierzchołkowej wkładów komory. Procedura wysiewu wymaga stałej homogenizacji zawiesiny komórkowej, ponieważ komórki mają tendencję do osadzania się. W zależności od doświadczenia użytkownika i prędkości roboczej, zawiesinę komórek należy wymieszać po dozowaniu 1–3 dołków.
  7. Delikatnie przesuwaj płytki do tyłu i do przodu, a następnie od prawej do lewej do prawej (5-10 razy), aby uzyskać równomierne rozłożenie komórek w studzience. Przenieś do inkubatora i powtórz ruch płytek.
  8. Utrzymuj kokulturę komórek Caco-2 / HT29-MTX przez 15 dni, odświeżając przedziały wierzchołkowe i podstawne co 2 dni za pomocą uzupełnionego DMEM. Po tym czasie pożywkę do hodowli komórkowych można zmienić na uzupełniony DMEM bez roztworu antybiotykowego/przeciwgrzybiczego.
  9. Utrzymuj system do 20–21 dni po wysiewie, odświeżając podłoże co 2 dni.
  10. Przed rozpoczęciem testu należy zmierzyć integralność bariery nabłonkowej za pomocą systemu oporu elektrycznego (patrz tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Upewnij się, że sprzęt TEER jest w pełni naładowany (>24 h) przed rozpoczęciem pomiarów.
    2. Odłącz sprzęt TEER od zasilania i przykryj plastikową torbą do autoklawu. Zrób otwór w torbie, aby wprowadzić elektrodę i podłącz do portu wejściowego w mierniku. Spryskać 70% etanolem/wodą (v/v) przed wprowadzeniem urządzenia TEER do komory przepływowej.
    3. Aby zdezynfekować elektrodę, zanurz końcówki elektrod w 70% roztworze etanolu/wody (v/v) na 15 minut. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na 15 s. Przepłucz elektrodę we wstępnie podgrzanej pożywce do hodowli komórkowych.
    4. Wyjmij komórki z inkubatora i pozwól komórkom osiągnąć temperaturę pokojową wewnątrz komory przepływowej.
    5. Upewnij się, że miernik jest odłączony od ładowarki. Ustaw przełącznik trybu w pozycji Ohm i włącz przełącznik zasilania.
    6. Zmierz rezystancję ogniwa, zanurzając elektrodę krótszą końcówką we wkładce, a dłuższą końcówką wyjmując ją ze studzienki. Trzymaj elektrodę pod kątem 90° do wkładki płytki.

5. Przeżywalność bakterii po warunkach pasażu pokarmowego in vitro

UWAGA: Przygotuj symulowane płyny trawienne zgodnie z protokołem Minekus et al. (2014)17, z modyfikacjami opisanymi poniżej. Przygotuj wszystkie rozcieńczenia ultraczystą wodą. Przefiltruj i wysterylizuj wszystkie roztwory przez filtr 0,22 μm i przeprowadź procedurę trawienia w sterylnych warunkach.

  1. Trawienie doustne:
    1. Umieścić 3 ml społeczności bakteryjnej w sterylnej probówce o pojemności 50 ml, wymieszać z 3 ml symulowanego płynu ślinowego (SSF), zawierającego (w mmol L-1): KCl, 15,1; KH2PO4, 3.7; NaHCO3, 6.8; MgCl2(H2O)6,5, (NH4) CO3, 0,06; HCl, 1,1; CaCl2(H2O)2, 0,75. Dodać 75 U/ml α-amylazy z ludzkiej śliny typu IX-A i 2 g/l mucyny z żołądka świni typu II do SSF.
    2. Inkubować mieszaninę przez 2 minuty, w temperaturze 37 °C i przy 100 obr./min. Pobrać próbkę o objętości 2 ml do ekstrakcji DNA i kwantyfikacji metodą cytometrii przepływowej (S1).
  2. Trawienie żołądka:
    1. Dodać 4 ml symulowanego płynu żołądkowego (SGF), zawierającego (w mmol L-1): KCl, 6,9; KH2PO4, 0,9; NaHCO3, 25; NaCl, 47,2; MgCl2(H2O)6,1, (NH4) CO3, 0,5; HCl, 15,6; CaCl2(H2O)2, 0,075. Ponadto SGF zawierał 2 g/l mucyny z żołądka świni typu II.
    2. Zmierz pH i w razie potrzeby dostosuj do pH 3 za pomocą 1 M HCl. Inkubować w temperaturze 37 °C i przy 100 obr./min. Pobrać próbkę o objętości 2 ml (S2).
  3. Trawienie w jelicie cienkim:
    1. Dodać 4 ml symulowanego płynu jelitowego (SIF) zawierającego (w mmol L-1): KCl, 6,8; KH2PO4, 0,8; NaHCO3, 85; NaCl, 38,4; MgCl2(H2O)6,33; HCl, 8,4; CaCl2(H2O)2,3; do rurki wytrawiającej.
    2. W razie potrzeby dostosować do pH 7 za pomocą 1 M NaOH. Inkubować w temperaturze 37 °C i przy 100 obr./min. Pobrać próbkę o objętości 2 ml (S3).

6. Zdolność do kolonizacji bakteryjnej po warunkach pasażu pokarmowego in vitro

  1. Odwirować 2 ml roztworu do trawienia jelita cienkiego przez 10 minut w stężeniu 2 650 x g.
  2. Usunąć supernatant i wymieszać osad bakteryjny z 5 ml uzupełnionego DMEM bez antybiotyku i środków przeciwgrzybiczych.
  3. Wybarwić i określić ilościowo nienaruszone/uszkodzone komórki za pomocą cytometru przepływowego (patrz tabela materiałów), zgodnie z opisem Hernandeza-Sanabrii i in. (2017)11.
  4. Dostosuj gęstość komórek do 105 żywotnych komórek/ml, rozcieńczając w uzupełnionym DMEM bez antybiotyku i środków przeciwgrzybiczych.
  5. Usunąć wierzchołkową pożywkę z systemu transwell i dodać 1,5 ml zawiesiny bakteryjnej. Współhodowla systemu przez 2 godziny w ogólnych warunkach hodowli komórkowej (37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2 ).
    UWAGA: Czas ten może zostać wydłużony do 48 godzin, w zależności od wymaganego protokołu eksperymentalnego. Kokultura może być utrzymywana w innym inkubatorze niż ten, który jest używany do rutynowej konserwacji komórek, aby uniknąć zanieczyszczeń.
  6. Zmierzyć wartości TEER po inkubacji, aby ocenić integralność bariery nabłonkowej, jak opisano w ppkt 4.11.
  7. Po zakończeniu czasu inkubacji należy usunąć pożywkę wierzchołkową i zebrać 0,5 ml do dalszych analiz (S4). Podpróbkę pożywki można wykorzystać do oceny żywotności komórek za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) (patrz tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
  8. Dodać 0,5 ml 10 mM N-acetylocysteiny do HBSS (bufor NAC), aby rozpuścić śluz wytwarzany przez HT29-MTX i odzyskać przylegające bakterie. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, pod wpływem mieszania (135 obr./min, patrz tabela materiałów).
  9. Odzyskać NAC-HBSS w probówce do mikrowirówki (S5) i przemyć dwukrotnie komórki 1 ml DPBS.
  10. Dodać 0,5 ml 0,5% Triton X-100 (w/v) na wierzch monowarstw, rozbić komórki przez pipetowanie, odzyskać płyn i wirować przez 1 minutę. Szybkość ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć uszkodzenia komórek bakteryjnych przez detergent.
  11. Odwirować komórki przez 5 minut przy 2,650 x g i oddzielić supernatant (S6) i osad (S7).

7. Przykładowa analiza

UWAGA: Analizuj pobrane próbki (S1-S7), aby ocenić żywotność bakterii i potencjał adhezji do komórek jelitowych, po symulowanym trawieniu przewodu pokarmowego.

  1. Żywotność bakterii: Próbki S1-S5 należy przepuścić dwukrotnie przez 0,45 μm i określić ilościowo komórki bakteryjne za pomocą barwienia żywych/martwych komórek i cytometrii przepływowej, jak wskazano w kroku 2.811.
  2. Potencjał adhezyjny: Przygotować seryjne rozcieńczenia (od -1 do -8) dla S1-S6 i rozprowadzić 10 μl w agarze z krwią i zmodyfikowanych płytkach BHI. Inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych przez 24–48 godzin. Pokryć tę samą objętość nierozcieńczonego S7.
    1. Identyfikacja taksonomiczna bakterii przylegających:
      1. Wybierz poszczególne kolonie za pomocą pętli hodowlanej i ponownie zawieś każdą z nich na 10 μl wody wolnej od nukleaz. Zebrać 4 μl tej zawiesiny i użyć jej jako matrycy do amplifikacji PCR genu 16S rRNA przy użyciu starterów i warunków opisanych w 2.7.1.
      2. Przeprowadzić sekwencjonowanie zgodnie z protokołem w ppkt 2.7.3 i walidację sekwencji przy użyciu procedury zawartej w ppkt 2.7.4.
  3. Wykonuj dalsze analizy, takie jak ekstrakcja całkowitego DNA, kwantyfikacja qPCR i/lub sekwencjonowanie amplikonów 16S rRNA, ekstrakcja RNA i profilowanie transkryptomiczne zgodnie z potrzebami.
    UWAGA: Kwantyfikację cytometrii przepływowej przeprowadzono natychmiast po pobraniu próbki. Jako kontrolę dla komórek przepuszczalnych błoną użyto próbki wystawionej na działanie temperatury 70 °C przez 3 minuty. Szum tła oceniano, mierząc za pomocą cytometrii przepływowej płyny trawiące lub próbki uzyskane z modelu hodowli komórkowej bez bakterii. Każda próbka została zmierzona w trzech egzemplarzach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy protokół prowadzi do stworzenia modelu odpowiedniego do wyjaśnienia przeżywalności i żywotności bakterii jamy ustnej poddanych symulowanym warunkom przejścia przez przewód pokarmowy. Liczba nienaruszonych komórek poszczególnych szczepów wynosi około 108 komórek mL-1 przed utworzeniem syntetycznej społeczności, natomiast wielogatunkowy mikrokosmos zawierał ponad 90% żywych komórek podczas tworzenia społeczności (Rycina 1A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Mikrobiom jamy ustnej jest kluczowym elementem zdrowia człowieka, o czym niedawno poinformowało kilku autorów20,21. Wcześniejsze odkrycia sugerują, że spożycie śliny zawierającej duże ilości bakterii może wpływać na ekosystem mikrobiologiczny jelita cienkiego, które jest jednym z głównych miejsc pobudzania odpornościowego. Połączenie statycznego modelu trawienia górnego odcinka przewodu pokarmowego z interfejsem gospodarza reprezentowanym przez komórki nabłonka j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od Flanders Research Foundation dla Marty Calatayud Arroyo (stypendium podoktorskie FWO-12N2815N). Emma Hernandez-Sanabria jest adiunktem wspieranym przez Flandryjski Urząd ds. Innowacji i Przedsiębiorczości (Agentschap voor Innovatie door Wetenschap en Technologie, IWT).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
STRAINS
Aggregatibacter actinomycetemcomitans American Type Culture CollectionATCC 43718
Fusobacterium nucleatum American Type CultureCollection ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis American Type Culture KolekcjaATCC 33277
Prevotella intermedia Kolekcja kultur typu amerykańskiegoATCC 25611
Streptococcus mutans Kolekcja kultur typu amerykańskiegoATCC 25175
Streptococcus sobrinus Kolekcja kultur typu amerykańskiegoATCC 33478
Actinomyces Kolekcja kultur typu viscosus American ATCC15987
Streptococcus salivarius  TOVE-R
Streptococcus mitis American Type Culture CollectionATCC 49456
Streptococcus sanguinis BCCM/LMG Bacteria CollectionLMG 14657
Veillonella parvula Instytut Leibniza DSMZ-Niemiecka kolekcja mikroorganizmów i kultur komórkowychDSM 2007
Streptococcus gordonii Kolekcja kultur typu amerykańskiegoATCC 49818
CELL LINES
Caco-2cells Europejska Kolekcja Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych86010202
Komórki HT29-MTXEuropejska Kolekcja Uwierzytelnionych Kultur Komórkowych12040401
ODCZYNNIKI I MATERIAŁY EKSPLOATACYJNE
Brain Heart Infusion (BHI) bulionOxoidCM1135
Agar do krwi 2OxoidCM0055Agar do krwi
MenadioneSigmaM9429
HeminSigmaH9039
5% sterylna defibrynowana krew końskaE& O LaboratoriesLtd,P030
Zestaw InnuPREP PCRpureAnalytik Jena845-KS-5010250Zestaw do oczyszczania PCR
Big DyeApplied Biosystems4337454Barwnik do sekwencjonowania do sekwencjonowania
ABI Prism BigDye Terminator v3.1 zestaw do sekwencjonowania cykluApplied Biosystems4337456
SYBR  Green IInvitrogenS7585
Jodek propidiumKolby hodowlane InvitrogenP1304MP
T25 niepowlekane, poddane działaniu kultur komórkowych, wentylowane, sterylneVWR734-2311
Roztwór trypsyny-EDTASigma-AldrichT3924-100ML
Roztwór błękitu trypanowego
0,4%, płynny, sterylnie filtrowany		Sigma-AldrichT8154 
PBSGibco14190250
pożywka do hodowli komórkowych DMEM, z technologiami GlutaMAX i PyrcenianLife31966-047
Wkładki do hodowli komórkowych z membraną poliestrową Corning TranswellSigma-AldrichCLS3450-24EA
Mucyna z żołądka świni Typ II   Sigma-AldrichM2378
Inaktywowana płodowa surowica bydlęcaGreiner Bio One758093
Antybiotyk-Antybiotyk (100X)Gibco15240062
Triton X 100 do biologii molekularnejSigma-AldrichT8787 
DPBS bez wapnia, magnezuGibco14190-250
Zestaw do oznaczania cytotoksyczności Pierce LDHThermo Fisher Scientific88953
Corning HTS Transwell-24 studzienka, wielkość porów 0,4 i mikro; mCorning Costar Corp3450
Elektroforeza Servabez nukleaz w wodzie28539010
EQUIPMENT
Neubauer ulepszona komora liczącaCarl RothT729.1
BD Accuri C6 Cytometr przepływowyBD Biosciences653118
HomogenizatorPowerLyzer 24MoBio13155
T100 Thermal CyclerBioRad186-1096
System spłukiwaniaCustommade-InnOva
4080 Wytrząsarka do inkubatora NewBrunswick Scientific8261-30-10072.10
Memmert CO2Memmert GmbH & Co.ICO150med
Millicell ERS (System oporu elektrycznego)EMD Millipore, Merck KGaAMERS00002
Millipore Milli-Q akademicki, ultra czysty system wodnyMillipore, Merck KGaA-Shaker
(ROCKER 3D basic)Wytrząsarka IKA4000000do 6.10
średni do inkubatora

Bibliografia

  1. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Revised estimates for the number of human and bacteria cells in the body. PLoS Biology. 14, e1002533(2016).
  2. Kelly, D., King, T., Aminov, R. Importance of microbial colonization of the gut in early life to the development of immunity. Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. , 58-69 (2007).
  3. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. Journal of Clinical Microbiology. 43, 5721-5732 (2005).
  4. Marsh, P. D., Head, D. A., Devine, D. A. Dental plaque as a biofilm and a microbial community-Implications for treatment. Journal of Oral Biosciences. 57, 185-191 (2015).
  5. Socransky, S. S., Haffajee, A. D., Cugini, M. A., Smith, C., Kent, R. L. Microbial complexes in subgingival plaque. Journal of Clinical Periodontology. 25, 134-144 (1998).
  6. Haffajee, A. D., et al. Subgingival microbiota in healthy, well-maintained elder and periodontitis subjects. Journal of Clinical Periodontology. 25, 346-353 (1998).
  7. Venema, K. Microbial metabolites produced by the colonic microbiota as drivers for immunomodulation in the host. The FASEB Journal. 27, (2013).
  8. Marzorati, M., et al. The HMI (TM) module: A new tool to study the Host-Microbiota Interaction in the human gastrointestinal tract in vitro. BMC Microbiology. 14, 133(2014).
  9. Tanzer, J. M., Kurasz, A. B., Clive, J. Competitive displacement of mutans streptococci and inhibition of tooth-decay by Streptococcus-Salivarius Tove-R. Infection and Immunity. 48, 44-50 (1985).
  10. Slomka, V., et al. Nutritional stimulation of commensal oral bacteria suppresses pathogens: the prebiotic concept. Journal of Clinical Periodontology. 44, 344-352 (2017).
  11. Hernandez-Sanabria, E., et al. In vitro increased respiratory activity of selected oral bacteria may explain competitive and collaborative interactions in the oral microbiome. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 235(2017).
  12. Alvarez, G., Gonzalez, M., Isabal, S., Blanc, V., Leon, R. Method to quantify live and dead cells in multi-species oral biofilm by real-time PCR with propidium monoazide. AMB Express. 3, (2013).
  13. Ehsani, E., et al. Initial evenness determines diversity and cell density dynamics in synthetic microbial ecosystems. Scientific Reports. 8, 340(2018).
  14. Hernandez-Sanabria, E., et al. Correlation of particular bacterial PCR-denaturing gradient gel electrophoresis patterns with bovine ruminal fermentation parameters and feed efficiency traits. Applied and Environmental Microbiology. 76, 6338-6350 (2010).
  15. Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nature Protocols. 2, 2276-2284 (2007).
  16. Calatayud, M., Velez, D., Devesa, V. Metabolism of inorganic arsenic in intestinal epithelial cell lines. Chemical Research in Toxicology. 25, 2402-2411 (2012).
  17. Minekus, M., et al. A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food & Function. 5, 1113-1124 (2014).
  18. Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73, 3283-3290 (2007).
  19. Props, R., Monsieurs, P., Mysara, M., Clement, L., Boon, N. Measuring the biodiversity of microbial communities by flow cytometry. Methods in Ecology and Evolution. 7, 1376-1385 (2016).
  20. Yamashita, Y., Takeshita, T. The oral microbiome and human health. Journal of Oral Science. 59, 201-206 (2017).
  21. Wade, W. G. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research. 69, 137-143 (2013).
  22. Yu, M., et al. A resource for cell line authentication, annotation and quality control. Nature. 520, 307(2015).
  23. Pelaseyed, T., et al. The mucus and mucins of the goblet cells and enterocytes provide the first defense line of the gastrointestinal tract and interact with the immune system. Immunological Reviews. 260, 8-20 (2014).
  24. Bengoa, A. A., et al. Simulated gastrointestinal conditions increase adhesion ability of Lactobacillus paracasei strains isolated from kefir to Caco-2 cells and mucin. Food Research International. 103, 462-467 (2018).
  25. Kleiveland, C. R., et al. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. Verhoeckx, K., et al. , Springer International Publishing. 197-205 (2015).
  26. Laparra, J. M., Sanz, Y. Comparison of in vitro models to study bacterial adhesion to the intestinal epithelium. Letters in Applied Microbiology. 49, 695-701 (2009).
  27. Gagnon, M., Berner, A. Z., Chervet, N., Chassard, C., Lacroix, C. Comparison of the Caco-2, HT-29 and the mucus-secreting HT29-MTX intestinal cell models to investigate Salmonella adhesion and invasion. Journal of Microbiological Methods. 94, 274-279 (2013).
  28. Großkopf, T., Soyer, O. S. Synthetic microbial communities. Current Opinion in Microbiology. 18, 72-77 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model jelita in vitroSymulacja pasa u o dkowo jelitowegoOcena ywotno ci metod cytometrii przep ywowejKokultura Caco 2 i HT29 MTXSymulowane p yny trawienneIntegralno bariery nab onkowejSk ad mikrobioty bakteryjnejZdolno kolonizacyjna probiotyk w
Ocena żywotności konsorcjum bakterii syntetycznych na granicy faz gospodarz-mikroorganizm w jelitach in vitro
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.