Podejście mikroprzepływowe oparte na kropelkach i amplifikacja mikrosferyczno-PCR dla jednoniciowych amplikonów DNA

Podsumowanie

Ta praca dostarcza metody wytwarzania platform mikroprzepływowych opartych na kropelkach oraz zastosowania mikrosfer poliakrylamidowych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Metoda microsphere-PCR umożliwia otrzymanie jednoniciowych amplikonów DNA bez rozdzielania dwuniciowego DNA.

Streszczenie

Mikrofluidyka oparta na kropelkach umożliwia niezawodną produkcję jednorodnych mikrosfer w kanale mikroprzepływowym, zapewniając kontrolowaną wielkość i morfologię uzyskanej mikrosfery. Udało się wytworzyć mikrosferę skopolimeryzowaną za pomocą sondy akrylowo-DNA. Do syntezy jednoniciowego DNA (ssDNA) można zastosować różne metody, takie jak asymetryczny PCR, trawienie egzonukleazą i izolacja na kulkach magnetycznych pokrytych streptawidyną. Jednak metody te nie mogą efektywnie wykorzystywać dużych ilości wysoko oczyszczonego ssDNA. W tym miejscu opisujemy protokół mikrosferycznego PCR, szczegółowo opisujący, w jaki sposób ssDNA może być skutecznie amplifikowane i oddzielane od dsDNA po prostu przez pipetowanie z probówki reakcyjnej PCR. Amplifikacja ssDNA może być stosowana jako potencjalne odczynniki dla procesów mikromacierzy DNA i DNA-SELEX (Systematyczna ewolucja ligandów przez wykładnicze wzbogacanie).

Wprowadzenie

Jednoniciowe DNA (ssDNA) było szeroko rozważane jako molekularny element rozpoznający (MRE) ze względu na jego wewnętrzne właściwości do hybrydyzacji DNA-DNA^1,2. Rozwój systemów syntetycznych ssDNA może prowadzić do zastosowań biologicznych, takich jak mikromacierze DNA³, oligoterapie, diagnostyka i zintegrowane wykrywanie molekularne oparte na interakcjach uzupełniających^4,5.

Do tej pory, mikrometrowe cząstki polimeru zostały z powodzeniem zademonstrowane za pomocą urządzeń mikroprzepływowych. Udowodniono, że kilka technik mikroprzepływowych jest skutecznych w wytwarzaniu wysoce jednorodnych mikrosfer przy ciągłym przepływie w środowisku mikrokanałowym^6,7.

W badaniu Lee et al.⁸, zgłoszono opartą na kropelkach platformę mikroprzepływową do mikroprzepływowej syntezy kopolimeryzowalnych oligo-mikrosfer i amplifikacji ssDNA. Platforma mikroprzepływowa składa się z dwóch warstw PDMS (polidimetylosiloksan): górnej części z siecią kanałów mikroprzepływowych do generowania mikrosfery i dolnej płaskiej części. Składają się one z trzech rodzajów kanałów fluidycznych PDMS: 1) kanału skupiającego przepływ do generowania kropel, 2) kanału serpentynowego do mieszania dwóch roztworów oraz 3) kanału polimeryzacji sekwencyjnej do krzepnięcia mikrosfery. Po wprowadzeniu dwóch niemieszających się przepływów do jednego kanału przepływowego PDMS, przepływy te mogą być wymuszone przez strukturę wąskiego otworu. Zachowania przepływu, takie jak geometria kanału, natężenie przepływu i lepkość, wpływają na rozmiar i morfologię mikrosfery. W związku z tym główny strumień cieczy można podzielić na monosfery w mikroskali^9,10.

Tutaj dostępny jest szczegółowy protokół mikrosferycznego PCR do amplifikacji ssDNA. W pierwszej kolejności opisano proces projektowania urządzeń mikroprzepływowych opartych na kropelkach. Następnie wyjaśniono sposób, w jaki mikrosfery poliakrylamidu mogą być funkcjonalizowane za pomocą losowej matrycy DNA w sposób komplementarny. Na koniec pokazano protokół mikrosferycznego PCR do amplifikacji ssDNA.

Protokół

1. Produkcja platformy mikroprzepływowej PDMS

1. Przygotować 20 ml ciekłego prepolimeru PDMS, mieszając polimer bazowy i katalizator w stosunku objętościowym 10:1. Wlać 10 ml płynnego PDMS na przygotowaną formę SU-8 na płytce krzemowej dla górnej części sieci mikroprzepływowej. W przypadku dolnej płaskiej części wlej tę samą objętość płynnego PDMS na płytkę krzemową bez struktury formy.
   Uwaga: Sieć mikroprzepływowa jest projektowana w programie CAD, a następnie przekształcana w fotomaskę w celu wytworzenia wzorca przy użyciu typowego procesu fotolitografii (patrz rysunki uzupełniające). Ten wzorzec składa się z ujemnej formy fotorezystu SU-8 na wafle krzemowym¹¹.
2. Umieścić dwie płytki krzemowe pokryte ciekłym prepolimerem PDMS na płycie grzejnej i utwardzać w temperaturze 75 °C przez 30 minut.
   1. Ręcznie oderwij utwardzoną warstwę PDMS od formy SU-8. Dopasuj narzędzie do dziurkowania z okrągłymi otworami o średnicy 1,5 mm do portu oleju w replikowanej sieci mikroprzepływowej, aby połączyć kanały przepływu w skali mikronowej z próbkami makropłynów. Ręcznie wybij otwór przelotowy.
   2. Powtórz ten proces wykrawania trzy razy, aby utworzyć dwa roztwory i port wylotowy.
3. Wykonaj hydrofilową obróbkę powierzchni zarówno na górnej, jak i dolnej warstwie PDMS za pomocą ręcznej obróbki koronowej¹² przez kilka sekund na próbkę.
   1. Ułóż dwie warstwy PDMS poddane obróbce plazmowej i podgrzewaj w temperaturze 90 °C przez 30 minut za pomocą płyty grzejnej do procesu łączenia PDMS. Dostarczyć wodę pod ciśnieniem za pomocą pompy strzykawkowej do trzech portów wlotowych w celu połączenia strukturalnego i sprawdzenia szczelności wyprodukowanego urządzenia.

2. Produkcja oligomikrosfer poliakrylamidowych

1. Przygotować mieszaninę kulek wyszczególnioną w tabeli 1.
2. Odwirować i krótko odwirować standardową sondę znakowaną akrydytem ssDNA (Ap, 100 μM) i roztwór podstawowy akrylamidu:bis (19:1).
3. Przygotować roztwór I, mieszając 25 μl 40% roztworu bis akryloamidu, 10 μl ssDNA (sonda akrylowa), 10 μl 5x buforu TBE (1,1 M Tris; 900 mM boran; 25 mM EDTA) i 5 μL wody. Przygotować roztwór II z 50 μl 20% nadsiarczanu amonu.
4. Przygotować dwie strzykawki wypełnione pojedynczo roztworem I i roztworem II i zamontować je na pompie, aby wprowadzić przepływy roztworu do platformy mikroprzepływowej. Przygotować olej mineralny zmieszany z 0,4% TEMED do krzepnięcia powierzchni mikrosfery.
   Uwaga: TEMED jest dobrze znany jako stabilizator wolnych rodników. Wolne rodniki mogą przyspieszać tempo tworzenia polimerów za pomocą nadsiarczanu amonu (APS) w celu katalizowania polimeryzacji akrylamidu.
5. Napełnij szklaną butelkę 4 ml oleju mineralnego, aby uzyskać ciągły przepływ.
6. Włóż dwie rurki do dwóch portów w nakrętce szklanej butelki jako zbiornik mikroprzepływowy: port pneumatyczny do wprowadzania sprężonego powietrza do szklanej butelki ze sprężarki powietrza oraz port płynu do dostarczania oleju pod ciśnieniem do sieci mikrokanałów ze szklanej butelki. Podłącz rurki między szklaną butelką a portem oleju w urządzeniu mikroprzepływowym.
   1. Podłącz rurki do dwóch portów roztworu w urządzeniu mikroprzepływowym, aby dostarczyć dwa roztwory z pomp strzykawkowych. Włóż rurki do portu wylotowego, aby przenieść wytworzoną mikrosferę do zlewki.
7. Ustawić natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 0,4 - 0,7 ml/h. Wyregulować ciśnienie sprężonego powietrza w sprężarce za pomocą regulatora (82 - 116 kPa). Ustaw prędkość obrotową (500 obr./min) mieszadła magnetycznego w szklanej zlewce na płycie grzejnej. Uruchom pompę strzykawkową i dostarcz sprężone powietrze wytwarzane przez zewnętrzną sprężarkę do szklanej butelki za pomocą regulatora ON/OFF zaworu elektromagnetycznego¹³.
8. Za pomocą mikroskopu cyfrowego można obserwować powstawanie mikrosfer w geometrii skupiającej przepływ i krzepnięcie wytworzonych mikrosfer w szklanej zlewce.
   Uwaga: Wielkość i szybkość produkcji mikrosfery zależą od natężenia przepływu roztworów i ciśnienia wywieranego na przepływ oleju mineralnego (tabela 2).

3. Wykonywanie zliczania oligomikrosfer poliakryloamidu

1. W celu ilościowego oznaczania hemocytometru pobrać niewielką ilość (około 100 μl) wodnego roztworu oligomikrosfer poliakrylamidowych i umieścić na szklanym hemocytometrze, a następnie delikatnie napełnić zawiesinę mikrosfery w studzience komory liczącej.
   Uwaga: Aby uzyskać więcej informacji, zobacz http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer.
2. Użyj mikroskopu i ręcznego licznika liczenia, aby policzyć mikrosfery w jednym zestawie 16 kwadratów. Następnie przenieś hemocytometr do następnego zestawu komory i kontynuuj liczenie, aż wszystkie cztery zestawy po 16 rogów zostaną policzone.
3. Określ średnią liczbę mikrosfer i oblicz liczbę mikrosfer w oryginalnej zawiesinie kulki.
4. Przenieś 100 μl mikrosfer do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Usunąć supernatant przez delikatne odwirowanie (400 x g) i pipetowanie.

4. Przeprowadzanie hybrydyzacji DNA na powierzchni oligomikrosfery poliakrylamidu

Uwaga: Identyczna sonda DNA z_2-grupą 5'-NH zamiast modyfikacji 5'-akrytydu jest dodawana do roztworu I i równolegle testowana pod kątem mikrosfer zawierających Ap. Wyniki hybrydyzacji DNA są pokazane w Rysunek 2. Roztwór komplementarnych sond oligonukleotydowych znakowanych Cy3 (cAp) należy umieścić w ciemnym pomieszczeniu.

1. Zawiesić Cy3-cAp za pomocą 100 μL buforu 1xTE (bufor TE: 10 mM Tris i 1 μM EDTA, pH 8,0) w celu uzyskania końcowego stężenia 100 μM. Na przykład ponownie zawiesić 1 pmol cAp w 100 ml buforu TE i przenieść do probówki mikrowirówki pokrytej folią aluminiową.
   Uwaga: Sekwencje nici, patrz tabela 3.
2. Dodać 100 μM Cy3-cAp do sterylnej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej mikrosfery kopolimeryzowane z Ap.
3. Postukaj kilka razy w probówkę, aby wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 1 godzinę.
4. Odrzucić supernatant i usunąć pozostały bufor poprzez pipetowanie.
5. Przepłukać trzykrotnie 500 μl buforu TE.
6. Ponownie zawiesić mikrosfery, delikatnie stukając w probówkę mikrowirówki. Następnie powtórz krok 4.4.
7. Umieść mikrokulki na szkiełku podstawowym (75 mm x 50 mm) i przykryj folią aluminiową przed obrazowaniem.

5. Asymetryczny PCR do amplifikacji ssDNA

1. Przygotuj asymetryczną mieszaninę odczynników PCR do amplifikacji ssDNA do analizy. Rozmrozić odczynniki z tabeli 4 na lodzie. Nie przechowywać enzymu polimerazy Taq (50 U/μL) na lodzie, ale raczej przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
2. Delikatnie wymieszaj wszystkie odczynniki, a następnie krótko odwiruj probówki o sile 10 000 x g przez 10 sekund.
3. Połączyć wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w tabeli 4.
4. Umieścić próbki w termocyklerze i rozpocząć asymetryczny PCR w następujących warunkach: 25 cykli (95 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s), 85 °C przez 5 minut, trzymać w temperaturze 4 °C.

6. Microsphere-PCR do amplifikacji ssDNA

Uwaga: Ta sekcja opisuje protokół amplifikacji ssDNA w probówce reakcyjnej PCR. Reakcje Microsphere-PCR przeprowadzono w 50 μL objętości reakcji. Szczegółowe sekwencje stosowane do amplifikacji ssDNA wymieniono w tabeli 5. W tym przypadku Ap na powierzchni mikrosfer może wyżarzać się do losowych matryc DNA w sposób komplementarny. Jest to bardzo ważny krok w procesie wytwarzania komplementarnych nici DNA (antysensowna nić DNA, Rysunek 3). Wydłużone DNA jest używane jako matryca do amplifikacji mikrosferycznej PCR.

1. Przygotuj mieszaninę odczynników do mikrosfery i PCR. Rozmrozić odczynniki z tabeli 6 na lodzie; jednak nie należy przechowywać enzymu polimerazy Taq na lodzie. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
2. Delikatnie wymieszaj wszystkie odczynniki, a następnie krótko odwiruj probówki o sile 10 000 x g przez 10 sekund.
3. Uzyskaj około ~25 mikrosfer poprzez mikroskopijne liczenie.
   Uwaga: Liczbę mikrosfer w jednej probówce reakcyjnej oblicza się za pomocą mikroskopu świetlnego o 40-krotnym powiększeniu. Około ~25 mikrosfer jest używanych do amplifikacji mikrosferycznej PCR. Bardziej szczegółowe informacje znajdują się w kroku 3.
4. Połączyć wszystkie odczynniki zgodnie z opisem w Tabeli 6.
5. Umieścić próbki w termocyklerze i rozpocząć asymetryczny PCR w następujących warunkach: 25 cykli (95 °C przez 30 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s), 85 °C przez 5 minut, trzymać w temperaturze 4 °C.
6. Po amplifikacji dodać 8 μl 6-krotnego buforu ładującego i załadować 15 μl każdej próbki do 2% żelu agarozowego. Następnie należy wykonać elektroforezę pod napięciem 100 V przez 35 minut w buforze 1x TAE (Tris-acetate-EDTA, 40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH 8,2).

7. Akwizycja mikroskopii konfokalnej

Uwaga: Wyniki hybrydyzacji mikrosfery z sondą DNA są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym. Analiza obrazu jest wykonywana za pomocą ImageJ.

1. Przymocuj zhybrydyzowane mikrosfery do stolika mikroskopu w uchwycie.
2. Wybierz laser (laser helowy/neonowy, linia 543 nm) i włącz go w trybie sterowania laserem.
3. Wybierz soczewkę obiektywu w sterowaniu mikroskopem.
4. Wybierz żądany filtr dla Cy3 i kanału w kontrolce konfiguracji.
5. Rozpocznij eksperyment i obserwuj próbkę. Ustawienia mikroskopu konfokalnego podsumowano w Tabeli 7.

Wyniki

Wytworzona platforma mikroprzepływowa oparta na kropelkach polimerowych składa się z dwóch warstw PDMS (Rysunek 1a). Do generowania mikrosfer wykorzystywane są trzy rodzaje sieci kanałów mikroprzepływowych: 1) geometria skupiająca przepływ, jak pokazano na rysunku Rysunek 1b, 2) kanał serpentynowy do mieszania roztworu I i roztworu II oraz 3) kanał polimeryzacyjny do krzepnięcia mikrosfery. Wysokość wszystkich kanałów wynosiła 60 μm. Długo...

Dyskusja

Zanieczyszczenia dsDNA są głównym problemem w amplifikacji ssDNA. Minimalizacja amplifikacji dsDNA w konwencjonalnej asymetrycznej amplifikacji PCR pozostaje trudna¹⁵. Ponadto, chociaż ulepszenia techniczne w zakresie generowania ssDNA umożliwiły nam zwiększenie wydajności przepływu próbek, izolacja ssDNA jest nadal problematyczna ze względu na wysokie koszty i niepełną wydajność oczyszczania.

Asymetryczny PCR jest jedną z najtrudniejszych metod stosowanych podczas prac...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ciekły polidimetylosiloksan, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Składniki chipa
40% Akrylamid:bis roztwór (19:1)	Bio-rad	1610140	Składniki kopolimeryzowalnej oligomikrosfery
Nadsiarczan amonu, APS	Sigma Aldrich	A3678	Utwardzacz akryloamidu:bis roztwór
N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiamina, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Katalizator nadsiarczanu amonu
Olej mineralny	Sigma Aldrich	M5904	Tabela 1. Rozwiązanie III. Składnik odczynników mikrosferycznych
Cy3 komplementarnych sond oligonukleotydowych	zsyntetyzowanych	przez Bioneer	Tabela 3. Informacje o sekwencji
Sonda znakowana akrydytem ssDNA	Zsyntetyzowana	przez Bioneer	Tabela 1. Roztwór I. Składnik odczynników
mikrosferycznych Tris	Biosesang	T1016	Składniki buforu TE, roztwór buforowy pH
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Składniki buforu TE, usuwanie jonów (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	amplifikacja ssDNA
Mikroskop konfokalny	Carl Zeiss	LSM 510	Identyfikacja oligonukleotydów na powierzchni mikrosfery
Mikroskop świetlny	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Obliczanie liczby mikrosfer
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	amplifikacja ssDNA
Ręczna obróbka koronowa	Electro-Technic	BD-20AC Laboratoryjna obróbka koronowa	Hydrofilowa obróbka powierzchni
Płyta grzejna	Jako jedna	HI-1000	do utwardzania cieczy PDMS
Pompa strzykawkowa	kd Scientific	78-1100	Równomierny przepływ roztworu I i roztworu II Sprężarka
	Kohands	KC-250A	Kontrola przepływu roztworu III
Bright-Line Hemacytometr	Sigma	Aldrich Z359629	Obliczanie liczby mikrosfer