Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po wystawieniu na hipoksję/reoksygenację z lub bez środka ochronnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Test oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w miocytach serca po niedotlenieniu/reoksygenacji
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szybka i skuteczna reperfuzja niedrożnej tętnicy wieńcowej jest najlepszą strategią na zmniejszenie rozmiaru zawału mięśnia sercowego u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego z podwyższonym odcinkiem ST. Jednak reperfuzja sama w sobie może powodować dalszą śmierć kardiomiocytów, zjawisko znane jako uszkodzenie reperfuzyjne. Otwarcie porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów (mPTP), wraz ze spadkiem potencjału błony mitochondrialnej (MMP), czyli depolaryzacja mitochondriów, jest powszechnie uznawane za końcowy etap uszkodzenia reperfuzyjnego i jest odpowiedzialne za śmierć mitochondriów i kardiomiocytów. JC-1 to lipofilowy barwnik kationowy, który kumuluje się w mitochondriach w zależności od wartości MMP. Im wyższy jest MMP, tym więcej JC-1 gromadzi się w mitochondriach. Rosnąca ilość JC-1 w mitochondriach może być odzwierciedlona przez przesunięcie emisji fluorescencji z zielonego (~530 nm) na czerwony (~590 nm). Dlatego zmniejszenie stosunku intensywności fluorescencji czerwonej do zielonej może wskazywać na depolaryzację mitochondriów. Tutaj wykorzystujemy JC-1 do pomiaru MMP, czyli otwarcia mPTP w ludzkich miocytach serca po niedotlenieniu/reoksygenacji, wykrytego za pomocą cytometrii przepływowej.
Wprowadzenie
Choroba niedokrwienna serca jest główną przyczyną zgonów na całym świecie. Leczeniem z wyboru w celu zmniejszenia uszkodzenia niedokrwiennego i ograniczenia wielkości zawału u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego z podwyższonym odcinkiem ST jest szybka i skuteczna reperfuzja mięśnia sercowego za pomocą pierwotnej przezskórnej interwencji wieńcowej (PCI)1,2. Jednak reperfuzja powoduje dodatkowe uszkodzenia, które mogą stanowić do 30 procent końcowego rozmiaru zawału3. Powszechnie uznaje się, że pory przejściowe przepuszczalności mitochondriów (mPTP) są nie tylko kluczowe w uszkodzeniu m....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie odczynników i roztworów
- Przygotuj kompletną pożywkę dla ludzkich miocytów serca (HCM), dodając 25 ml mieszanki suplementów Myocyte Growth Medium do 500 ml pożywki Myocyte Growth Medium zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C przed użyciem.
- Przygotuj roztwór Tongxinluo (TXL), rozpuszczając ultradrobny proszek TXL w surowicy/bezglukozowym zmodyfikowanym podłożu Eagle's Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco i dostosuj stężenie TXL do 400 μg/ml poprzez dodanie DMEM (aby uzyskać więcej informacji, zobacz11). Przechowywać w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C przed użyciem.<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przed przeprowadzeniem analizy JC-1 w celu oceny zmian MMP wysoce zaleca się wykonanie eksperymentów potwierdzających warunki pomyślnie ustalone przez badaczy. Jak pokazują wyniki cytometrii przepływowej (Rysunek 2), w porównaniu z grupą kontrolną, hipoksja/reoksygenacja (H/R) znacząco indukowała apoptozę HCM (Annexin V + /PI±), co wskazuje na utworzenie komórkowego modelu I/R (45,0 ± 2,13% w porównaniu z 1,50 ± 0,18% w grupie kontrolnej, p <0,05).......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy protokół, który wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny MMP komórek po wystawieniu na działanie H / R. Wykryty za pomocą testu JC-1 MMP komórek jest niezależny od czynników, takich jak wielkość, kształt i gęstość mitochondriów, które mogą wpływać na jednoskładnikowe sygnały fluorescencyjne14. W związku z tym wyniki testu JC-1 są stosunkowo wiarygodne. Poza tym wykonanie testu JC-1 jest wygodne i oszczędza czas. Ten test ma niskie wymagania dotyczące materiałów i odczynników,.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez granty z Narodowego Kluczowego Programu Badań i Rozwoju Chin (nr 2017YFC1700503), Narodowego Programu Badań Podstawowych (Program 973) z Chin (No.2012CB518602), National Natural Science Foundation of China (nr 81370223 i nr 81573957) oraz Fundacji Innowacyjnych Badań Podyplomowych Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw do oznaczania potencjału błony mitochondrialnej z JC-1 | Beyodtime, Chiny | C2006 | W zestawie znajduje się roztwór podstawowy JC-1 (200& razy), bufor do barwienia zapasów (5 razy;) i CCCP (10 mM) |
| Tongxinluo ultradrobny proszek | Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Chiny | 071201 | |
| Annexin V-FITC/PI | Kit Becton-Dickinson, USA | 556547 | |
| DMEM | Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA | 11966-025 | |
| Ludzkie miocyty serca | Promocell, Niemcy | C-12810 | |
| Pożywka do wzrostu miocytów (SupplementMix) | Promocell, Niemcy | C-39275 | |
| Pożywka do wzrostu miocytów (gotowa do użycia) | Promocell, Niemcy | C-22070 | używany z pożywką do wzrostu miocytów SupplementMix |
| GENbox | BioMé rieux, Marcy l' Etoile, Francja | 96127 | Katalizator 2,5 l |
| (AnaeroPack) | MITSUBISHI GAS CHEMICAL SPÓŁKA, INC. , Japonia | C-1 | |
| Wskaźnik beztlenowy | BioMé rieux, Marcy l' Etoile, Francja | 96118 | |
| Cytometr przepływowy | Becton-Dickinson, Stany Zjednoczone | FACSAria 2 | |
| BD FACSDiva Software | Becton-Dickinson, USA | Wersja8.0.1 | |
| Probówka na próbkę | Corning science, USA | 352054 | 12*75mm |
| PBS | Hyclone, USA | SH30256.01 |
Bibliografia
- Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
- Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for th....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
