Artykuł metodologiczny

Test oparty na cytometrii przepływowej do pomiaru potencjału błony mitochondrialnej w miocytach serca po niedotlenieniu/reoksygenacji

DOI:

10.3791/57725

⸱

13 lipca 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Department of Cardiology, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Fuwai Hospital, National Center for Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny potencjału błony mitochondrialnej komórek po wystawieniu na hipoksję/reoksygenację z lub bez środka ochronnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szybka i skuteczna reperfuzja niedrożnej tętnicy wieńcowej jest najlepszą strategią na zmniejszenie rozmiaru zawału mięśnia sercowego u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego z podwyższonym odcinkiem ST. Jednak reperfuzja sama w sobie może powodować dalszą śmierć kardiomiocytów, zjawisko znane jako uszkodzenie reperfuzyjne. Otwarcie porów przejściowych przepuszczalności mitochondriów (mPTP), wraz ze spadkiem potencjału błony mitochondrialnej (MMP), czyli depolaryzacja mitochondriów, jest powszechnie uznawane za końcowy etap uszkodzenia reperfuzyjnego i jest odpowiedzialne za śmierć mitochondriów i kardiomiocytów. JC-1 to lipofilowy barwnik kationowy, który kumuluje się w mitochondriach w zależności od wartości MMP. Im wyższy jest MMP, tym więcej JC-1 gromadzi się w mitochondriach. Rosnąca ilość JC-1 w mitochondriach może być odzwierciedlona przez przesunięcie emisji fluorescencji z zielonego (~530 nm) na czerwony (~590 nm). Dlatego zmniejszenie stosunku intensywności fluorescencji czerwonej do zielonej może wskazywać na depolaryzację mitochondriów. Tutaj wykorzystujemy JC-1 do pomiaru MMP, czyli otwarcia mPTP w ludzkich miocytach serca po niedotlenieniu/reoksygenacji, wykrytego za pomocą cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba niedokrwienna serca jest główną przyczyną zgonów na całym świecie. Leczeniem z wyboru w celu zmniejszenia uszkodzenia niedokrwiennego i ograniczenia wielkości zawału u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego z podwyższonym odcinkiem ST jest szybka i skuteczna reperfuzja mięśnia sercowego za pomocą pierwotnej przezskórnej interwencji wieńcowej (PCI)1,2. Jednak reperfuzja powoduje dodatkowe uszkodzenia, które mogą stanowić do 30 procent końcowego rozmiaru zawału3. Powszechnie uznaje się, że pory przejściowe przepuszczalności mitochondriów (mPTP) są nie tylko kluczowe w uszkodzeniu mitochondriów i śmierci komórek podczas niedokrwienia/reperfuzji (I/R), ale są również zbieżnym celem sygnalizacji kardioprotekcyjnej4,5. Ponieważ otwarcie mPTP spowodowałoby depolaryzację wewnętrznego potencjału błony mitochondrialnej (MMP)4, wykryliśmy otwarcie mPTP za pomocą testu 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraetylo-imidakarbocyjaninojodku (JC-1).

Test JC-1 jest metodą cytofluorymetryczną, która jest zarówno jakościowa, jak i ilościowa, i została dodatkowo zweryfikowana poprzez analizę MMP na poziomie pojedynczej klasy mitochondriów6. JC-1 występuje jako forma zagregowana, powodująca emisję o barwie od czerwonej do pomarańczowej (590 ± 17,5 nm) w macierzy mitochondriów z normalnym MMP; z utratą MMP JC-1 przekształca się w formę monomeryczną, która daje zieloną fluorescencję o emisji 530 ± 15 nm. W związku z tym spadek współczynnika intensywności fluorescencji czerwonej/zielonej może wskazywać na zmniejszenie MMP w stanach takich jak niedokrwienie/reperfuzja (I/R).

Oprócz JC-1, MMP było również badane z przepuszczalnymi dla błony kationami lipofilowymi, takimi jak rodamina 123 i jodek 3,3′-diheksyloksadikarbocyaniny [DiOC6(3)]. Jednak w porównaniu z tymi dwiema sondami, JC-1 jest bardziej wiarygodna w analizie MMP. Rodamina 123 ma stosunkowo słabą czułość (szczególnie w trybie hartowania7,8) i słabą swoistość. Przesunięcie w rodaminie 123 jest czasami tak małe, że badaczom lub sprzętowi trudno jest zaobserwować/wykryć. Poza tym w pojedynczej komórce istnieją różne miejsca wiązania mitochondrium dla rodaminy 123, dzięki czemu może ona mieć różne emisje fluorescencji9. DiOC6(3) również nie jest zalecany do wykrywania MMP, ponieważ reaguje wrażliwie na depolaryzację błony plazmatycznej10.

Dlatego tutaj używamy testu JC-1 do oceny MMP HCM po wystawieniu na hipoksję/reoksygenację z lub bez środka ochronnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie odczynników i roztworów

  1. Przygotuj kompletną pożywkę dla ludzkich miocytów serca (HCM), dodając 25 ml mieszanki suplementów Myocyte Growth Medium do 500 ml pożywki Myocyte Growth Medium zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C przed użyciem.
  2. Przygotuj roztwór Tongxinluo (TXL), rozpuszczając ultradrobny proszek TXL w surowicy/bezglukozowym zmodyfikowanym podłożu Eagle's Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco i dostosuj stężenie TXL do 400 μg/ml poprzez dodanie DMEM (aby uzyskać więcej informacji, zobacz11). Przechowywać w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C przed użyciem.
  3. Przygotuj 5 ml roztworu roboczego JC-1, dodając 25 μl roztworu podstawowego JC-1 (200x), 4 ml ultraczystej wody i 1 ml buforu do barwienia (5x) w 15 ml probówce wirówkowej w ciemności. Kilkakrotnie odpipetować mieszaninę w górę i w dół, a przed użyciem ogrzać ją do temperatury 37 °C.
  4. Przygotować 30 ml roboczego buforu barwiącego, dodając 24 ml ultraczystej wody do 6 ml podstawowego buforu barwiącego (5x) w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Użyj tego roztworu na zimno.

2. Ustanowienie modelu hipoksji/reoksygenacji

  1. Płytka 1,0 x 105 komórek na dołek z kompletnym podłożem HCM na płytce 6-dołkowej. Rosną do zbiegu około 70% w inkubatorze komórkowym zawierającym 5%CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 °C.
  2. Przemyć HCM roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Poddaj je różnym zabiegom (400 μg/ml TXL lub bez) w 2 ml surowicy/DMEM bez glukozy przez 30 minut przed hipoksją w inkubatorze komórkowym zawierającym 5% CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 °C.
  3. Inkubować HCM w hermetycznym i niedotlenionym słoiku (2,5 l) wyposażonym w katalizator do usuwania wolnego tlenu i wywoływania hipoksji przez 18 godzin (Rysunek 1A) oraz wskaźnik beztlenowy do pomiaru ciśnienia tlenu w podłożu < sup class = "xref" > 11, 12 < sup class= "xref">13, w inkubatorze komórkowym zawierającym 5% CO2 i 95% powietrza o temperaturze 37 °C.
    Uwaga: Katalizator potrzebuje około 1,5 godziny, aby usunąć wolny tlen ze słoika. Dlatego HCM są przechowywane w słoiku przez 19,5 godziny przed otwarciem słoika. Kolor wskaźnika beztlenowego zmienia się z jasnoniebieskiego w środowisku normoksyjnym na bladobiały w stanie niedotlenienia (Rysunek 1B).
  4. Natlenować HCM, przenosząc 6-dołkową płytkę do inkubatora ustawionego na 37 °C zawierającego 5% CO2 i 95% powietrza przez 2 godziny.

3. Przygotowanie HCM do cytometrii przepływowej

  1. Podgrzać 0,25% roztwór kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i PBS do temperatury 37 °C.
  2. Odessać pożywkę z każdej studzienki, przepłukać komórki 1 ml PBS i dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny wzdłuż ściany studzienki.
  3. Inkubować w temperaturze 37 °C do momentu, gdy wszystkie HCM zostaną prawie oderwane (około 1 minut).
  4. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki DMEM (pożywka DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą) do studzienek, aby zneutralizować trypsynę. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i granulować HCM, wirując przy 500 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu.
  6. Do każdej probówki dodać 0,5 ml kompletnej pożywki HCM i 0,5 ml roztworu roboczego JC-1. Ponownie zawiesić HCM, pipetując w górę i w dół.
  7. Przykryj całe probówki folią aluminiową, aby zapobiec bieleniu wskaźnika fluorescencyjnego i inkubuj HCM w normalnych warunkach (w temperaturze 37 °C zawierającej 5%CO2 i 95% powietrza) przez 20 minut.
  8. Granulki HCM przez odwirowanie w sile 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.
  9. Dwukrotnie przepłukać HCM 2 ml lodowatego buforu barwiącego JC-1.
  10. Zawiesić HCM w końcowej objętości 300 μl lodowatego buforu barwiącego w probówce z próbką (12 mm x 75 mm) i użyć komórek do analizy w ciągu 30 min.
    Uwaga: Do kontroli pozytywnej należy użyć cyjanku karbonylu m-chlorofenylohydrazonu (CCCP), silnego inhibitora łańcucha transportu elektronów w trybie oddechowym, do leczenia HCM przez 1 godzinę w stężeniu 20 μM.

4. Konfiguracja cytometru przepływowego

  1. Uruchom cytometr przepływowy i upewnij się, że oprogramowanie jest do niego podłączone.
  2. Uruchom fluidics, uruchom strumień i skonfiguruj przerwanie.
  3. Otwórz dwa okna wykresu punktowego w oprogramowaniu do cytometrii przepływowej.
    1. Wybierz światło rozproszone do przodu (FSC) na osi X i światło rozproszone bocznie (SSC) na osi Y na pierwszym wykresie kropkowym, aby przedstawić charakterystykę komórek odpowiednio pod względem ich rozmiaru i ziarnistości.
    2. Wybierz kanał detekcji PE (575 ± 26 nm) dla osi Y i FITC (530 ± 30 nm) dla osi X, używając skali logarytmicznej na drugim wykresie punktowym, która służy do pomiaru intensywności fluorescencji barwnika JC-1 w komórkach.

5. Pomiar cytometrii przepływowej i analiza danych

  1. Kliknij przycisk Unload (Rozładuj), aby wypuścić ramię podtrzymujące probówkę i umieścić na niej probówkę z próbką ślepą (HCM, które nie zostały zabarwione JC-1). Kliknij przycisk Załaduj, aby przywrócić ramię nośne rury do pozycji roboczej.
  2. Kliknij przycisk Nagraj, aby zebrać cząstki z zawiesiny w probówce z pustą próbką, a następnie zabramkować populację komórek (P1) do dalszej analizy na pierwszym wykresie kropkowym (Rysunek 3).
  3. Zbierz HCM w innych probówkach z próbkami i zoptymalizuj pomiar, dostosowując napięcia kanałów fluorescencyjnych, aby upewnić się, że kropka komórki znajduje się w centralnym obszarze drugiego wykresu punktowego.
  4. Wyświetlić statystyki każdej probówki z próbką i obliczyć MMP każdej próbki, dzieląc stosunek intensywności czerwonej fluorescencji przez intensywność zielonej fluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed przeprowadzeniem testu JC-1 w celu oceny zmian MMP, zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie eksperymentów w celu potwierdzenia warunków pomyślnie ustalonych przez badaczy. Jak pokazują wyniki cytometrii przepływowej (Rysunek 2), w porównaniu z grupą normalną, niedotlenienie/reoksygenacja (H/R) znacząco indukowała apoptozę HCM (Aneksyna V + /PI±), co wskazuje, że ustaliliśmy komórkowy model I/R (45,00 ± 2,13% vs. 11,50 ± 0,18% w grupie normalnej, p <0....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół, który wykorzystuje barwnik JC-1 do oceny MMP komórek po wystawieniu na działanie H / R. Wykryty za pomocą testu JC-1 MMP komórek jest niezależny od czynników, takich jak wielkość, kształt i gęstość mitochondriów, które mogą wpływać na jednoskładnikowe sygnały fluorescencyjne14. W związku z tym wyniki testu JC-1 są stosunkowo wiarygodne. Poza tym wykonanie testu JC-1 jest wygodne i oszczędza czas. Ten test ma niskie wymagania dotyczące materiałów i odczynników,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez granty z Narodowego Kluczowego Programu Badań i Rozwoju Chin (nr 2017YFC1700503), Narodowego Programu Badań Podstawowych (Program 973) z Chin (No.2012CB518602), National Natural Science Foundation of China (nr 81370223 i nr 81573957) oraz Fundacji Innowacyjnych Badań Podyplomowych Peking Union Medical College (2016-1002-01-02).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do oznaczania potencjału błony mitochondrialnej z JC-1Beyodtime, ChinyC2006W zestawie znajduje się roztwór podstawowy JC-1 (200& razy), bufor do barwienia zapasów (5 razy;) i CCCP (10 mM)
Tongxinluo ultradrobny proszekShijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Chiny071201
Annexin V-FITC/PIKit Becton-Dickinson, USA556547
DMEMLife Technologies, Grand Island Biological Company, USA11966-025
Ludzkie miocyty sercaPromocell, NiemcyC-12810
Pożywka do wzrostu miocytów
(SupplementMix)		Promocell, NiemcyC-39275
Pożywka do wzrostu miocytów (gotowa do użycia)Promocell, NiemcyC-22070używany z pożywką do wzrostu miocytów SupplementMix
GENboxBioMé rieux, Marcy l' Etoile, Francja96127Katalizator 2,5 l
(AnaeroPack)MITSUBISHI GAS CHEMICAL  SPÓŁKA, INC. , Japonia  C-1
Wskaźnik beztlenowyBioMé rieux, Marcy l' Etoile, Francja96118
Cytometr przepływowyBecton-Dickinson, Stany ZjednoczoneFACSAria 2
BD FACSDiva SoftwareBecton-Dickinson, USAWersja8.0.1
Probówka na próbkęCorning science, USA35205412*75mm
PBSHyclone, USASH30256.01

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute Myocardial Infarction. New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Ibanez, B., et al. ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC). European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).
  3. Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).
  4. Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).
  5. Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
  6. Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level. Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).
  7. Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).
  8. Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
  9. Cossarizza, A., Salvioli, S. Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14(2001).
  10. Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis. FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).
  11. Chen, G. H., et al. Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1. Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).
  12. Cui, H., et al. Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).
  13. Chen, J., et al. Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis. Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).
  14. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).
  15. Pravdic, D., et al. Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway. Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).
  16. Wu, Y., et al. Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway. Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).
  17. Qiu, Y., et al. Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening. Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).
  18. Zhen, Y. F., et al. P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts. Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).
  19. Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).
  20. Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells. Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).
  21. Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro. Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).
  22. Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury. World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).
  23. El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury. Biomed Research International. 2017, 5903105(2017).
  24. Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement. Bio-Protocols. 6 (15), (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Flow Cytometry AssayJC 1 DyeRed Green RatioMitochondrial DepolarizationPermeability Transition PoreCell IsolationFluorescence Detection

Powiązane artykuły