Obrazowanie odpowiedzi Ca2+ podczas zakażenia komórek nabłonkowych Shigella

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokoły wizualizacji odpowiedzi wapnia (Ca²⁺) wywołanych przez komórki HeLa zakażone przez Shigella. Optymalizując parametry infekcji bakteryjnej i obrazując za pomocą sond fluorescencyjnych^Ca2+, scharakteryzowano nietypowe globalne i lokalne sygnały Ca²⁺ indukowane przez bakterie w szerokim zakresie kinetyki infekcji.

Streszczenie

Ca²⁺ to wszechobecny jon biorący udział we wszystkich znanych procesach komórkowych. Podczas gdy globalne odpowiedzi Ca^{2 +} mogą wpływać na los komórki, lokalne zmiany w stężeniach cytozolu Ca^{2 +}, związane z uwalnianiem z wewnętrznych zapasów lub napływem przez kanały błony plazmatycznej, regulują procesy komórek korowych. Patogeny, które przylegają do komórek gospodarza lub atakują je, wywołują reorganizację cytoszkieletu aktynowego leżącego pod błoną plazmatyczną gospodarza, co prawdopodobnie wpływa zarówno na globalną, jak i lokalną sygnalizację Ca^{2 +}. Ponieważ zdarzenia te mogą zachodzić przy niskich częstotliwościach w sposób pseudostochastyczny w rozszerzonej kinetyce, analiza sygnałów Ca²⁺ indukowanych przez patogeny rodzi poważne wyzwania techniczne, którymi należy się zająć.

Tutaj raportujemy protokoły wykrywania globalnych i lokalnych sygnałów Ca²⁺ po zakażeniu Shigella komórek nabłonkowych. W tych protokołach artefakty związane z długotrwałą ekspozycją i fotouszkodzeniami związanymi ze wzbudzeniem sond fluorescencyjnych Ca^{2 +} są rozwiązywane poprzez ścisłą kontrolę parametrów akwizycji w określonych okresach czasu podczas inwazji Shigella. Wdrożono procedury rygorystycznej analizy amplitudy i częstotliwości globalnych cytozolowych sygnałów Ca^{2 +} podczas rozszerzonej kinetyki infekcji przy użyciu sondy chemicznej Fluo-4.

Wprowadzenie

Ca²⁺ reguluje wszystkie znane procesy komórkowe, w tym reorganizację cytoszkieletu, reakcje zapalne i szlaki śmierci komórki związane z interakcjami gospodarz-patogen^1,2,3. W warunkach fizjologicznych podstawowe stężenia cytozolowego Ca²⁺ są niskie, w zakresie setek nM, ale mogą być poddawane przejściowemu wzrostowi po stymulacji agonistycznej. Zmiany te często wykazują zachowanie oscylacyjne poprzez działanie pomp i kanałów na błonach plazmy i retikulum endoplazmatycznego. Wzorzec tych oscylacji charakteryzuje się okresem, czasem trwania i amplitudą wzrostu Ca²⁺ i jest odszyfrowywany przez komórki, które z kolei wywołują określone odpowiedzi w tak zwanym kodzie Ca^2+4,5. Utrzymujący się wzrost stężenia cytozolowego Ca²⁺ w warunkach patologicznych może prowadzić do śmierci komórki związanej z przenikaniem błon mitochondrialnych i uwalnianiem czynników proapoptotycznych lub nekrotycznych^6,7.

Shigella, czynnik wywołujący czerwonkę bakteryjną, atakuje komórki nabłonkowe poprzez wstrzykiwanie efektorów do komórek gospodarza za pomocą systemu wydzielania typu III (T3SS)^8,9. Inwazja Shigella na komórki gospodarza jest związana z lokalnymi i globalnymi sygnałami Ca^{2 +} wywoływanymi przez T3SS. Jeśli chodzi o toksyny tworzące pory, translokon T3SS, który wstawia się do błon komórkowych gospodarza i jest wymagany do wstrzykiwania efektorów T3SS, jest prawdopodobnie odpowiedzialny za aktywację PLC i uwalnianie Ca^{2 +} zależne od trifosforanu inozytolu (1, 4, 5) (InsP3). Połączenie zlokalizowanej stymulacji PLC i akumulacji spolimeryzowanej aktyny w miejscach inwazji Shigella skutkuje nietypowo długotrwałym, zależnym od InsP3 uwalnianiem Ca²⁺¹⁰. Efektor IpgD typu III, fosfatydylo-4,5-bisfosforan (PIP2)-4-fosfataza, ogranicza lokalną ilość PIP2, kontrolując w ten sposób ilość dostępnego substratu dla PLC do generowania InsP3, co przyczynia się do uwięzienia lokalnych odpowiedzi Ca²⁺ w miejscach inwazji bakteryjnej^11,12. Te lokalne odpowiedzi Ca²⁺ prawdopodobnie przyczyniają się do polimeryzacji aktyny w miejscach inwazji Shigella¹⁰. Globalne odpowiedzi Ca^{2 +}, które są również wywoływane przez Shigella, są jednak zbędne w procesie inwazji bakteryjnej, ale powodują otwarcie półkanałów koneksyny w błonie plazmatycznej i uwolnienie ATP w przedziale zewnątrzkomórkowym. Uwolniony ATP działając w sposób parakrynny, z kolei stymuluje odpowiedzi oscylacyjne Ca²⁺ w komórkach obok zakażonej komórki. IpgD jest również odpowiedzialny za kształtowanie globalnych odpowiedzi Ca²⁺ w niekonsekwentne izolowane odpowiedzi o powolnej dynamice. Ostatecznie, przy długotrwałej infekcji bakteryjnej, IpgD prowadzi do zahamowania sygnałów Ca^{2 +} za pośrednictwem InsP3. Poprzez interferencję z sygnalizacją Ca²⁺, IpgD opóźnia zależną od Ca²+ aktywację kalpainy, co prowadzi do demontażu ogniskowych struktur adhezyjnych i przedwczesnego oderwania zainfekowanych komórek¹³.

Podczas gdy sygnały Ca²⁺ są zaangażowane w krytyczne aspekty patogenezy, użycie mikroorganizmu rodzi szereg wyzwań technicznych, które nie są spotykane w klasycznych badaniach agonistycznych. Opisane tutaj protokoły wykorzystują powszechnie stosowany fluorescencyjny wskaźnik chemiczny Ca^{2 +} Fluo-4, który opracowaliśmy w celu scharakteryzowania lokalnych sygnałów Ca^{2 +} podczas infekcji Shigella. Omówiono etapy kluczowe dla detekcji tych sygnałów, a także procedury wdrożone do ich analizy ilościowej, która jest wymagana do scharakteryzowania roli efektorów bakteryjnych w sygnalizacji^Ca2+.

Protokół

1. Przygotowania

1. Przygotowanie bakterii
   1. Bakterie - szczep Shigella typu dzikiego wyrażający adhezynę AfaE (M90T-AfaE) - należy umieścić na płytce agarowej z tryptykazą sojową (TCS) zawierającej 0,01% czerwieni Kongo (CR) i inkubować je przez 18 godzin w temperaturze 37 °C.
      Uwaga: Aby zwiększyć ich odtwarzalność, płytki Shigella otrzymane w kroku 1.1.1 są przechowywane w temperaturze 4 °C i powinny być zużyte w ciągu tygodnia, ponieważ wszystkie kolonie na pożywce CR z czasem zmienią kolor na czerwony.
   2. Zaszczep wstępną kulturę bulionu TCS, wybierając 3 czerwone kolonie z płytek smugowych.
      Uwaga: Inokulację z 3 koloniami przeprowadza się w celu ograniczenia prawdopodobieństwa wybrania pojedynczego klonu, którego plazmid wirulencji został poddany rekombinacji genetycznej.
   3. Hodować płynne kultury bakterii w inkubatorze z wytrząsaniem przez 16 godzin w temperaturze 37 °C przy 200 obr./min. Dodać ampicylinę w końcowym stężeniu 75 mg/ml. Stężenie antybiotyku nie powinno przekraczać 3-krotności minimalnego stężenia hamującego, ponieważ nadmiar antybiotyku może prowadzić do utraty dużego plazmidu wirulencji.
      Uwaga: Utrzymanie plazmidu zjadliwości Shigella powinno być zweryfikowane poprzez posiew kultur bakterii na płytkach CR uzupełnionych odpowiednimi stężeniami antybiotyków. Obecność białych kolonii wskazuje na utratę plazmidu.
   4. Zaszczepić kulturę TCS wstępną kulturą bakteryjną w rozcieńczeniu 1:100. Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przez 2 godziny przy 200 obr./min. Upewnij się, że gęstość optyczna przy 600 nm (OD_{600 nm}) wynosi 0,2 - 0,4.
   5. Odwirować kulturę bakteryjną przez 2 minuty przy 13 000 x g w temperaturze 21 °C i ponownie zawiesić osad w równoważnej objętości pożywki EM (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, 5 mM glukozy i 25 mM HEPES, pH = 7,3).
   6. Rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną w buforze EM przy końcowej średnicy zewnętrznej_{600 nm} wynoszącej 0,1 i zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 21 °C i zużyć w ciągu następnych 60 minut.
2. Przygotowanie komórek
   1. Hoduj komórki HeLa w DMEM z 1 g / L glukozy uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą (FCS) i hoduj je w temperaturze 37 °C z 10% CO₂ . Hoduj TC-7 uprawiany w DMEM z 4,5 g/L glukozy, zawierającej 10% FCS i endogennych aminokwasów w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 10% CO₂ .
   2. W celu utrzymania komórek, należy regularnie dzielić komórki, aby uniknąć zahamowania wzrostu związanego ze stanami konfluencji; ma to kluczowe znaczenie dla wysokiej wydajności ładowania/transfekcji sondy Ca²⁺.
   3. Płytki komórek HeLa na sterylnych okrągłych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 25 mm na płytkach 6-dołkowych o gęstości 3 x 10⁵ komórek/basenik dzień przed eksperymentem dla komórek HeLa.
   4. W przypadku komórek TC-7 trypsynizuj i policz komórki. Wysiewaj je w 4 x 10⁵ komórek/dołku i inkubuj przez 5 - 7 dni w temperaturze 37 °C w 10% inkubatorze CO₂ przed eksperymentami, aby umożliwić polaryzację.
      1. Pożywkę do hodowli komórkowych należy odświeżać codziennie aż do dnia eksperymentu.
         Uwaga: Jednorazowe studzienki ze szklanym dnem o średnicy 35 mm mogą być również stosowane jako alternatywa dla studni zawierających szkiełka nakrywkowe. W przypadku stosowania tych ostatnich kontrola temperatury za pomocą podgrzewanego stolika lub obiektywu nie jest wystarczająca i wymagana jest komora inkubacyjna z termostatem zamontowana na stoliku mikroskopowym.
3. W dniu eksperymentu usunąć pożywkę i przemyć komórki 3x 1 ml pożywki EM w temperaturze 21 °C.
4. Załaduj ogniwa 3 mM Fluo-4-AM¹⁴ do bufora EM na 30 minut w temperaturze 21 °C.
   Uwaga: Podczas gdy ładowanie sub-konfluentnych komórek HeLa nie stwarza większych problemów, ładowanie spolaryzowanych komórek TC-7 jest często niejednorodne i słabo wydajne. W przypadku tych ogniw stwierdziliśmy, że wydajność ładowania jest zwiększona przez dodanie środka dyspergującego - kwasu pluronowego - o końcowym stężeniu 0,1% oraz inhibitora transportera anionów bromosulfoftaleiny o końcowym stężeniu 20 μM do EM zawierającego Fluo-4-AM. Stosowanie ratiometrycznych sond chemicznych lub genetycznie kodowanych sond FRET wymagających podwójnej akwizycji nie jest zgodne z szybkością akwizycji wymaganą do obrazowania lokalnych odpowiedzi Ca²⁺.
5. Przemyć próbki 3x buforem EM i dalej inkubować je w 1 ml buforu EM w temperaturze 21 °C, aby umożliwić hydrolizę grupy AM. Zużyte ogniwa obciążone Fluo-4 należy zużyć natychmiast lub w ciągu następnych 90 minut (utrzymywanych w temperaturze 21 °C).

2. Infekcja i pozyskiwanie obrazów lokalnych odpowiedzi Ca²⁺

1. Umieścić szkiełko nakrywkowe zawierające komórki obciążone Fluo-4 w komorze obrazowania lub komorze ze szklanym dnem. Umyj próbki w komorze obrazowania lub jednorazowej komorze ze szklanym dnem 3x buforem EM w celu usunięcia związków potencjalnie powstałych w wyniku lizy komórek. Dodać 1 ml buforu EM.
2. Umieścić komorę na stoliku mikroskopu z odwróconą fluorescencją podgrzanym do temperatury 33 °C.
   Uwaga: Ta temperatura jest wybierana jako kompromis między optymalnymi temperaturami zgodnymi z procesem inwazji Shigella a spowolnieniem reakcji Ca²⁺ w celu wizualizacji lokalnych reakcji. Używamy obiektywu z olejkiem immersyjnym 63X (NA = 1,25) wyposażonego w pierścienie kontrastu fazowego.
3. Wybierz pole mikroskopowe i ustaw parametry akwizycji, w tym czas ekspozycji i kategoryzację, jeśli to konieczne, aby zoptymalizować sygnał fluorescencyjny Fluo-4.
   Uwaga: Głównymi wyzwaniami związanymi z lokalnym obrazowaniem Ca²⁺ są niska amplituda i krótki czas trwania odpowiedzi, wymagający akwizycji co najmniej co 30 ms. Kilka dostępnych na rynku kamer EM-CCD lub C-MOS w technologii BSI ma wymaganą czułość do wykrywania lokalnych odpowiedzi Ca²⁺ za pomocą Fluo-4. Czułość wykrywania jest również ważną kwestią w celu ograniczenia fotouszkodzeń lub artefaktów, takich jak spontaniczne reakcje związane ze wzbudzeniem fluorescencyjnym Fluo-4 o wysokiej częstotliwości. W tym przypadku zastosowano oświetlenie oparte na diodach LED o długości fali 470 nm, z filtrem wzbudzenia pasmowo-przepustowym 480 ± 40 nm, filtrem dichroicznym 505 nm oraz emisją pasmowo-przepustową 527 ± 30 nm używaną przy 5% jego maksymalnej intensywności w połączeniu z filtrem o neutralnej gęstości 1,0, aby zminimalizować te problemy w strumieniu akwizycji o ograniczonym czasie trwania. Rutynowo przeprowadzano analizę lokalnych sygnałów Ca²⁺ za pomocą partii strumieni 120 s. W tych warunkach słabego oświetlenia nie zaobserwowano fotowybielania fluoroforu podczas akwizycji 2 min strumienia. Kolejne akwizycje mogą być wykonywane na tej samej próbie, pod warunkiem, że używane są różne pola. Zgodnie z ogólną zasadą, pierwszy strumień akwizycji jest wykonywany na polu kontrolnym przy braku stymulacji bakteryjnej, aby zapewnić brak spontanicznych reakcji. W przypadku zaobserwowania spontanicznych reakcji, próbki przemuje się buforem EM do momentu, gdy nie zaobserwuje się żadnych reakcji.
4. Aby dodać bakterie do próbki, należy usunąć 500 μl buforu EM z komory i dodać 500 μl zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w kroku 1.1.6 w celu uzyskania końcowego OD_{600 nm} wynoszącego 0,05, z odpowiednią ostrożnością, aby uniknąć przesuwania wybranego pola mikroskopowego; objętości zapewniają właściwe wymieszanie bakterii i jednorodne rozmieszczenie bakterii na próbkach komórkowych.
5. Wykonaj akwizycję po dodaniu bakterii. Alternatywnie, należy wykonać akwizycję 10 minut po dodaniu bakterii, co odpowiada czasowi potrzebnemu do osadzania się bakterii na komórkach w zastosowanych warunkach. Na końcu strumienia akwizycji uzyskaj obraz wybranego pola z kontrastem fazowym, aby uwidocznić bakterie stykające się z komórkami i zmarszczki błony związane z miejscami inwazji bakterii.
6. Powtórz procedurę akwizycji, jak w kroku 2.5, w odstępach czasu zależnych od czasu trwania akwizycji obrazu, zapisywania plików i wyboru nowego pola, które obejmuje cały proces.
   Uwaga: W przypadku Shigelli odkryliśmy, że strumienie akwizycji co 5 minut przez 20 minut, po 10-minutowej sedymentacji bakteryjnej, pozwoliły pokryć większość wydarzeń inwazji.
7. Na zakończenie procedury akwizycji dodać końcowe stężenie 2 μM próbek jonoforu jonomycyny^Ca2+ w celu określenia maksymalnej amplitudy sygnałów^Ca2+. Rejestruj obrazy co 3 - 5 s do momentu ustabilizowania sygnału, zwykle przez mniej niż 10 minut.
8. Następnie dodaj chelator Ca²⁺ EGTA o końcowym stężeniu 10 mM w celu określenia sygnału fluorescencji pod nieobecność Ca²⁺. Rejestruj obrazy co 3 - 5 s do momentu ustabilizowania sygnału, zwykle przez mniej niż 10 minut.
   Uwaga: Ze względu na stosunkowo powolną dynamikę globalnych zmian Ca²⁺, akwizycje te wykonuj co 3 - 5 s (nie w trybie strumieniowym), co pozwala na obrazowanie Ca²⁺ w tym samym polu mikroskopowym podczas kolejnych zabiegów.

3. Analiza

1. Wyraż cytozolowe zmiany Ca²⁺ w czasie jako procent ΔF/F₀, gdzie ΔF reprezentuje zmianę średniej intensywności fluorescencji obszaru zainteresowania (ROI), a F₀ wyjściową fluorescencję w tym samym ROI, do którego odejmuje się nieistotny obszar pola pozbawionego komórek.
   1. Usuń podstawowe poziomy fluorescencji dla każdej komórki w różnych polach, odpowiadające poziomom wyjściowym; poziomy te można jednoznacznie określić ze względu na niską częstotliwość i stosunkowo krótki czas trwania lokalnych odpowiedzi Ca²⁺ w danym strumieniu akwizycji.
      Uwaga: Określ ilościowo uderzające cechy odpowiedzi związanych z zadanymi pytaniami i badanym modelem patogennym. Klasycznie do analizy sygnałów Ca^{2 +} brane są pod uwagę różne parametry, w tym częstotliwość komórek wykazujących lokalne lub globalne odpowiedzi Ca²⁺, a także czas trwania, amplituda i częstotliwość tych odpowiedzi. W przypadku Shigella i reakcji lokalnych kolejnym ważnym aspektem analizy jest przestrzenne powiązanie odpowiedzi z miejscami inwazji bakteryjnej.
2. Aby określić ilościowo odsetek reagujących komórek wykazujących odpowiedzi globalne lub lokalne, narysuj ROI w komórkach, w szeregach czasowych odpowiadających zmianom intensywności Fluo-4.
   1. Ustaw ścisłe parametry, aby zidentyfikować lokalne odpowiedzi Ca²⁺, takie jak amplituda trzykrotnie wyższa od zmian tła średniej intensywności fluorescencji komórki lub czas trwania co najmniej 200 ms, aby uniknąć uzyskania wyniku fałszywie dodatniego.
      Uwaga: Z reguły nawet małe lokalne odpowiedzi Ca²⁺ można odróżnić od dowolnego szumu tła na podstawie ich profilu. Zwroty akcji powinny być wystarczająco duże, aby zintegrować wystarczającą ilość sygnałów fluorescencyjnych, aby umożliwić wykrycie lokalnych zmian. W zależności od intensywności detekcji Fluo-4, te ROI mogą odpowiadać okręgom o średnicach w zakresie od 2 do 5 mM.
   2. Zmierz zmiany średniej intensywności fluorescencji Fluo-4 w 2 regionach w odrębnym obszarze tej samej komórki, aby określić, czy odpowiedzi są lokalne czy globalne.
      Uwaga: Analiza dużej liczby komórek jest ułatwiona dzięki zastosowaniu oprogramowania do obrazowania, które umożliwia wyświetlanie na ekranie on-line zmian średniej intensywności fluorescencji w czasie dla wybranych regionów. Dostępne na rynku oprogramowanie do obrazowania ma taką opcję, ale można to również wykonać za pomocą darmowego oprogramowania Ice, za pomocą wtyczki ROI Intensity Evolution.
   3. Określ odsetek komórek wykazujących odpowiedzi lokalne.
      Uwaga: Odsetek ten jest obliczany na podstawie całkowitej liczby komórek analizowanych w polu mikroskopowym, która powinna być w liczbie wystarczającej do potwierdzenia istotności statystycznej za pomocą testu nieparametrycznego.
   4. Określ czas trwania odpowiedzi lokalnych.
      Uwaga: Lokalne odpowiedzi Ca²⁺ można dalej rozróżnić w zależności od ich zakresów czasu trwania (tj. mniej niż 500 ms, od 5 do 10 s lub powyżej 10 s) i ich związku z miejscami inwazji Shigella.
3. Określ ilościowo amplitudę odpowiedzi. Najpierw skalibruj maksymalne poziomy Ca²⁺ i tła komórek określone jak w kroku 2.1.7. Ponieważ obciążenie Fluo-4 może się różnić dla każdej komórki, należy wykonać te oznaczenia dla poszczególnych komórek w terenie.
   1. Wyraź amplitudę odpowiedzi jako względny procent maksymalnej odpowiedzi.
   2. Wykonaj testy statystyczne za pomocą testu normalności, a następnie testu parametrycznego w celu analizy potencjalnych różnic w amplitudzie odpowiedzi między próbkami.
   3. Określ związek tych odpowiedzi w stosunku do miejsc inwazji bakteryjnej przez ich odpowiednią lokalizację w wywołanych przez bakterie zmarszczkach błony, które są wizualizowane na odpowiednich obrazach kontrastu fazowego.

Wyniki

Shigella wywołuje inwazję związaną z nietypowymi, długotrwałymi lokalnymi odpowiedziami Ca²⁺ :

Zgodnie z powyższym protokołem, komórki HeLa obciążone Fluo-4 zostały poddane działaniu WT Shigella, a następnie przeprowadzono akwizycję strumieniową w celu analizy sygnałów Ca²⁺ . Reprezentatywny eksperyment przedstawiono na Rysunku 1, obejmującym serię obrazów time-l...

Dyskusja

Ten manuskrypt opisuje protokół, który opracowaliśmy, aby śledzić lokalne sygnały Ca²⁺ podczas stosunkowo krótkiej kinetyki inwazji Shigella , a także globalne reakcje Ca²⁺ podczas rozszerzonej kinetyki Shigella. Poniżej znajdują się kluczowe kwestie, które należy rozwiązać, aby zoptymalizować wykrywanie sygnałów Ca²⁺ przy jednoczesnej minimalizacji wszelkich zakłóceń w procesach biologicznych.

Chemiczne a genetycznie kodowane sondy Ca

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph wersja 7.7	Uniwersalny system oświetlenia
pE-2	Roper Scientific
mikroczasza 35 mm, wysoka	IBIDI	81156
Rosół sojowy z tryptikazy (TCS)	Thermofisher		B11768
Agar TCS	Thermofisher		B11043
Kongo czerwony	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotyp V. wyrażający adhezynę
ipgD-AfaE	Sun i wsp. 2017	izogeniczny zmutowany szczep ipgD wyrażający adhezynę

CoolLED do obrazowania AfaE AfaE