Method Article

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

DOI:

10.3791/57739

⸱

May 19th, 2018

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Stanford University, 2Department of Materials Science and Engineering, Stanford University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki dwuwymiarowej (2D) hodowli tkankowej były niezbędne dla naszego zrozumienia podstawowej biologii komórki. Jednak tradycyjne systemy hodowli tkankowych 2D nie mają trójwymiarowej (3D) matrycy, co powoduje znaczną rozbieżność między wynikami zebranymi in vitro i in vivo. Aby rozwiązać ten problem, naukowcy zaprojektowali platformy do hodowli tkanek hydrożelowych 3D, które mogą naśladować biochemiczne i biofizyczne właściwości mikrośrodowiska komórkowego in vivo. Badania te zmotywowały potrzebę opracowania platform materiałowych, które wspierają enkapsulację komórek 3D i dalsze testy biochemiczne. Inżynieria białek rekombinowanych oferuje unikalny zestaw narzędzi do projektowania i opracowywania materiałów hydrożelowych 3D, umożliwiając specyficzną kontrolę sekwencji białek, a co za tym idzie, potencjalnych właściwości mechanicznych i biochemicznych powstałej matrycy. W tym miejscu przedstawiamy protokół ekspresji rekombinowanego białka elastynopodobnego (ELP), które można wykorzystać do tworzenia hydrożeli o niezależnie regulowanych właściwościach mechanicznych i stężeniu liganda adhezyjnego w komórkach. Ponadto przedstawiamy metodologię enkapsulacji komórek w hydrożelach ELP, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego osadzonych komórek w celu dalszej analizy i kwantyfikacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatniego stulecia, dwuwymiarowa (2D) hodowla tkanek stała się integralnym zestawem narzędzi do badania podstawowej biologii komórki in vitro. Ponadto stosunkowo tanie i proste protokoły hodowli komórek 2D doprowadziły do jej przyjęcia w wielu dyscyplinach biologicznych i medycznych. Jednak wcześniejsze badania wykazały, że tradycyjne platformy 2D mogą prowadzić do wyników, które znacznie odbiegają od tych zebranych in vivo, powodując marnowanie cennego czasu i funduszy na badania kliniczne1,2,3. My i inni stawiamy hipotezę, że ta rozbieżność może być przypisana brakowi natywnych sygnałów biochemicznych i biofizycznych dostarczanych komórkom hodowanym na powierzchniach 2D, które mogą być niezbędne do optymalnej proliferacji i dojrzewania różnych typów komórek.

Aby rozwiązać te problemy i pomóc wypełnić lukę między badaniami 2D in vitro i in vivo, naukowcy opracowali trójwymiarowe (3D) platformy hydrożelowe do enkapsulacji komórek1,4,5,6. Hydrożele są idealnymi materiałami do rekapitulacji endogennego mikrośrodowiska macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) in vivo ze względu na ich tkankowe właściwości mechaniczne i spuchniętą od wody strukturę, która umożliwia szybki transport składników odżywczych i czynników sygnałowych7,8. Co więcej, hydrożele 3D mogą być zaprojektowane tak, aby miały niezależną kontrolę nad właściwościami mechanicznymi i biochemicznymi rusztowania. Zarówno mechanika macierzy9,10,11,12 oraz ligandy adhezyjne komórek13,14,15 są dobrze znane z wpływania na zachowanie komórek in vitro i in vivo. W ten sposób hydrożele 3D o przestrajalnych właściwościach stanowią platformę do badania związków przyczynowo-skutkowych między komórkami a ich mikrośrodowiskiem. Kryteria idealnej matrycy hydrożelowej 3D obejmują prostą, niecytotoksyczną enkapsulację komórek, a także niezależną możliwość dostrajania fizjologicznie istotnych właściwości mechanicznych i naśladowanie natywnych motywów adhezyjnych komórek.

Zarówno syntetyczne (np. glikol polietylenowy, kwas polimlekowy, poli(kwas glikolowy)) jak i pochodzenia naturalnego (np. alginian, kolagen, Matrigel) hydrożele mają przewagę nad platformami do hodowli 2D in vitro; jednak mają również istotne wady, które ograniczają ich zastosowanie. Po pierwsze, wiele platform syntetycznych i pochodzenia naturalnego wymaga trudnych warunków sieciowania, które mogą być potencjalnie toksyczne dla komórek ssaków, prowadząc do zmniejszenia żywotności komórek7. Ponadto wiele platform syntetycznych nie ma natywnej bioaktywności i musi być funkcjonalizowanych poprzez wtórne reakcje chemiczne, co może zwiększyć koszty i złożoność16. Wreszcie, podczas gdy materiały pochodzenia naturalnego zazwyczaj zawierają wewnętrzne domeny bioaktywne, często są one nękane dużą zmiennością między partiami i często ograniczają się do tworzenia stosunkowo słabych żeli7,17.

Inżynieria białek rekombinowanych prezentuje unikalny zestaw narzędzi do projektowania materiałów, umożliwiając wyraźną kontrolę nad sekwencją białek, a co za tym idzie, potencjalnymi właściwościami mechanicznymi i biochemicznymi końcowego rusztowania hydrożelowego18. Ponadto, dzięki wykorzystaniu dobrze znanej maszynerii biologicznej Escherichia coli (E. coli) do ekspresji białek, materiały mogą być produkowane w sposób ekonomiczny i spójny przy ograniczonej zmienności między i wewnątrz partii. Przedstawione tutaj białko podobne do elastyny (ELP) ma trzy zmodyfikowane domeny: (1) znacznik T7 i His6, który umożliwia znakowanie za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał, (2) region "podobny do elastyny", który nadaje elastyczne właściwości mechaniczne i umożliwia chemiczne sieciowanie, oraz (3) region "bioaktywny", który koduje motywy adhezyjne komórek.

Nasz region podobny do elastyny jest oparty na kanonicznej sekwencji elastyny (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5, gdzie cztery z miejsc aminokwasowych 'Xaa' to izoleucyna (Ile), ale mogą być zaprojektowane tak, aby były dowolnymi aminokwasami z wyjątkiem proliny. Ta sekwencja nadaje rekombinowanym ELP zachowanie niższej temperatury roztworu krytycznego (LCST), które można wykorzystać do prostego oczyszczania po ekspresji za pomocą cykli termicznych19,20. Tę właściwość LCST można dostroić tak, aby agregowała termicznie w różnych temperaturach, modyfikując pozostałość gościa 'Xaa' class21,22.

Tutaj pozycja 'Xaa' na jednym z pięciu powtórzeń podobnych do elastyny została zastąpiona aminokwasem lizyny (Lys), który jest używany do sieciowania hydrożelowego. Nasze poprzednie prace wykazały niecytotoksyczne i odporne sieciowanie poprzez reakcję z aminowo-reaktywnym środkiem sieciującym tetrakis(hydroksymetylo)fosfonium chlorek (THPC)23. Różnicując ogólną zawartość białka i stężenie środka sieciującego, jesteśmy w stanie wyprodukować hydrożele, które można dostroić tak, aby obejmowały fizjologicznie istotny zakres sztywności (~0,5-50 kPa)9,23,24. Oprócz dostrajania właściwości mechanicznych, adhezja komórek w hydrożelu wynika z integracji kanonicznych domen adhezyjnych komórek w szkielecie białka ELP. Na przykład włączenie rozszerzonej sekwencji aminokwasowej "RGDS" pochodzącej z fibronektyny pozwala na adhezję komórek i elastyczność konformacyjną, podczas gdy zaszyfrowany, niewiążący wariant "RDGS" ogranicza adhezję macierzy komórkowej24. Modulując stosunek białek adhezyjnych do nieadhezyjnych, a także całkowite stężenie białka, jesteśmy w stanie skutecznie wytwarzać hydrożele, które obejmują szeroki zakres stężeń ligandów. W rezultacie opracowaliśmy platformę hydrożelową o rozłącznych właściwościach biochemicznych i biofizycznych, którą można niezależnie dostroić w celu uzyskania optymalnej hodowli 3D różnych typów komórek.

Oprócz sztywności matrycy i możliwości przestrajania ligandów adhezyjnych, rekombinowane hydrożele oferują możliwość projektowania określonych profili degradacji materiału, co jest niezbędne do rozprzestrzeniania się komórek, proliferacji i migracji w kontekście 3D4,9. Degradacja ta jest spowodowana wydzielaniem przez komórki proteaz, które są specyficznie ukierunkowane na rozszerzony 'RGDS'9 lub sekwencję podobną do elastyny25. Wykazano również, że hydrożele ELP wspierają późniejsze testy biochemiczne, które są niezbędne do badania żywotności i funkcji komórek, w tym immunocytochemii, a także ekstrakcji DNA/RNA/białka w ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) i Western blot9. Warianty ELP były również stosowane w wielu modelach in vivo i wiadomo, że są dobrze tolerowane przez układ odpornościowy26.

Podsumowując, ELP jako platforma materiałowa do badań nad enkapsulacją komórek oferuje szeroki wachlarz korzyści w porównaniu do platform materiałów syntetycznych lub pochodzenia naturalnego, które często nie mają tego samego stopnia biochemicznej i biofizycznej przestrajania i odtwarzalności. Dodatkowo, proste i niecytotoksyczne zastosowanie ELP z szeroką gamą typów komórek (np. zwoje korzenia grzbietowego piskląt14,24, mysie neuronalne komórki progenitorowe9, ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste27, chondrocyty noworodków bydła28, ludzkie komórki śródbłonka29,30) pozwala na opracowanie bardziej fizjologicznie istotnego modelu endogennego ECM 3D w porównaniu z hodowlą komórkową 2D. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół ekspresji rekombinowanych ELP do stosowania jako przestrajalna platforma hydrożelowa do enkapsulacji komórek 3D. W dalszej części przedstawiamy metodologię znakowania fluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej komórek otorbionych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protokół wyrażeń ELP

  1. Dzień 1: Hodowla kolonii startowej
    1. Przygotować płytki agarowe z ampicyliną i chloramfenikolem przez autoklawowanie 25 g bulionu Luria i 15 g agaru na 1 l ultraczystej wody. Gdy roztwór ostygnie do ~60 °C, dodaj 1 ml bulionu ampicyliny (100 mg/ml w ultraczystej wodzie) i 1 ml bulionu chloramfenikolu (34 mg/ml w 70% etanolu) do 1 l roztworu agaru dla końcowych stężeń odpowiednio 100 μg/ml i 34 μg/ml. Przenieść 20 ml końcowego roztworu na 10 cm szalki Petriego za pomocą pipety serologicznej i pozostawić agar do zestalenia się. Owinąć szalki Petriego parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Szalki Petriego można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
    2. Na płytce agarowej z ampicyliną i chloramfenikolem należy pobrać małą próbkę BL21(DE3)pLysS E. coli z gotowego preparatu bakteryjnego zawierającego wektor pET15b kodujący interesujący nas ELP.
      UWAGA: Ampicylina i chloramfenikol są wybierane do bakterii zawierających odpowiednio wektory pET15b i pLysS.
    3. Umieścić płytkę z prążkami do góry nogami w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Pozwolić koloniom bakterii rosnąć przez noc.
      UWAGA: Nie inkubuj płytek dłużej niż 16 godzin, ponieważ ampicylina ulegnie degradacji i mogą powstać kolonie, które nie są odporne na ampicylinę.
  2. Dzień 2: Przygotowanie kultury starterowej i pożywki do odciągania pokarmu
    1. Usunąć kulturę E. coli z inkubatora. Sfilmować płytkę i przechowywać maksymalnie przez 4 dni w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować kolbę do kultur starterowych (250 ml) i kolby do hodowli ekspresji (12 x 1 l) i umieścić w autoklawie. Na 1 l pożywki ekspresyjnej dodać 47,6 g wspaniałego bulionu i 4 ml glicerolu do 1 l ultraczystej wody w kolbie hodowlanej o pojemności 2 litrów z przegrodą i przykryć folią aluminiową.
      UWAGA: Typowe plony to 60-100 mg/L białka pożywki ekspresyjnej.
    3. Załadować autoklawowany starter do wstępnie ogrzanego inkubatora z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C i inkubować bez mieszania.
    4. Dodać 250 μl sterylnie przefiltrowanej (filtr 0,22 μm) wywaru ampicyliny (100 mg/ml w ultraczystej wodzie) do kultury starterowej, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μg/ml. Natychmiast rozpocznij mieszanie kultury starterowej przy 250 obr.
      UWAGA: Chloramfenikol jest używany tylko do selekcji kolonii na płytkach agarowych i nie jest uwzględniony w kulturach płynnych.
    5. Zaszczepić kulturę starterową, dodając pojedynczą kolonię E. coli zawierającą plazmid ELP z płytki z prążkami i pozostawić kulturę starterową do wstrząsania w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
    6. Umieścić kolby z ekspresyjną pożywką hodowlaną we wstępnie ogrzanych inkubatorach wytrząsających o temperaturze 37 °C i inkubować przez noc bez mieszania, tak aby kolby były gotowe do zaszczepienia następnego ranka.
  3. Dzień 3: Indukowanie ekspresji białka u E. coli
    1. Przygotuj świeży, sterylnie przefiltrowany wywar ampicyliny (100 mg/ml w ultraczystej wodzie). Dodać 1 ml bulionu ampicyliny do każdej kolby z pożywką do wyrażania, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μg/ml.
    2. Rozpocząć mieszanie pożywki z prędkością 250 obr./min.
    3. Pobrać próbkę pożywki o objętości 2 ml z dowolnej kolby ekspresyjnej i dodać do kuwety jako ślepą próbę w celu odczytu gęstości optycznej przy długości fali 600 nm (OD600).
    4. Po zakończeniu 16-godzinnej inkubacji kultury starterowej, zaszczepić każdą kolbę odciągową, przenosząc 20 ml kultury starterowej do każdej kolby odciągowej za pomocą pipety serologicznej.
    5. Po zakończeniu 1-godzinnego mieszania zmierzyć średnicę zewnętrzną600 jednej z kolb ekspresyjnych. Postępując zgodnie z tym krokiem, mierzyć średnicę zewnętrzną600 co 20 minut, za każdym razem sprawdzając inną kolbę.
    6. Przy średnicy zewnętrznej600 wynoszącej 0,6 obniżyć temperaturę wytrząsarek zawierających kolby ekspresyjne do 32 °C.
    7. Sprawdzaj OD600 co 10 minut. Przy OD600 0,8 wywołać ekspresję przez dodanie 1 ml 1 M, sterylnie przefiltrowanego β-izopropylotiogalaktozydu (IPTG) w ultraczystej wodzie do każdej kolby ekspresyjnej.
    8. Pozostawić E. coli w kolbach do odciągania pokarmu przez 7 godzin.
    9. Na 20 minut przed zakończeniem odciągania należy wstępnie schłodzić dużą wirówkę podłogową do temperatury 4 °C.
    10. Zebrać wszystkie 12 l pożywki do oddzielnych pojemników wirówkowych i zrównoważyć.
    11. Odwirować pożywkę do wyrażania pokarmu o sile 12 000 x g > przez 15 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki podłogowej.
    12. Odlać supernatant z każdego pojemnika wirówkowego. Za pomocą szpatułki zbierz granulki komórek do wstępnie zważonej torby z zamkiem błyskawicznym.
    13. Ponownie zawiesić osad w sterylnie przefiltrowanym buforze TEN (100 ml buforu na 25 g osadu) i usunąć nadmiar pęcherzyków powietrza poprzez masowanie osadu. Na 1 l buforu TEN dodać 5,8 g chlorku sodu, 1,21 g zasady tris i 0,37 g dwuwodnej soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do 900 ml ultraczystej wody. Dostosuj pH do 8,0 i doprowadź do 1 l. Na tym etapie wystarczą paski pH.
    14. Umieścić worek strunowy zawierający ponownie zawieszone osady komórkowe w pojemniku wtórnym i zamrozić w temperaturze -80 °C przez noc.
  4. Dzień 4-6: Pęknięcie ściany komórkowej bakterii poprzez cykle zamrażania i rozmrażania
    1. Wyjąć zamrożone granulki z zamrażarki i pozostawić do powolnego rozmrożenia w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając za pomocą wytrząsarki orbitalnej.
    2. Pozwól granulce rozmrozić się, aż pojawi się trochę płynu. Dodać ~30-40 mg dezoksyrybonukleazy I (DNazy) do rozmrożonego lizatu. Dodatkowo dodać 1 ml 100 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF; inhibitor proteazy) w izopropanolu na 100 ml lizatu komórkowego. Pozostaw lizat do wstrząśnięcia przez noc.
      UWAGA: Dodanie DNazy i PMSF jest konieczne tylko w pierwszym cyklu zamrażania-rozmrażania.
      UWAGA: PMSF jest toksyczny w przypadku wdychania. Podczas obchodzenia się z proszkiem PMSF należy używać maski na twarz.
    3. Po całkowitym rozmrożeniu lizatu komórkowego należy go zamrozić w temperaturze -80 °C przez noc lub do całkowitego zamrożenia.
    4. Powtórz procedurę zamrażania i rozmrażania, w sumie przez trzy cykle. Pozostawić lizat rozmrożony w temperaturze 4 °C po ostatnim zamrożeniu i rozmrożeniu. Przechowywać 100 μl surowego lizatu do analizy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) po zakończeniu oczyszczania.
    5. Po ostatnim rozmrożeniu dostosować pH rozmrożonego lizatu do 9,0 za pomocą 1 M NaOH. Na tym etapie wystarczą paski pH. Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 godzinę (właściwą jest noc) na wytrząsarce orbitalnej.
  5. Dzień 7-9: Oczyszczanie ELP za pomocą cykli termicznych wirowania na zimno i na gorąco
    1. Schłodzić wirówkę podłogową do temperatury 4 °C na 20 minut przed wirowaniem.
    2. Podwielokrotność rozmrożonego lizatu rozprowadzić i zrównoważyć do pojemników wirówkowych.
    3. Odwirować próbki w temperaturze >15 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu oczyszczania przechowywać 100 μl supernatantu do analizy SDS-PAGE.
      UWAGA: Po odwirowaniu białko ELP powinno pozostać w supernatancie ze względu na jego wysoką rozpuszczalność w wodzie w temperaturach poniżej jego LCST (<32 °C).
    4. Przenieść supernatant do nowych pojemników wirówkowych i odpowiednio zważyć.
    5. Dodać chlorek sodu (NaCl) w trzech częściach do końcowego stężenia 1 M (5,84 g NaCl na każde 100 ml supernatantu). Upewnij się, że NaCl jest dodawany w trzech częściach, aby umożliwić wystarczające rozpuszczenie.
    6. Mieszać przez 3 godziny w temperaturze 37 °C przy 250 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.
    7. Na 1 godzinę przed zakończeniem mieszania podgrzać wirówkę podłogową do temperatury 37°C.
    8. Wirować w temperaturze >15 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu oczyszczania przechowywać 100 μl supernatantu do analizy SDS-PAGE i wyrzucić pozostały supernatant.
      UWAGA: Po odwirowaniu białko ELP należy granulować ze względu na jego niską rozpuszczalność w wodzie w temperaturach powyżej jego LCST (>32 °C).
    9. Ponownie zawiesić osad, dodając 10 ml autoklawowanej, ultraczystej wody na 1 g granulki. Użyj metalowej szpatułki, aby rozgnieść granulkę, aby pomóc w rozpuszczeniu białka.
    10. Dostosować pH rozmrożonego lizatu do 9,0 za pomocą 1 M NaOH. Na tym etapie wystarczą paski pH.
    11. Mieszać przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej.
    12. Powtórzyć procedurę cyklicznych wirowania termicznego na zimno i na gorąco, łącznie przez trzy cykle (tj. powtórzyć kroki od 1.5.1 do 1.5.11 dla łącznie trzech cykli).
  6. Dzień 10-15: Dializa i liofilizacja ELP
    1. Ponownie zawieszony osad należy odwirować w wirówce wstępnie schłodzonej w temperaturze >15 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu oczyszczania należy przechowywać 100 μl supernatantu do analizy SDS-PAGE.
    2. Roztwór białkowy należy odsalać, dializując pozostały supernatant w membranie dializacyjnej o natężeniu 3,5 kDa w porównaniu z 4 litrami wstępnie schłodzonej ultraczystej wody o temperaturze 4 °C. Wodę do dializy należy zmieniać dwa razy dziennie, w sumie 6 razy w ciągu 3 dni.
      UWAGA: Typowe objętości supernatantu wynoszą od 5 do 30 ml.
    3. Odwirować dializowany roztwór we wstępnie schłodzonej wirówce o sile 15 000 x g > przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Przechowywać 100 μl supernatantu do analizy SDS-PAGE po zakończeniu oczyszczania.
    4. Otrzymany supernatant zamrozić w temperaturze -80 °C w uprzednio zważonych stożkowych probówkach.
    5. Liofilizuj zamrożony roztwór przez 3 dni i zmasuj produkt końcowy, aby określić wydajność białka.
    6. Parafilmować probówki zawierające końcowy liofilizowany produkt ELP i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    7. Uruchom SDS-PAGE, aby określić czystość białka.
      UWAGA: Protokoły dla SDS-PAGE będą się różnić w zależności od konkretnych warunków żelu agarozowego. W naszych eksperymentach końcowe liofilizowane białko rozpuszczono do stężenia 0,5 mg/ml w wodzie dejonizowanej i uruchomiono pod napięciem 140 V przez 70-100 minut w 12% (w/v) żelu akrylowym w warunkach denaturacji.

2. Enkapsulacja komórek w hydrożelach białkowych 3D podobnych do elastyny

  1. Przygotowanie form silikonowych
    1. Użyj dziurkacza do biopsji o pożądanej średnicy, aby wykonać otwory w arkuszu silikonowym o grubości 0,5 mm i wyciąć kwadrat wokół każdego otworu. Powtórz dla żądanej liczby foremek.
      UWAGA: Średnicę i grubość form można dostosować do konkretnego zastosowania i warunków hodowli komórkowej. W praktyce w przypadku kultur komórkowych o wielkości 50 106 komórek/ml zaleca się stosowanie form o grubości 0,5 mm i średnicach 4 mm i 5 mm w celu ekstrakcji odpowiednio DNA/RNA i białka. Do barwienia immunologicznego można zamiast tego użyć stempla do biopsji o średnicy 2 mm, aby utworzyć trzy sąsiednie otwory na kwadratową formę, tak aby można było wybarwić trzy powtórzenia w każdym dołku.
    2. Usuń plastikową folię z każdej strony pojedynczej formy za pomocą pęsety.
      UWAGA: Unikaj kontaktu z odsłoniętą powierzchnią silikonu, ponieważ zanieczyszczenie może zmniejszyć przyszłą wydajność łączenia plazmowego.
    3. Za pomocą pęsety ułóż taką samą liczbę gołych silikonowych foremek i szklanych szkiełek nakrywkowych (nr 1, średnica 12 mm) w naprzemiennych rzędach na odwróconej pokrywie 48-dołkowej płytki. Po zakończeniu przykryj pokrywę płytki 48-dołkowej, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    4. Plazma tlenowa traktuje całą 48-dołkową pokrywę płytki (tj. formy i szkiełka podstawowe). Natychmiast po tym użyj kleszczy, aby odwrócić silikonową formę na sąsiednie szklane szkiełko nakrywkowe. Mocno dociśnij formę, aby zapewnić połączenie. Pozwól pleśniom inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godz.
      UWAGA: Czas trwania obróbki plazmą tlenową będzie się różnić w zależności od używanego instrumentu. Typowe warunki dla naszego instrumentu to robocze okno ciśnienia gazu w zakresie 0,3-4 mbar, przepływ tlenu gazowego z prędkością 20 cm3/min oraz wystawienie próbki na działanie plazmy przez 10-20 s.
    5. Wysterylizuj formy przez autoklawowanie. Przechowuj formy w temperaturze pokojowej w sterylnym środowisku do czasu użycia.
      UWAGA: Formy można przechowywać na tym etapie w nieskończoność.
  2. Przygotowanie roztworu podstawowego białka podobnego do elastyny
    1. Usunąć liofilizowany ELP z miejsca przechowywania w temperaturze 4 °C. Podgrzej białko do temperatury pokojowej przed otwarciem tubki, aby upewnić się, że przy wielokrotnym użyciu na białku nie tworzy się kondensacja.
    2. Rozpuścić ELP w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco w temperaturze 4 °C, przy stałym mieszaniu (tj. wirowaniu) przez noc.
      UWAGA: Stężenie roztworu podstawowego ELP zostanie dodatkowo rozcieńczone przez dodanie roztworu sieciującego w zdefiniowanym przez użytkownika stosunku objętościowym. Na przykład, aby uzyskać końcowe stężenie ELP na poziomie 3% (w/v), należy przygotować roztwór podstawowy ELP o stężeniu 3,75% (m/v), który zostanie rozcieńczony w stosunku objętościowym 4:1 roztwór ELP do roztworu sieciującego. Dostosuj stężenie w razie potrzeby do pożądanej aplikacji.
    3. Sterylny roztwór podstawowy ELP z filtrem strzykawkowym 0,22 μm. Przechowuj ELP na lodzie, gdy nie jest używany.
  3. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przenieś sterylne formy za pomocą sterylnej pęsety na 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej.
  4. Przygotowanie roztworu podstawowego THPC
    1. Rozcieńczyć THPC w DPBS tuż przed użyciem. Dostosuj stężenie roztworu THPC do końcowego stężenia ELP i pożądanego współczynnika sieciowania.
      UWAGA: Zgodnie z protokołem, końcowe stężenie ELP wynoszące 3% (w/v) zostanie uzyskane przez zmieszanie roztworu podstawowego ELP z roztworem THPC w stosunku objętościowym 4:1. Dostosuj w razie potrzeby.
    2. Dodaj 2,6 μl roztworu THPC (80% w wodzie) do 997,4 μl DPBS.
      UWAGA: To stężenie THPC odpowiada stosunkowi stechiometrycznemu 1:1 grup hydroksylowych na THPC i pierwszorzędowych amin na białku ELP podczas mieszania roztworów w opisanym stosunku objętościowym 4:1 dla końcowego 3% (w/v) hydrożelu ELP. Roztwór THPC jest lepki, a kropelki roztworu mogą przyklejać się do boku końcówki pipety. Aby uzyskać dokładne stężenia, należy unikać takich kropelek podczas rozcieńczania do DPBS. Opróżnij pojemnik podstawowy THPC gazowym azotem, aby zapobiec utlenianiu fosforowodu i dezaktywacji środka sieciującego.
    3. Zmieszaj roztwór, aby wymieszać i utrzymać na lodzie.
    4. Sterylnie przefiltrować roztwór podstawowy THPC za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Rozcieńczyć roztwór podstawowy THPC sterylnym DPBS, aby uzyskać niższe stechiometryczne współczynniki sieciowania (np. 0,5:1 lub 0,75:1).
      UWAGA: THPC jest wrażliwy na tlen, a rozcieńczony roztwór należy zużyć w ciągu kilku godzin po przygotowaniu.
  5. Dysocjuj komórki przez inkubację z trypsyną-EDTA do zawiesiny jednokomórkowej, zagnieżdż komórki i policz komórki ponownie zawieszone w pożywce za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: Dokładne protokoły dla tego kroku będą w dużym stopniu zależeć od pożądanego typu komórki i zastosowania. W przypadku nerwowych komórek progenitorowych wykorzystywanych w tym protokole przeprowadzono inkubację 0,025% trypsyny-EDTA w temperaturze pokojowej przez 1,5 minuty. Komórki granulowano w temperaturze 200 x g przez 2 min. Aby zwiększyć żywotność komórek, komórki powinny być zawieszone w normalnych warunkach podłoża. Typowe gęstości komórek stosowane do enkapsulacji komórek wahają się od 1 - 50 106 komórek/ml końcowej objętości hydrożelu. Dostosuj w razie potrzeby.
  6. Porcję pożądanej liczby komórek umieścić w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  7. Odwirować komórki przy ~200 x g przez 3 min. Ostrożnie odessać supernatant i utrzymać osad komórek na lodzie.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby całkowicie zassać cały supernatant, aby złagodzić dalsze rozcieńczenie środka sieciującego ELP i THPC. Konkretne prędkości wirowania będą się różnić w zależności od typu komórki.
  8. Ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze podstawowym ELP tak, aby objętość wynosiła 80% objętości końcowej (przy założeniu stosunku 4:1 roztwór ELP do roztworu THPC). Odpipetować 20-25 razy, aby uzyskać jednorodną mieszaninę komórek i ELP.
    UWAGA: Unikaj chwytania za spód rury, aby złagodzić wzrost temperatury i późniejsze przejście fazowe ELP. Każda forma o średnicy 2 mm z trzema powtórzeniami wymaga 7,5 μl końcowej objętości (tj. 6 μl roztworu podstawowego ELP i 1,5 μl roztworu podstawowego THPC) podzielonych równo na 3 otwory (tj. 2,5 μl końcowej objętości na otwór). W przypadku form 4 i 5 mm wymagana jest końcowa objętość odpowiednio 7,5 μl i 15,5 μl.
  9. Dodać roztwór podstawowy THPC do zawiesiny komórki/ELP dla pozostałych 20% objętości końcowej. Odpipetować 20-25 razy, aby uzyskać jednorodną mieszaninę.
  10. Natychmiast odpipetować odpowiednie końcowe objętości mieszaniny komórek/ELP/THPC do każdej formy ruchem okrężnym. Powtórz dla wszystkich foremek.
  11. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, a następnie dodatkowo inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut
    UWAGA: Pierwszy okres inkubacji ułatwi początkowe sieciowanie hydrożelu przed zwiększeniem temperatury do temperatury powyżej LCST ELP i wywołaniem jego termicznej segregacji fazowej.
  12. Powoli dodawać 750 μl pożywki do hodowli ciepłokomórkowych do każdego dołka 24-dołkowej płytki, unikając rozerwania żeli.
  13. Inkubować hydrożele w temperaturze 37 °C przez 7 dni.
    UWAGA: Zaleca się pełną wymianę pożywki co 1-2 dni, w zależności od typu ogniwa. Aby ograniczyć naprężenia żelu, podczas zasysania medium ze studzienki należy użyć szklanej pipety Pasteura przymocowanej końcówką do pipety o pojemności 200 μl.

3. Immunocytochemia komórek w hydrożelach 3D ELP

  1. Przygotować roztwór utrwalający, mieszając 10 ml 16% (w/v) paraformaldehydu (PFA) w 30 ml DPBS. Podgrzać roztwór do temperatury 37 °C.
  2. Odessać pożywkę z płytki 24-dołkowej i delikatnie przemyć 1 ml DPBS.
  3. Dodać 750 μl roztworu utrwalającego do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Nie używaj inkubatora do hodowli tkankowych, aby uniknąć zanieczyszczenia innych kultur parami PFA.
  4. Ostrożnie zassać roztwór utrwalający z każdej studzienki, wyrzucając PFA do odpowiedniego pojemnika na odpady niebezpieczne.
    UWAGA: Narażenie na PFA może powodować podrażnienie skóry i oczu. Nosić rękawice/okulary ochronne i pracować w osłonie przeciwchemicznej.
  5. Dodać 1 ml DPBS do każdej próbki. Natychmiast zassać DPBS i wyrzucić do pojemnika na odpady PFA.
  6. Przemyć próbki dwukrotnie 1 ml DPBS przez 10 minut każda.
    UWAGA: Próbki można przechowywać w DPBS w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia po uszczelnieniu płytki Parafilmem.
  7. Każdą próbkę należy przepuścić za pomocą 750 μl roztworu do przepuszczalności (100 ml DPBS i 0,25 ml Triton X-100; PBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na bujaku przy 15 obr./min.
  8. Odessać PBST i dodać 750 μl roztworu blokującego (95 ml PBS, 5 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 5 ml surowicy i 0,5 ml Triton X-100) do każdej próbki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 godziny na bujaku z prędkością 15 obr./min.
    UWAGA: Roztwór blokujący powinien zawierać surowicę pochodzącą od gatunku gospodarza, w którym wyhodowano przeciwciała drugorzędowe (np. koza, osioł) i przed użyciem przefiltrowano sterylnie przez filtr 0,22 μm.
  9. Przygotować roztwór rozcieńczający przeciwciała (97 ml DPBS, 2,5 g BSA, 2,5 ml surowicy (od tego samego gatunku gospodarza, co w kroku 3.8) i 0,5 ml Triton X-100). Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe roztworem rozcieńczającym przeciwciała i dodać 500 μl roztworu do każdej próbki. Uszczelnić płytkę preparatem Parafilm i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na bujaku.
    UWAGA: Przeciwciała pierwszorzędowe Nestin i Sox2 rozcieńczono w stosunku 1:400 w roztworze rozcieńczającym przeciwciała od pierwotnego stężenia producenta.
  10. Odessać roztwór przeciwciała z każdej próbki i przemywać próbki PBST przez 60 minut w temperaturze pokojowej na kołysce z prędkością 15 obr./min. Powtórz krok prania 3 razy.
  11. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe i 5 mg/ml podstawowego DAPI (1:2 000) za pomocą roztworu rozcieńczającego przeciwciała i dodać 500 μl roztworu do każdej próbki. Przykryć 24-dołkową płytkę folią aluminiową i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na kołysce.
    UWAGA: Ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło, próbki muszą być chronione przed fotowybielaniem na wszystkich kolejnych etapach. Drugorzędowe przeciwciała przeciw myszom i królikom rozcieńczono w stosunku 1:500 w roztworze rozcieńczającym przeciwciała od pierwotnego stężenia producenta.
  12. Odessać roztwór przeciwciała z każdej próbki i przemywać próbki PBST przez 30 minut w temperaturze pokojowej na kołysce. Powtórz krok prania 3 razy.
  13. Umieść kroplę twardego medium montażowego na powierzchni szkiełka podstawowego. Za pomocą kleszczy usuń nadmiar roztworu z formy, lekko ocierając krawędź formy o ręcznik papierowy. Ostrożnie umieść formę do góry nogami na podłożu montażowym i unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza.
  14. Pozostawić medium montażowe do stwardnienia przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub 4 °C. Przed obrazowaniem należy pozostawić podłoże montażowe do całkowitego zastygnięcia przez 48 godzin, ponieważ współczynnik załamania światła ośrodka będzie się zmieniał w trakcie twardnienia. Uszczelnij próbki do szkiełka przezroczystego lakieru do paznokci, aby złagodzić zanieczyszczenie lub ruch próbki.
  15. Zobrazuj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ELP używane w tym protokole składają się z pięciu regionów: znacznika T7, znacznika His6, miejsca cięcia enterokinazy (EK), regionu bioaktywnego i regionu podobnego do elastyny (Rysunek 1). Znaczniki T7 i His6 pozwalają na łatwą identyfikację za pomocą standardowych technik Western blot. Wprowadzenie miejsca rozszczepienia EK pozwala na enzymatyczne usunięcie obszaru znacznika, jeśli zajdzie taka potrzeba. Region bioaktywny koduje wydłużone sekwencje kleju komórkowego ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rekombinowana ekspresja i oczyszczanie białek jest potężnym narzędziem do syntezy biomateriałów o wysokiej odtwarzalności. W dużej mierze ze względu na pojawienie się skomercjalizowanego klonowania molekularnego, niestandardowe rekombinowane plazmidy można kupić od kilku dostawców, co znacznie skraca czas pracy z materiałami takimi jak ELP. Podobnie, plazmidy można zamówić bezpośrednio w laboratorium, z którego pochodzą, gdy oryginalna praca była wspierana przez umowę federalną, a przyszłe prace będą przeznaczone do użyt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują T. Palmerowi i H. Babu (Stanford Neurosurgery) za dostarczenie mysich NPC. Grafika wektorowa w Rysunek 4 został użyty i zaadaptowany z Servier Medical Art na licencji Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/legalcode). Część tych prac została wykonana w Stanford Nano Shared Facilities (SNSF), wspieranym przez National Science Foundation w ramach nagrody ECCS-1542152. N.A.S. potwierdza wsparcie ze strony Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia (32GM008412). C.M.M. dziękuje za wsparcie ze strony stypendium przeddoktoranckiego NIH NRSA (F31 EB020502) oraz programu Siebel Scholars Program. S.C.H. dziękuje za wsparcie ze strony National Institutes of Health (U19 AI116484 i R21 EB018407), National Science Foundation (DMR 1508006) oraz California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Badania te otrzymały finansowanie od Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T), który jest wspierany przez Narodowy Instytut Zdrowia Dziecka i Rozwoju Człowieka im. Eunice Kennedy Shriver (NICHD), Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NINDS) oraz Narodowy Instytut Obrazowania Biomedycznego i Bioinżynierii (NIBIB) Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody numer P2CHD086843. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one poglądy National Institutes of Health.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
elastynopodobna ekspresja i oczyszczanie białek
10 cm Szalki PetriegoThermo Fisher ScientificFB0875713
70% etanoluRICCA Chemical2546.70-1
Siarczan amonuSigma-AldrichA3920-500G
AmpicylinaThermo Fisher ScientificBP1760-25G
Agar BactoThermo Fisher Scientific9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS Kompetentne komórkiInvitrogenC606003
ChloramfenikolAmresco0230-100G 
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcejSigma-AldrichDN25
EDTA sól disodowa, dwuwodnaThermo Fisher ScientificO2793-500
GlicerolThermo Fisher ScientificBP229-4
IzopropanolThermo Fisher ScientificA451-4
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG) Thermo Fisher ScientificBP1755-10G
Bulion LuriaEMD Millipore1.10285.5007
ParafilmVWR52858-000
Fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF)MP Biomedicals195381
Chlorek soduThermo Fisher ScientificBP358-212
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS 8045-1KG
Filtr strzykawkowy (0,22 μ m)MilliporeSLGP033RB
Terrific BulionMillipore71754-4
Tris BaseThermo Fisher ScientificBP152-1
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrożele
0,22 μ m filtry strzykawkoweMilliporeSLGV004SL
arkusz silikonowy o grubości 0,5 mmMikroskopia elektronowa Science70338-05
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych Jednorazowy
(2 mm)Integra Miltex33-31
(4 mm)Integra Miltex33-34
(5 mm)Integra Miltex33-35
Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) Corning21-031-CM
No. 1 Szkiełka nakrywkowe szklane 12 mmThermo Fisher Scientific12-545-80
Chlorek tetrakis(hydroksymetylo)fosfoniowy (THPC)Sigma-Aldrich404861-100ML
0,5% Tryspin/EDTAThermo Fisher 15400054
Immunocytochemia komórek w hydrożelach 3D ELP
16% (w/v) Paraformaldehyd (PFA)Mikroskopia elektronowa Nauki15701
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Roche3116956001
DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)Sondy molekularneD1306 
Surowica osłaLampire Biological Labs7332100
Przeciwciało wtórne przeciwko myszom kozi (AF488)Sondy molekularneA-11017
Przeciwciało wtórne kozy przeciwko królikowi (AF546)Sondy molekularneA-11071
Surowica koziaGibco16210-072
Gniazdo myszy Pierwotne przeciwciałoBD Pharmingen556309
Mouse Sox2 PrimaryAntibody Cell Signaling Technology23064S
Lakier do paznokciMikroskopia elektronowa Sciences72180
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium Vector LabsH-1400 
dziurkacz do biopsji Corning 353047 Jednorazowy dziurkacz do biopsji Jednorazowy dziurkacz do biopsji

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  7. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  8. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  9. Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
  10. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  11. Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178(2012).
  12. Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
  13. Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
  14. Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
  15. Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
  16. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
  17. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  18. DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
  19. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  20. Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
  21. McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
  22. McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
  23. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
  24. Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
  25. Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
  26. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  27. Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
  28. Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
  29. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
  30. Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
  31. Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
  32. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  33. Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
  34. Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastin like ProteinHydrogel FormationCell EncapsulationImmunofluorescent StainingProtein PurificationConfocal MicroscopySDS PAGE AnalysisWestern BlotNeural Progenitor CellsExtracellular Matrix

Related Articles