Artykuł metodologiczny

Edycja genu CRISPR/Cas9 w celu stworzenia warunkowych mutantów ludzkiego pasożyta malarii P. falciparum

DOI:

10.3791/57747

⸱

18 września 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Biology, University of Georgia, 2Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę generowania mutantów warunkowego knockdown opartych na glmS w Plasmodium falciparum przy użyciu edycji genomu CRISPR/Cas9.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Ta choroba, która dotyka przede wszystkim osoby żyjące w regionach tropikalnych i subtropikalnych, jest spowodowana zakażeniem pasożytami Plasmodium. Opracowanie skuteczniejszych leków do walki z malarią może zostać przyspieszone dzięki lepszemu zrozumieniu biologii tego złożonego pasożyta. Manipulacja genetyczna tymi pasożytami jest kluczem do zrozumienia ich biologii; jednak historycznie genom P. falciparum był trudny do manipulowania. Ostatnio edycja genomu CRISPR/Cas9 została wykorzystana w pasożytach malarii, co pozwala na łatwiejsze znakowanie białek, generowanie warunkowych knockdownów białek i delecję genów. Edycja genomu CRISPR/Cas9 okazała się potężnym narzędziem do rozwoju badań nad malarią. W tym miejscu opisujemy metodę CRISPR/Cas9 do generowania mutantów warunkowego knockdown opartych na glmS u P. falciparum. Metoda ta jest wysoce adaptowalna do innych rodzajów manipulacji genetycznych, w tym znakowania białek i nokautowania genów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria jest wyniszczającą chorobą wywoływaną przez pasożytnicze pierwotniaki z rodzaju Plasmodium. P. falciparum, najbardziej śmiercionośny pasożyt malarii u ludzi, powoduje około 445 000 zgonów rocznie, głównie u dzieci poniżej piątego roku życia1. Pasożyty Plasmodium mają skomplikowany cykl życiowy obejmujący wektora komara i żywiciela kręgowców. Ludzie po raz pierwszy zarażają się, gdy zakażony komar spożywa posiłek z krwi. Następnie pasożyt atakuje wątrobę, gdzie rośnie, rozwija się i dzieli przez około tydzień. Po tym procesie pasożyty są uwalniane do krwiobiegu, gdzie przechodzą replikację bezpłciową w czerwonych krwinkach (RBC). Wzrost pasożytów w erytrocytach jest bezpośrednio odpowiedzialny za objawy kliniczne związane z malarią2.

Do niedawna produkcja transgenicznego P. falciparum była pracochłonnym procesem, obejmującym kilka rund selekcji leków, które trwały wiele miesięcy i miały wysoki wskaźnik niepowodzeń. Ta czasochłonna procedura opiera się na generowaniu losowych pęknięć DNA w obszarze zainteresowania i endogennej zdolności pasożyta do naprawy swojego genomu poprzez naprawę homologiczną3,4,5,6. Ostatnio edycja genomu Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) została z powodzeniem wykorzystana w P. falciparum7,8. Wprowadzenie tej nowej technologii do badań nad malarią miało kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia biologii tych śmiertelnych pasożytów Plasmodium. CRISPR/Cas9 pozwala na specyficzne celowanie w geny za pomocą przewodnikowych RNA (gRNA), które są homologiczne do genu będącego przedmiotem zainteresowania. Kompleks gRNA/Cas9 rozpoznaje gen poprzez gRNA, a Cas9 następnie wprowadza pęknięcie dwuniciowe, wymuszając inicjację mechanizmów naprawczych w organizmie9,10. Ponieważ P. falciparum nie ma mechanizmów do naprawy pęknięć DNA poprzez niehomologiczne łączenie końców, wykorzystuje mechanizmy rekombinacji homologicznej i integruje transfekowane homologiczne matryce DNA w celu naprawy indukowanego przez Cas9 / gRNA dwuniciowego złamania11,12.

Tutaj prezentujemy protokół generowania mutantów warunkowego knockdown u P. falciparum za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9. Protokół demonstruje użycie rybozymu glmS do warunkowego obniżenia poziomu białka PfHsp70x (PF3D7_0831700), białka opiekuńczego eksportowanego przez P. falciparum do RBCs gospodarza13,14. Rybozym glmS jest aktywowany przez traktowanie glukozaminą (która w komórkach jest przekształcana w glukozamino-6-fosforan) w celu rozszczepienia powiązanego mRNA, co prowadzi do zmniejszenia białka14. Protokół ten można łatwo dostosować do wykorzystania innych narzędzi do warunkowego knockdownu, takich jak domeny destabilizacyjne lub aptamery RNA4,5,15. Nasz protokół szczegółowo opisuje generowanie plazmidu naprawczego składającego się ze znacznika hemaglutyniny (HA) i sekwencji kodującej rybozym glmS otoczonej sekwencjami, które są homologiczne do otwartej ramki odczytu PfHsp70x (ORF) i 3'-UTR. Opisujemy również wytwarzanie drugiego plazmidu w celu sterowania ekspresją gRNA. Te dwa plazmidy, wraz z trzecim, który napędza ekspresję Cas9, są transfekowane do erytrocytów i wykorzystywane do modyfikacji genomu pasożytów P. falciparum. Na koniec opisujemy technikę opartą na reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu sprawdzenia integracji znacznika i rybozymu glmS. Protokół ten jest wysoce elastyczny w przypadku modyfikacji lub całkowitego wyeliminowania jakichkolwiek genów P. falciparum, zwiększając naszą zdolność do generowania nowych informacji na temat biologii pasożyta malarii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ciągła hodowla P. falciparum wymaga użycia ludzkich krwinek czerwonych, a my użyliśmy zakupionych komercyjnie jednostek krwi, które zostały pozbawione wszelkich identyfikatorów i zanonimizowane. Instytucjonalna Komisja Rewizyjna i Biuro Bezpieczeństwa Biologicznego na Uniwersytecie Georgii dokonały przeglądu naszych protokołów i zatwierdziły wszystkie protokoły stosowane w naszym laboratorium.

1. Wybór sekwencji gRNA

  1. Przejdź do CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) i wybierz 'Fasta Target'. W polu "Cel" wklej 200 par zasad od końca 3' otwartej ramki odczytu (ORF) genu i 200 par zasad od początku 3'-UTR genu. W sekcji "In" wybierz "P. falciparum" (3D7 v3.0) i wybierz "CRISPR/Cas9" w sekcji "Używanie". Następnie kliknij "Znajdź witryny docelowe".
  2. Wybierz sekwencję gRNA z przedstawionych opcji, preferując najbardziej wydajną sekwencję gRNA, która znajduje się najbliżej miejsca modyfikacji i ma najmniej miejsc poza celem.
    UWAGA: Potencjalne sekwencje gRNA są identyfikowane, ponieważ znajdują się bezpośrednio przed motywem sąsiadującym z protospacerem (PAM), który jest wymagany do rekrutacji Cas9 do DNA. Sekwencja, która jest klonowana do pMK-U6, wektora, który napędza ekspresję gRNA, to 20 zasad znajdujących się bezpośrednio przed PAM. PAM specyficzny dla S. pyogenes Cas9 to sekwencja nukleotydowa NGG i nie powinna być włączana do sekwencji klonowanej do pMK-U6.
    UWAGA: CHOPCHOP wizualnie klasyfikuje sekwencje gRNA, wyświetlając najlepsze opcje na zielono, mniej idealne opcje na bursztynie, a najgorsze opcje na czerwono. CHOPCHOP nadaje każdej sekwencji gRNA wynik wydajności, który jest obliczany przy użyciu najbardziej aktualnych parametrów znalezionych w literaturze i przewiduje miejsca poza celem, które mogą zostać rozpoznane przez gRNA. Może być konieczne podjęcie próby wykonania dwóch lub trzech sekwencji gRNA, aby znaleźć gRNA najlepiej pasujące do określonego genu.
  3. Kup sekwencję gRNA i jej odwrotne uzupełnienie jako oligonukleotydy oczyszczone elektroforezą w żelu poliakrylamidowym. Sekwencję gRNA używaną do celowania w PfHSP70x można znaleźć w Rysunek 1B.
    UWAGA: Ten oligo powinien zawierać 15 par zasad homologicznych do plazmidu wykazującego ekspresję gRNA, które są niezbędne do sekwencyjnego i niezależnego od ligacji klonowania (SLIC) do wektora pMK-U616.

2. Klonowanie sekwencji gRNA do pMK-U6

  1. Trawić pMK-U6 za pomocą BtgZI.
    1. Trawić 10 μg pMK-U6 z 5 μl enzymu BtgZI (5 000 jednostek/ml) przez 3 godziny w temperaturze 60 °C. Postępuj zgodnie z protokołem producenta enzymu dotyczącym warunków reakcji.
    2. Po 3-godzinnym okresie inkubacji dodać do reakcji dodatkowe 3 μl BtgZI, aby zapewnić całkowite trawienie plazmidu. Trawić przez dodatkowe 3 godziny, nadal postępując zgodnie z instrukcjami producenta w celu zapewnienia prawidłowych warunków reakcji.
    3. Do oczyszczenia strawionego pMK-U6 z reakcji należy użyć kolumnowego zestawu do czyszczenia PCR zgodnie z instrukcją producenta.
    4. Oddziel strawione DNA za pomocą 0,7% żelu agarozowego i wyekstrahuj prążek 4,200 par zasad.
  2. Wyżarzanie oligonukleotydów zawierających sekwencję gRNA.
    1. Oligonukleotydy oczyszczone metodą PAGE należy rozpuścić do stężenia 100 μM przy użyciu wody wolnej od nukleaz.
    2. Połączyć 10 μl każdego oligo z 2,2 μl 10x buforu 2 (patrz tabela materiałów). Upewnij się, że całkowita objętość reakcji wynosi 22,2 μl.
    3. Uruchom program wyżarzania gRNA w termocyklerze: Krok 1: 95 °C, 10 min; Krok 2: 95 °C, 1 s, ze spadkiem temperatury o 0,6 °C/cykl; Krok 3: Przejdź do kroku 2, 16 razy; Krok 4: 85 °C, 1 min; Krok 5: 85 °C, 1 s, ze spadkiem temperatury o 0,6°C/cykl; Krok 6: Przejdź do kroku 5, 16 razy; krok 7: 75 °C, 1 min; krok 8: 75 °C, 1 s, ze spadkiem temperatury o 0,6 °C/cykl; krok 9: Przejdź do kroku 8, 16 razy. Kroki od 10 do 21: Powtarzać procedurę zastosowaną w krokach 4–9, aż temperatura osiągnie 25 °C; krok 22: 25 °C, 1 min.
  3. Wprowadzić wyżarzone oligonukleotydy gRNA do trawionego i oczyszczonego żelem plazmidu pMK-U6 trawionego przez BtgZI.
    1. Połączyć 100 ng strawionego pMK-U6 z 1 μl 10x buforu 2,1 i 3 μl wyżarzonych oligonukleotów gRNA. Zwiększ objętość do 9,5 μl wodą wolną od nukleaz.
    2. Dodać 0,5 μl polimerazy T4 i inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 2,5 min.
    3. Przenieś reakcję na lód i inkubuj przez 10 minut.
    4. Natychmiast przekształć 5 μl reakcji w kompetentną E. coli zgodnie z instrukcjami dostawcy bakterii. Umieść bakterie na płytkach agarowych Lysogeny Bulth (LB) zawierających 100 μg/ml ampicyliny.
    5. Pozwól przekształconym bakteriom rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie wybierz kolonie i wyekstrahuj DNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do minipreparacji plazmidu.

3. Projektowanie regionów homologii szablonu naprawy

  1. Zaprojektuj mutacje tarczy w szablonie naprawy homologii, aby zapobiec ponownemu przecięciu DNA, które jest zintegrowane z genomem.
    UWAGA: Mutacja tarczy zazwyczaj polega na wprowadzeniu cichej mutacji w celu zmiany PAM tak, aby Cas9 nie wywołał przerwy w szablonie naprawczym. PAM wymagany dla Cas9 używanego w tym protokole to sekwencja nukleotydowa "NGG", gdzie "N" to dowolny nukleotyd. Jeśli to możliwe, zmień jeden z nukleotydów G na A, C lub T.
    1. Jeśli PAM nie może być zmutowany po cichu, wprowadź co najmniej 2 ciche mutacje do 6 par zasad bezpośrednio sąsiadujących z klasą PAM7,8.
      UWAGA: Mutacje te uniemożliwią rozpoznanie matrycy naprawczej przez gRNA i zapobiegną ponownemu przecięciu naprawionego locus przez kompleks Cas9 / gRNA. Mutacje tarczy można wprowadzić do regionu homologii poprzez amplifikację DNA za pomocą starterów zawierających mutację.
  2. Wzmocnij region homologii ORF dla szablonu naprawy.
    1. Za pomocą PCR amplifikuj 800 par zasad od końca 3' ORF docelowego genu. Zaprojektuj startery, które zostaną użyte do wykluczenia kodonu stop z tego amplikonu.
    2. Zaprojektuj startery do wprowadzenia tego amplikonu do pHA-glmS, który został strawiony za pomocą SacII i AfeI poprzez reakcję ligacji DNA lub SLIC16.
  3. Wzmocnij obszar homologii 3'-UTR dla szablonu naprawy.
    1. Za pomocą PCR amplifikuj 800 par zasad bezpośrednio po kodonie stop docelowego genu. Zaprojektuj startery do insercji tego amplikonu do pHA-glmS, który został strawiony przez HindIII i NheI w reakcji ligacji DNA lub SLIC16.
      UWAGA: Wysoka zawartość AT w genomie P. falciparum może utrudniać amplifikację regionów, takich jak UTR. Alternatywnym podejściem do stosowania PCR jest synteza regionów homologii.

4. Klonowanie regionów homologii do plazmidu naprawczego

  1. Wstaw region homologii ORF do pHA-glmS.
    1. Trawić pHA-glmS za pomocą SacII i AfeI, zgodnie z instrukcjami producenta enzymu. Wstaw produkt PCR regionu homologii ORF do strawionego plazmidu za pomocą SLIC16.
    2. Przekształcić się w kompetentną E. coli, jak wykonano w krokach 2.3.4 i 2.3.5.
  2. Wstawić region homologii 3'-UTR do plazmidu pHA-glmS, który już zawiera region homologii ORF (patrz krok 4.1).
    1. Trawić plazmid za pomocą HindIII i NheI zgodnie z instrukcjami producenta enzymu. Wstaw amplikon regionu homologii 3'-UTR do strawionego plazmidu za pomocą SLIC16.
    2. Przekształć się w kompetentną E. coli i wyekstrahować plazmidowe DNA (kroki 2.3.4 i 2.3.5).

5. Wytrącanie DNA do transfekcji

  1. Dodać po 40 μg DNA pMK-U6, pUF1-Cas9 i pHA-glmS (w sumie 120 μg DNA) do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodać 1/10 objętości DNA 3 M octanu sodu w wodzie (pH 5,2) do probówki i dobrze wymieszać za pomocą wiru (np. jeśli objętość w kroku 5.1 wynosiła 100 μl, dodać 10 μl octanu sodu).
  3. Dodać do probówki 2,5-krotność objętości 100% etanolu i dobrze mieszać za pomocą wiru przez co najmniej 30 s (np. jeśli objętość w 5,1 wynosiła 100 μl, dodaj 250 μl 100% etanolu).
  4. Umieść probówkę na lodzie lub w temperaturze -20 °C na 30 minut.
  5. Odwirować probówkę o masie 18 300 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Ostrożnie usunąć supernatant z probówki. Nie naruszaj pelletu.
  7. Dodać do probówki 3-krotność objętości 70% etanolu i krótko wymieszać za pomocą wiru (np. jeśli objętość w 5.1 wynosiła 100 μl, dodać 300 μl 70% etanolu).
  8. Odwirować probówkę o stężeniu 18 300 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Ten krok powinien być wykonywany w sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  9. Ostrożnie usunąć supernatant z probówki. Nie naruszaj pelletu. Pozostaw probówkę otwartą i pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut.
  10. Wytrącone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie ono potrzebne do transfekcji.

6. Izolowanie ludzkich krwinek czerwonych od krwi pełnej w ramach przygotowań do transfekcji

  1. Podwielokrotność świeżej krwi rozlać do sterylnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml (około 25 ml na probówkę).
  2. Odwirować probówki o ciśnieniu 1,088 x g przez 12 minut, z hamulcami wirówki ustawionymi na 4.
  3. Odessać supernatant i kożuch. Ponownie zawiesić granulat RBC z równą objętością niepełnych obrotów RPMI.
    Uwaga: Niekompletny RPMI przygotowuje się przez uzupełnienie RPMI 1640 o 10,32 μM tymidyny, 110,2 μM hipoksantyny, 1 mM pirogronianu sodu, 30 mM wodorowęglanu sodu, 5 mM HEPES, 11,1 mM glukozy i 0,02% (v/v) gentamycyny.
  4. Powtórz kroki 6.2–6.3 dwukrotnie. Po ostatnim praniu ponownie zawiesić erytrocyty w równej objętości niepełnych obrotów RPMI i przechowywać probówki w temperaturze 4 °C.

7. Transfekcja krwinek czerwonych plazmidami CRISPR/Cas9 (do wykonania aseptycznie)

UWAGA: Kultury P. falciparum są utrzymywane zgodnie z opisem w innych raportach17. Utrzymać wszystkie kultury w temperaturze 37 °C poniżej 3%O2, 3% CO2 i 94% N2, chyba że zaznaczono inaczej. Ilekroć w tym protokole używana jest krew, odnosi się to do czystych czerwonych krwinek przygotowanych w kroku 6. Użyta krew nie powinna być starsza niż 6 tygodni, ponieważ zazwyczaj występuje zmniejszenie namnażania się pasożytów w starszej krwi. Poniższe kroki opisują wstępne ładowanie erytrocytów DNA i dodawanie kultury pasożytów do transfekowanych komórek. Inne uznane protokoły transfekcji są kompatybilne z transfekcją tych konstrukcji18,19.

  1. Przygotuj 1x bufor cytomiksu w wodzie (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6). Przefiltruj i wysterylizuj bufor za pomocą filtra 0,22 μm.
  2. Dodaj 380 μl cytomiksu 1x do DNA wytrąconego w kroku 5 i wiruj do rozpuszczenia. Pozwól DNA rozpuścić się w cytomiksie 1x przez 10 minut, wirując co 3 minuty przez 10 sekund.
  3. W sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml połącz 300 μl krwinek czerwonych (50% hematokrytu, z kroku 6) w niepełnym RPMI z 4 ml 1x cytomiksu.
  4. Odwirować erytrocyty z kroku 7.3 przy 870 x g przez 3 minuty, a następnie usunąć supernatant z osadu RBC.
  5. Zawiesić osad RBC z mieszaniną DNA/cytomiksu z kroku 6.2 i przenieść do kuwety do elektroporacji o średnicy 0,2 cm.
  6. Elektroporować erytrocyty w następujących warunkach: 0,32 kV, 925 μF, pojemność ustawiona na "High Cap" i rezystancja ustawiona na "Nieskończoną".
  7. Po elektroporacji przenieś zawartość z kuwety do stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pełnego RPMI (cRPMI). Odwirować probówkę o stężeniu 870 x g przez 3 minuty w temperaturze 20 °C, a następnie zdekantować supernatant.
    UWAGA: cRPMI przygotowuje się tą samą metodą, co niekompletny RPMI z dodatkiem 0,25% (w/v) bogatej w lipidy albuminy surowicy bydlęcej.
  8. Zawiesić osad w 4 ml cRPMI i przenieść do jednego dołka w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Dodać 400 μl kultury o wysokiej zawartości schizontu (7–10% parazytemii schizonta jest idealna) do transfekowanych krwinek czerwonych.
    UWAGA: Parazytemia jest definiowana jako odsetek erytrocytów zakażonych pasożytami.
  9. Następnego dnia umyj kulturę 4 ml cRPMI. Odwirować kulturę o sile 870 x g przez 3 minuty i odessać supernatant. Zawiesić hodowlę w 4 ml cRPMI.
  10. 48 godzin po wykonaniu kroku 7.6 przemyć kulturę 4 ml cRPMI. Następnie ponownie zawieś hodowlę w cRPMI zawierającą 1 μM DSM1, aby wybrać plazmid Cas9.
  11. Kontynuuj mycie kultur każdego dnia za pomocą cRPMI, aż pasożyty przestaną być widoczne w rozmazie krwi. Po upływie tego czasu należy co 48 godzin wymieniać pożywkę hodowlaną na świeże cRPMI plus 1 μM DSM1.
    1. Aby wykonać rozmaz krwi, należy odpipetować 150 μl kultury do probówki wirówkowej o pojemności 0,6 ml. Osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 1 700 x g przez 30 s.
    2. Odessać supernatant. Za pomocą pipety przenieś granulowane komórki na szkiełko podstawowe. Za pomocą drugiego szkiełka podstawionego pod kątem 45° do pierwszego szkiełka rozsmaruj kroplę krwi. Zabejcuj szkiełko za pomocą dostępnego w handlu zestawu do barwienia zgodnie z protokołem producenta.
    3. Zobacz pasożyty za pomocą obiektywu zanurzeniowego 100X.
  12. Rozpoczynając 5 dni po transfekcji (etap 7.6), usuń 2 ml kultury z erytrocytami zawieszonymi w pożywce hodowlanej. Dodaj z powrotem 2 ml świeżej pożywki (cRPMI plus 1 μM DSM1) i krew o stężeniu 2% hematokrytu. Dodawaj świeżą krew w ten sposób raz w tygodniu, aż do ponownego pojawienia się pasożytów, zgodnie z rzadkim rozmazem krwi (krok 7.11).
    UWAGA: Jeśli integracja się powiedzie, pasożyty zazwyczaj pojawiają się ponownie w kulturze po miesiącu od transfekcji.
  13. Gdy pasożyty pojawią się ponownie, usuń ciśnienie leku DSM1. Alternatywnie, usuń ciśnienie leku po sklonowaniu pasożytów.

8. Sprawdzanie pasożytów pod kątem integracji szablonu naprawy

  1. Gdy pasożyty są ponownie widoczne przez cienki rozmaz krwi, należy wyizolować DNA z kultury za pomocą odpowiedniego zestawu.
  2. Użyj PCR do amplifikacji zmodyfikowanego regionu genomu, aby określić, czy docelowe locus zostało pomyślnie zmienione i czy niezmodyfikowany locus typu dzikiego (wskazujący na pasożyty typu dzikiego) jest wykrywalny.
    1. Aby wykryć pasożyty, które zintegrowały szablon naprawy, użyj startera do przodu, który znajduje się na początku ORF, poza sklonowanym regionem homologii. Użyj odwróconego startera, który znajduje się w 3'-UTR.
      UWAGA: Ponieważ ta amplifikacja obejmuje sekwencje znaczników HA i rybozymu glmS, amplikony ze zintegrowanych pasożytów będą dłuższe niż ten sam region amplifikowany u pasożytów typu dzikiego.

9. Klonowanie pasożytów poprzez ograniczenie rozcieńczenia

  1. Przeprowadzić seryjne rozcieńczenia kultury pasożyta od kroku 7.13, aby osiągnąć końcowe stężenie 0,5 pasożyta/200 μl. Dodać 200 μl rozcieńczonej kultury do studzienek 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.
    UWAGA: Ponieważ parazytemia jest definiowana jako procent zakażonych erytrocytów, a hematokryt jest również zdefiniowaną liczbą (2%), liczbę pasożytów na jednostkę objętości można łatwo wywnioskować.
    1. Przygotuj 1 ml kultury w cRPMI przy 5% parazytemii i 2% hematokrycie (przy tych poziomach parazytemii i hematokrytu kultura zawiera 1 x 107 pasożytów/ml).
    2. Rozcieńczyć tę kulturę w stosunku 1:100 za pomocą cRPMI. Rozcieńczyć ponownie w stosunku 1:100 za pomocą cRPMI.
    3. Rozcieńczyć w stosunku 1:400. Wykonaj to rozcieńczenie, dodając 62,5 μl kultury do 25 ml cRPMI i 1 ml krwi. W wyniku tego rozcieńczenia uzyskuje się pożądane stężenie 0,5 pasożyta/200 μl.
  2. Utrzymuj płytkę klonującą, aż pasożyty będą wykrywalne w studzienkach.
    1. Co 48 godzin wymieniać pożywkę w 96-dołkowej płytce na świeżą pożywkę.
    2. Raz w tygodniu, zaczynając 5 dni po rozpoczęciu na płytce klonującej (krok 9.1), usuń 100 μl z każdej studzienki i dodaj z powrotem 100 μl świeżej pożywki + krew (2% hematokrytu).
  3. Zidentyfikuj wszelkie studzienki zawierające pasożyty.
    1. Umieść 96-dołkową płytkę pod kątem 45° na około 20 minut, pozwalając, aby krew osiadła pod kątem w płytce.
    2. Umieść 96-dołkową płytkę na kasecie świetlnym. Zauważ, że studzienki zawierające pasożyty zawierają pożywkę o żółtym kolorze, w porównaniu z różową pożywką studni wolnych od pasożytów, ze względu na zakwaszenie pożywki przez pasożyty.
    3. Za pomocą pipety serologicznej przenieś zawartość studzienek zawierających pasożyty na 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, aby umożliwić ekspansję parazytemii.
    4. Korzystając z analizy PCR zgodnie z opisem w kroku 8, sprawdź te klonalne linie pasożytów pod kątem prawidłowej integracji.

10. Knockdown białka poprzez leczenie pasożytów glukozaminą i potwierdzenie za pomocą analizy Western Blot

  1. Przygotować 0,5 M roztwór podstawowy GlcN (glukozaminy), który można przechowywać w temperaturze -20°C.
  2. Dodaj GlcN do kultur pasożytów glmS i pozwól im rosnąć w obecności GlcN.
    UWAGA: Ostateczne stężenie i czas leczenia GlcN zależy od eksperymentu i linii pasożyta. GlcN może wpływać na wzrost pasożyta, dlatego rodzicielski szczep pasożyta powinien być wystawiony na działanie szeregu stężeń GlcN, aby określić jego wrażliwość na ten związek. Często stosuje się stężenie 2,0-7,5 mM GlcN13,14,20.
  3. Wyizoluj próbki białek od pasożytów traktowanych metodą GlcN13.
  4. Użyj próbek białek do analizy western blot, aby wykryć redukcje w białko13.
    1. Użyj przeciwciała anty-HA zgodnie z instrukcjami producenta, aby wykryć białko znakowane HA-glmS. Porównaj pasmo HA z kontrolą obciążenia, taką jak PfEF1α.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat plazmidów używanych w tej metodzie, jak również przykład mutacji tarczy, są pokazane w Rysunek 1. Jako przykład identyfikacji zmutowanych pasożytów po transfekcji, wyniki PCR do sprawdzania integracji konstruktu HA-glmS są pokazane na Rysunek 2. Reprezentatywny obraz płytki klonującej jest pokazany w Rysunek 3, aby zademonstrować zmianę koloru podłoża w obecności pasożytów. Wyniki te...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wdrożenie CRISPR/Cas9 u P. falciparum zarówno zwiększyło skuteczność, jak i skróciło czas potrzebny na modyfikację genomu pasożyta w porównaniu z wcześniejszymi metodami manipulacji genetycznej. Ten obszerny protokół przedstawia kroki niezbędne do generowania warunkowych mutantów przy użyciu CRISPR/Cas9 u P. falciparum. Chociaż metoda ta jest ukierunkowana specjalnie na generowanie mutantów HA-glmS , strategia ta może być dostosowana do różnych potrzeb, w tym znakowania genów, nokautowania genó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Muthugapatti Kandasamy z University of Georgia (UGA) Biomedical Microscopy Core za pomoc techniczną oraz Jose-Juan Lopez-Rubio za udostępnienie plazmidów pUF1-Cas9 i pL6. Praca ta została wsparta nagrodami Fundacji ARCS dla D.W.C. i H.M.K., funduszami startowymi UGA dla V.M., grantami Fundacji March of Dimes (Basil O'Connor Starter Scholar Research Award) dla V.M. oraz grantami US National Institutes of Health (R00AI099156 i R01AI130139) dla V.M. i (T32AI060546) dla HMK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652660
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad165-2086Kupujemy te, które są pakowane pojedynczo
Octan soduSigma-AldrichS2889-250g
DSM1Prezent od laboratorium Akhil VaidyaGanesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34
Kultura tkankowa TPP Płytki 6-dołkoweMIDSCITP92006
Naczynia do hodowli tkankowych TPP 100 mm (płytka 12 ml)MIDSCITP93100
Kultura tkankowa TPP 96-dołkowe płytkiMIDSCITP92096
Kultura tkankowa TPP 24-dołkowe płytkiMIDSCITP92024
NEBuffer 2New England Biolabs#B7002S
NEBuffer 2.1New England Biolabs#B7202S
BtgZINew England Biolabs#R0703L
SacIINew England Biolabs#R0157L
HindIII-HFNew England Biolabs#R3104S
Afe1New England Biolabs#R0652S
Nhe1-HFNew England Biolabs
Polimeraza DNA T4New England Biolabs#M0203S
500 ml Filtr do butelek SteritopMilliporeSCGPU10REMożesz użyć dowolnego rozmiaru, który odpowiada Twoim potrzebom
EGTASigmaE4378-100G
KClSigma-AldrichP9333-500g
CaCl2Sigma-AldrichC7902-500g
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100g
K2HPO4FisherP288-500
HEPESSigma-AldrichH4034-500g
pMK-U6Generowane przez Muralidharan Labn/a
pHA-glmSGenerowane przez Muralidharan Labn/a
pUF1-Cas9Prezent od laboratorium Jose-Juan Lopez-RubioGhorbal et al. Nature Biotech 2014
GlukozaSigma-AldrichG7021-1KG
Wodorowęglan soduSigma-AldrichS5761-500G
Pirogronian soduSigma-AldrichP5280-100G
HipoksantynaSigma-AldrichH9636-25g
Odczynnik gentamycynyGibco15710-064
TymidynaSigma-AldrichT1895-1G
PL6-eGFP BSDGenerowany przez Muralidharan Lab
Puf1-cas9 eGFP gRNAgenerowany przez Muralidharan Lab
NucleoSpin Gel i PCR Clean-upMacherey-Nagel740609.250
Albumax ILife TechnologiesN/ABędziesz chciał wypróbować kilka partii, aby dowiedzieć się, jakie pasożyty będą rosły w najlepszych
ludzkich krwinkach czerwonych MiędzystanowyBank Krwi, IncWyślij e-mail lub zadzwoń bezpośrednio w celu złożenia zamówieniaO+ we krwi
3D7Dostępne na życzenieNie dotyczy
bulionu lizogenicznego (LB)FisherBP1426-2Możesz zrobić własny, nie jest konieczne używanie dokładnie tego
AmpicilinFisherBP1760-25Robimy zapas 1000X w 100mg/ml w wodzie i przechowujemy w -20C
AmpicilinClonetechR050A
Anti-EF1alpha. Daniel Goldberg's Lab WashingtonUniversity w St. LouisMożesz użyć preferowanej kontroli ładowania dla zachodnich plam. To jest właśnie ten, którego używamy w naszym laboratorium
Szczurzy klon anty-HA 3F10, monoklonalnyWyprodukowany przez Roche, sprzedawany przez Sigma11867423001Możesz użyć preferowanego przeciwciała anty-HA
0,6 ml probówkiFisherAB0350
Fisher HealthCare* PROTOKÓŁ* Hema 3* Ręczny system barwienia (utrwalacz + roztwór I i II)Fisher22-122-911Możesz również użyć bejcy
giemsaSzkiełka mikroskopowe Fisherfines Premium Mated - Rozmiar: 3 x 1 calRybak12-544-3
#R3131L Zazwyczaj używamy linii pasożytów Dr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
  2. Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
  3. Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
  4. Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310(2012).
  5. Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
  6. Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
  7. Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
  8. Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
  9. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096(2014).
  10. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
  11. Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
  12. Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
  13. Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
  14. Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783(2013).
  15. Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727(2016).
  16. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  17. Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
  18. Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
  19. Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
  20. Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
  21. Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
  22. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
  23. Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033(2015).
  24. Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
  25. Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270(2018).
  26. Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
  27. Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
  28. Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
  29. Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
  30. Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
  31. Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
  32. Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
  33. Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Plasmodium falciparumwyciszenie GlmSznakowanie bia ekknockout genutechnika elektroporacjianaliza Western blottest immunofluorescencjiprzygotowanie rozmazu krwi

Powiązane artykuły