Artykuł metodologiczny

Wykrywanie heterodimeryzacji izoform białek za pomocą testu ligacji zbliżeniowej in situ

DOI:

10.3791/57755

⸱

20 października 2018

 , 
1Fox Chase Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy, jak używać testu ligacji zbliżeniowej (PLA) do wizualizacji heterodimeryzacji MST1/MST2 w stałych komórkach z wysoką czułością.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulowane interakcje białko-białko są zasadą przewodnią dla wielu zdarzeń sygnalizacyjnych, a wykrywanie takich zdarzeń jest ważnym elementem w zrozumieniu, jak takie szlaki są zorganizowane i jak funkcjonują. Istnieje wiele metod wykrywania interakcji białko-białko w komórkach, ale stosunkowo niewiele z nich można wykorzystać do wykrywania interakcji między endogennymi białkami. Jedna z takich metod, test ligacji zbliżeniowej (PLA), ma kilka zalet, które zalecają jej stosowanie. W porównaniu z innymi powszechnymi metodami analizy interakcji białko-białko, PLA ma stosunkowo wysoką czułość i swoistość, może być wykonywany przy minimalnej manipulacji komórkami, a w opisanym tutaj protokole wymaga tylko dwóch przeciwciał specyficznych dla celu pochodzących z różnych gatunków (np. od myszy i królika) i jednego wyspecjalizowanego odczynnika: zestawu przeciwciał drugorzędowych, które są kowalencyjnie połączone ze specyficznymi oligonukleotydami, które: gdy zostaną umieszczone w bliskiej odległości od siebie, stwórz amplifikowaną platformę do PCR in situ lub amplifikacji w toczonym okręgu. W tej prezentacji pokazujemy, jak zastosować technikę PLA do wizualizacji zmian w bliskości MST1 i MST2 w komórkach stałych. Technika opisana w tym manuskrypcie jest szczególnie przydatna do analizy badań nad sygnalizacją komórkową.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakłócenie sygnalizacji MST1/Hippo zostało powiązane z zaburzeniami rozwojowymi i kancerogenezą1. U ssaków kinazy MST1 i MST2 aktywują (fosforylują) MOB1 i LATS1/2, z których ten ostatni następnie fosforyluje i dezaktywuje koaktywator transkrypcji Yes-associated protein (YAP)2. W swojej aktywnej (nieufosforylowanej) postaci YAP wykazuje aktywność onkogenną, wzmacniając transkrypcję genów proliferacji komórek; i odwrotnie, gdy YAP jest inaktywowany przez szlak Hippo, proliferacja komórek jest hamowana, a apoptoza promowana3. W tkankach MST1 i MST2 występują głównie jako aktywne homodimery, ale bodźce onkogenne mogą zwiększać poziomy heterodimerów MST1/MST2, a takie heterodimery są nieaktywne4. Jednak sposób, w jaki heterodimeryzacja MST1/MST2 jest regulowana, pozostaje słabo poznany. Zarówno homo-, jak i heterodimery są mediowane poprzez interakcje między C-końcowymi regionami cewki zwijanej MST1 i MST2, znanymi jako domeny SARAH5. Korzystając z PLA in situ pokazanego w tym artykule, pokazujemy obecność heterodimerów MST1/MST2 w ludzkich komórkach Schwanna (HSC) i ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych (HEK-293). PLA ma przewagę nad innymi metodami wykrywania interakcji białko/białko, ponieważ umożliwia wykrywanie endogennych interakcji białko-białko, które można zidentyfikować i określić ilościowo bez potrzeby ekspresji transgenu lub użycia znaczników epitopów6.

Szlaki transdukcji sygnałowej są w dużej mierze kontrolowane przez warunkową asocjację białek składowych. Na przykład stymulacja większości receptorowych kinaz tyrozynowych prowadzi do ich homo- lub heterodimeryzacji, a następnie asocjacji z dodatkowymi wewnątrzkomórkowymi białkami sygnałowymi, które same tworzą dalsze kompleksy. Celem metody PLA jest wizualizacja bliskości między białkami w komórkach, pod warunkiem, że białka są oddalone od siebie o mniej niż 30-40 nm. Bliskość białka jest zwykle wykrywana przez pierwszą inkubację komórek z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi wyhodowanymi u różnych gatunków (np. królika i myszy) przeciwko każdemu białku oddziałującemu, a następnie dodanie specyficznych dla gatunku przeciwciał drugorzędowych, wstępnie sprzężonych z krótkimi sondami DNA. Jeśli sondy DNA znajdują się w bliskiej odległości, specyficzny linkujący oligonukleotyd DNA może jednocześnie wiązać obie te sondy, tworząc platformę do amplifikacji za pomocą PCR in situ lub mechanizmu toczącego koła. Znaczniki fluorescencyjne dodane do reakcji amplifikacji umożliwiają wizualizację oddziałujących białek, które wyglądają jak fluorescencyjne kropki, które można łatwo określić ilościowo i zlokalizować w określonych regionach komórki7,8,9,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować roztwór utrwalający: 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS. Na 10 ml weź 2,5 ml 16% PFA i dodaj 7,5 ml 1x PBS.
    Zagrożeń: PFA jest rakotwórczy w niskich dawkach. Opary i kontakt ze skórą są niebezpieczne. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotuj roztwór permeabilizacyjny: 0,1% Triton X-100 w 1x PBS. Na 100 ml roztworu dodać 100 μl Triton X-100 do 100 ml 1x PBS. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Przygotuj bufor do mycia: 1x TBST. Na 1 l weź 100 ml 10x TBS, 890 ml dH2O i 10 ml Tween 20 (10%).
  4. Przygotuj roztwór blokujący zgodnie z zestawem. Alternatywnie należy użyć 1x roztworu PBS zawierającego 2% BSA.
  5. Przygotować rozcieńczalnik na przeciwciała zgodnie z zestawem. Alternatywnie należy użyć 1x roztworu PBS zawierającego 1% BSA.

2. Posiewanie komórek

UWAGA: W tym badaniu użyliśmy unieśmiertelnionych ludzkich komórek Schwanna (iHSC) i ludzkich embrionalnych komórek nerki 293 (HEK 293); jednak ta metoda może być stosowana dla wielu typów przylegających komórek.

  1. Kultura HEK 293 w DMEM uzupełniona 10% FBS, 0,2% glukozy, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny na płytkach poddanych hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Utrzymuj iHSC w 10% FBS/DMEM uzupełnionym Pen/Strep i 2 μM forskoliną. Rutynowo testuj komórki na obecność mykoplazmy. Nie przeprowadzono uwierzytelniania za pomocą linii komórkowej.
  2. Pokryć 16-dołkowe szkiełko komorowe 50 μl 10 μg/ml naturalnej lamininy mysiej lub 0,01% roztworu poli-L-lizyny i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Podziel komórki za pomocą 0,04% trypsyny-EDTA.
  3. Płytka iHSC i HEK-293 w 100 μl podłoża przy 80% konfluencji (15 000-25 000 komórek/dołek).
  4. Inkubować komórki przez 12 -24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5%CO2
    5. .

3. Utrwalenie i przepuszczalność

  1. Usunąć pożywkę z dołków i przemyć 100 μl 1x PBS. Odessać za pomocą mikropipety, aby zminimalizować ryzyko usunięcia próbki.
  2. Utrwalić komórki, dodając 50 μl 4% PFA na studzienkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, bez mieszania. Komórki są wrażliwe na odwarstwienie, dlatego należy unikać pipetowania roztworów bezpośrednio na komórki.
  3. Umyj komórki 0,05% TBST trzy razy po 5 minut każda. Odessać za pomocą mikropipety, aby zminimalizować ryzyko usunięcia próbki.
  4. Potraktuj komórki roztworem przepuszczalnym (0,1% Triton x-100 w 1x PBS) przez 10 minut bez mieszania w temperaturze pokojowej.
  5. Umyć komórki TBST trzy razy przez 5 minut każdy z mieszaniem.

4. Blokowanie

  1. Odczepić TBST (bardzo delikatnie za pomocą mikropipety). Wizualizuj szkiełko w mikroskopie, aby sprawdzić, czy komórki pozostają przyczepione.
  2. Dodaj jedną kroplę (50-60 μl) 1x roztworu blokującego do każdej próbki.
  3. Podgrzej wstępnie komorę wilgotnościową (puste pudełko z końcówką z wodą) do temperatury 37 °C i inkubuj w niej szkiełka przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

5. Przeciwciała pierwotne

  1. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (1:100) w rozcieńczalniku przeciwciał (patrz tabela materiałów). Przygotować 40 μl roztworu przeciwciał na dołek.
  2. Usunąć roztwór blokujący ze szkiełek, strzepując płyn. Nie pozwól, aby komórki wyschły.
  3. Wykonać wir i dodać 40 μl roztworów przeciwciał do każdej studzienki.
  4. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w nagrzanej komorze wilgotnościowej.

6. Sondy do ligacji zbliżeniowej

UWAGA: Sondy PLA są dostarczane jako część zestawu (patrz Tabela materiałów). Wybór sond będzie zależał od gatunku pierwotnych przeciwciał używanych do wykrywania interesujących białek.

  1. Rozcieńczyć dwie sondy PLA (anty-Mouse MINUS i anty-Rabbit PLUS) w stosunku 1:5 w rozcieńczalniku przeciwciał. Dla każdej próbki przygotuj 40 μl sondy PLA. Inkubować mieszaninę przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Stuknij główny roztwór przeciwciała ze szkiełek. Umyj szkiełka dwukrotnie przez 5 minut za pomocą buforu do płukania w temperaturze pokojowej.
  3. Delikatnie postukać buforem płuczącym w szkiełka i dodać rozcieńczalnik roztwór sondy PLA do studzienek (40 μl/studzienkę).
  4. Inkubować szkiełka w wstępnie podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

7. Podwiązanie

UWAGA: Odczynniki do wykrywania in situ Red, Ligase i Roztwór Ligacji są dostarczane jako część zestawu (patrz Tabela Materiałów).

  1. Użyj odczynników do wykrywania in situ w kolorze czerwonym.
  2. Bezpośrednio przed użyciem należy odwirować i rozcieńczyć wymagane objętości 5-krotnego podwiązania 1:5 w wodzie o wysokiej czystości.
    UWAGA: Nie przechowywać rozcieńczonych odczynników.
  3. Odczep roztwór sondy PLA od szkiełek. Umyj szkiełka w 1x buforze do mycia dwa razy po 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Bezpośrednio przed dodaniem do próbek, odwirować i dodać ligazę do roztworu ligacji w rozcieńczeniu 1:40 i ponownie odwirować.
  5. Stuknąć bufor płuczący ze szkiełek i dodać roztwór ligacji/ligazy do każdej studzienki (40 μl/studzienkę).
  6. Inkubować szkiełka w wstępnie podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

8. Wzmocnienie

UWAGA: Zestaw wzmacniający jest dostarczany jako część zestawu (patrz Tabela materiałów). Odczynniki są wrażliwe na światło; Dlatego unikaj wystawiania szkiełek na działanie światła.

  1. Zwiruj i rozcieńcz wymagane objętości 5-krotnego wzmacniacza w stosunku 1:5 w wodzie o wysokiej czystości i wymieszaj.
  2. Stuknąć roztwór do ligacji/ligazy ze szkiełek. Umyj szkiełka w 1x buforze do mycia dwa razy po 2 minuty w temperaturze RT.
  3. Odwirować i dodać polimerazę do roztworu amplifikacyjnego w rozcieńczeniu 1:80 i ponownie przetoczyć wir.
  4. Stuknąć bufor płuczący ze szkiełek i dodać roztwór amplifikacji/polimerazy do każdej studzienki (40 μl/studzienkę). Inkubować szkiełka w podgrzanej komorze wilgotnościowej przez 100 minut w temperaturze 37 °C.

9. Przygotowanie do obrazowania

UWAGA: To są odczynniki światłoczułe. Chroń szkiełka przed światłem.

  1. Stuknąć roztwór polimerazy amplifikacyjnej ze szkiełek i umyć dwukrotnie przez 10 minut każdy w 1x bufor do płukania w temperaturze pokojowej.
  2. Całkowicie usuń komory i silikon wokół studzienek ze szkiełka. Zeskrob pozostałe kawałki silikonu brzytwą. Narysuj na szkiełku siatkę oddzielającą każdą studzienkę.
  3. Dodać ~40 μL podłoża montażowego z DAPI. Należy uważać, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym. Krawędzie szkiełka nakrywkowego można uszczelnić lakierem do paznokci.
  4. Odczekaj co najmniej 20 minut przed wykonaniem analizy obrazu za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
  5. Po zobrazowaniu przechowuj szkiełka w temperaturze -20 °C w ciemności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użyliśmy testu PLA, aby przetestować interakcję między MST1 i MST2 w HEK-293 i iHSC. Komórki utrwalono, przeniknięto i wybarwiono różnymi przeciwciałami, a następnie amplifikacją in situ zgodnie z protokołem PLA (Ryc. 1). Aby udokumentować poziom heterodimeryzacji MST1 / MST2, komórki wybarwiono przeciwciałami MST1 i MST2 (Figura 1A, 1C i 1G). Jako kontrolę pozytywną użyliśmy również przeciwciał ERK i pERK, które po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwierdziliśmy, że przydatne jest użycie szkiełek do szkiełek w tym eksperymencie, ponieważ bardzo wygodne jest przeprowadzenie eksperymentu na kilku (14-16) liniach komórkowych i nie ma potrzeby zmiany próbki za każdym razem podczas analizy mikroskopowej. Może dojść do kilku powikłań, takich jak zwiększone ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego przeciwciałami. Dlatego sugerujemy mycie każdej studzienki indywidualnie zamiast używania słoika z koplinu, pomimo wydłużonego czasu trwania eksperymentu. Ponadto wyjmowanie wkładki ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy całemu laboratorium Chernoffa za wkład w optymalizację i walidację tego protokołu, w szczególności Marii Radu i Galinie Semenovej. Dziękujemy również Andreyowi Efimovowi z Cell Imaging Facility w Fox Chase Cancer Center. Praca ta została wsparta grantem z NIH (R01 CA148805) dla JC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka komoroweThermo Fisher Scientific17859916-dołkowe, szkiełko szklane
Sonda PLA Anti-Mouse MinusSigma-AldrichDUO92004Zawiera 1x Roztwór blokujący, 1x Przeciwciało Rozcieńczalnik
PLA Sonda Anti-Rabbit PLUSSigma-AldrichDUO92002Zawiera 1x Roztwór blokujący, 1x Przeciwciało Rozcieńczalnik
do płukania, FlurescenceSigma-AldrichDUO82049buforu myjącego A i bufor do płukania B
odczynnikami do wykrywaniaSigma-Aldrich DUO92008 Zawiera 5x ligację, 1x ligazę, 5x czerwień alifikacyjną, 1x polimerazę
p44/42 MAPK (Erk1/2)Komórka przeciwciała sygnalizującego9102s
Sygnalizacja5726sprzeciwciało pERK
Przeciwciało MST2Sygnalizacjakomórkowa 3952s
Krs-2 (RJ-5)Santa Cruzsc-100449Przeciwciało MST1
16% ParaformaldehydMikroskopia elektronowa nauki15710Rozcieńczyć do 4% PFA w PBS do utrwalania roztworu
Triton x100Fisher BioReagentsBP 151-500Aby przygotować 0,1% Triton x-100 w 1xPBS do roztworu do permeabilizacji
Mikroskopia konfokalnaLeica TCS SP8, 63-krotnaanaliza obrazu za pomocą oprogramowania ImageJ
Zawiera pożywkę montażową z DUO82040 DAPI Sigma-Aldrich Red Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)Komórka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, D., et al. The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).
  2. Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation. Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).
  3. Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades. Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).
  4. Rawat, S. J., et al. H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization. Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).
  5. Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain. Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).
  6. Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome. Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).
  7. Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. Proximity assays for sensitive quantification of proteins. Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).
  8. Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
  9. Leuchowius, K. J., et al. Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue. Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interakcje bia ko bia koheterodimer MST1 MST2detekcja in situprzeciwcia a pierwszorz dowesondy PLAamplifikacja przez ligacjdetekcja sygna u fluorescencyjnegoanaliza utrwalonych kom rekobrazowanie mikroskopowe

Powiązane artykuły