Artykuł metodologiczny

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

DOI:

10.3791/57758

⸱

1 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby zakaźne przenoszone przez wektory stawonogów nadal stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia ludzkiego na całym świecie. Patogeny wywołujące te choroby nie istnieją w izolacji, gdy kolonizują wektora; raczej prawdopodobnie angażują się w interakcje z mikroorganizmami rezydującymi w świetle jelita. Wykazano, że mikrobiota wektorowa odgrywa ważną rolę w przenoszeniu patogenów w przypadku wielu chorób przenoszonych przez wektory. Nie ustalono, czy bakterie rezydujące w jelicie kleszcza Ixodes scapularis, wektora kilku ludzkich patogenów, w tym Borrelia burgdorferi, wpływają na przenoszenie patogenów przez kleszcze. Potrzebujemy metod charakteryzowania składu bakterii związanych z jelitem kleszcza, aby ułatwić lepsze zrozumienie potencjalnych interakcji międzygatunkowych w jelicie kleszcza. Wykorzystanie hybrydyzacji in situ w całości do wizualizacji transkryptów RNA związanych z określonymi gatunkami bakterii pozwala na zebranie danych jakościowych dotyczących obfitości i rozmieszczenia mikrobioty w nienaruszonej tkance. Technika ta może być stosowana do badania zmian w środowisku mikrobioty jelitowej w trakcie żerowania kleszczy, a także do analizy ekspresji genów kleszczy. Barwienie całych jelit kleszczy dostarcza informacji o ogólnym rozkładzie przestrzennym docelowego RNA w tkance bez konieczności trójwymiarowej rekonstrukcji i jest mniej podatne na zanieczyszczenie środowiska, co często zakłóca metody oparte na sekwencjonowaniu, często stosowane do badania złożonych zbiorowisk drobnoustrojów. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta jest cennym narzędziem, które można wykorzystać do lepszego zrozumienia interakcji wektor-patogen-mikrobiota oraz ich roli w przenoszeniu chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogeny przenoszone przez wektory stawonogów są spotykane na całym świecie i stanowią około 20% chorób zakaźnych na całym świecie1, ale skuteczne i bezpieczne szczepionki przeciwko większości tych patogenów nie są dostępne. Nasze zrozumienie ważnej roli mikroorganizmów komenalnych, symbiotycznych i chorobotwórczych, znanych pod wspólną nazwą microbiome2, w modulowaniu i kształtowaniu zdrowia prawie wszystkich metazoans3 poszerza się. Obecnie jest oczywiste, że stawonogi będące wektorami patogenów są również nosicielami mikrobioty jelitowej i wykazano, że te mikrobioty związane z wektorami wpływają na różne patogeny przenoszone przez wektory4,5. Mikrobiom stawonogów składa się z eubakterii, archeonów, wirusów i drobnoustrojów eukariotycznych, takich jak pierwotniaki, nicienie i grzyby6. Jednak dominujący nacisk kładziony jest na eubakterie, częściowo ze względu na dostępność genów markerowych i referencyjnych baz danych do identyfikacji określonych członków bakterii.

Skupiając się na Ixodes scapularis, kleszczowym wektorze wielu ludzkich patogenów, w tym Borrelia burgdorferi7, czynnika wywołującego boreliozę, optymalizacja techniki wizualizacji mikrobiologicznej miała na celu poprawę naszego zrozumienia mikrobioty jelitowej kleszcza w kontekście interakcji wektor-patogen. W dziedzinie mikrobiomu kleszczy pozostaje kilka pytań, na które trzeba odpowiedzieć. Jelito jest miejscem pierwszego dłuższego spotkania kleszcza z nadchodzącym patogenem w kontekście patogenów przenoszonych poziomo; W związku z tym zrozumienie roli mikrobioty jelitowej wektora w modulowaniu interakcji wektor-patogen ujawni znaczące informacje. Kleszcze mają unikalny tryb trawienia mączki krwi, w którym przetwarzanie składników mączki z krwi odbywa się wewnątrzkomórkowo8. Światło jelita pozornie służy jako naczynie do przechowywania mączki z krwi, gdy kleszcz żeruje, a trawienie i przyswajanie składników odżywczych następuje przez kilka dni żerowania i trwa po napełnieniu. Patogeny nabyte przez kleszcza podczas żerowania dostają się do światła jelita wraz z mączką z krwi, a zatem światło staje się głównym miejscem interakcji między kleszczem, patogenem i zamieszkującą go mikrobiotą. Gdy trawienie przebiega przez napełnienie i linienie kleszczy Ixodid, jelito ulega zmianom strukturalnym i funkcjonalnym9. Skład i organizacja przestrzenna bakterii jelitowych również mogą się różnić w zależności od zmieniającego się środowiska jelitowego. Dlatego ważne jest, aby zrozumieć architekturę bakterii rezydujących w jelicie kleszcza, aby w pełni zrozumieć wzajemne oddziaływanie kleszczy, patogenów i mikrobioty jelitowej.

Techniki molekularne opisujące mikrobiotę związaną z gospodarzem rutynowo wykorzystują wysokoprzepustowe strategie sekwencjonowania równoległego10 do amplifikacji i sekwencjonowania bakteryjnego rybosomalnego DNA 16S (rDNA). Te strategie sekwencjonowania pozwalają uniknąć konieczności uzyskiwania kultur aksonicznych określonych bakterii i zapewniają dogłębny opis wszystkich członków bakterii reprezentowanych w próbce. Niemniej jednak takie strategie są zagmatwane przez niemożność odróżnienia skażeń środowiska od mieszkańców działających w dobrej wierze. Ponadto, podczas oceny próbek, takich jak kleszcze, które są małe i dlatego zawierają niski plon DNA specyficznego dla mikrobioty, zwiększa się prawdopodobieństwo amplifikacji zanieczyszczeń środowiskowych11 i skutkuje niejednoznaczną interpretacją składu mikrobiomu. Charakterystyka funkcjonalna w połączeniu z wizualizacją określonych żywotnych bakterii będzie zatem miała kluczowe znaczenie dla zdefiniowania i rozpoznania mikrobiomu kleszcza pod względem czasowym i przestrzennym. W tym celu wykorzystaliśmy hybrydyzację in situ RNA z całą górą. Technika ta jest rutynowo stosowana do oceny wzorców ekspresji genów w narządach i zarodkach12,13,14 i umożliwia półilościową analizę ekspresji w całej próbce będącej przedmiotem zainteresowania. Różni się to od tradycyjnych technik hybrydyzacji in situ, które wykorzystują skrawki tkanek i często wymagają obszernej analizy przekrojonego materiału za pomocą zestawu obliczeniowego w celu przewidzenia ekspresji w całych narządach15. Podczas gdy whole-mount zazwyczaj odnosi się do całych organizmów12, tutaj whole-mount odnosi się do całych jelit lub organów. Korzyści płynące ze stosowania podejścia do hybrydyzacji in situ z wykorzystaniem całego RNA do oceny architektury mikrobioty jelitowej kleszcza są wielorakie. Jelito kleszcza składa się z 7 par uchyłków, z których każda różni się wielkością16. Różnice funkcjonalne, jeśli występują, między tymi uchyłkami nie są rozumiane w kontekście biologii kleszczy, mikrobioty kleszcza lub interakcji kleszcz-patogen. Manipulacje jelitowe, które powodują pęknięcie uchyłków jelitowych, spowodowałyby przemieszczenie mikrobioty obecnej w świetle jelita lub mikrobioty luźno związanej z jelitami i skutkowałyby błędną interpretacją przestrzennej lokalizacji mikrobioty. Hybrydyzacja in situ znakowanego fluorescencją RNA została wykorzystana wcześniej do zbadania transkryptów jelitowych kleszczy17 poprzez utrwalenie i otwarcie poszczególnych uchyłków jelitowych w celu zapewnienia hybrydyzacji sondy i lokalizacji transkryptów B. burgdorferi poprzez sekcję całych kleszczy zanurzonych w parafinie18. Oba te podejścia wymagają manipulacji tkankami kleszcza przed hybrydyzacją, co wpłynęłoby na architekturę mikrobioty jelitowej.

W tym raporcie szczegółowo opisujemy protokół badania żywotnej mikroflory jelitowej kleszczy za pomocą hybrydyzacji in situ (WMISH). Zastosowanie hybrydyzacji in situ z całym RNA umożliwia globalne zrozumienie obecności i liczebności określonych bakterii jelitowych w różnych regionach jelita i może pobudzić nowe spojrzenie na biologię jelit kleszczy w kontekście kolonizacji i przenoszenia patogenów. Co więcej, zastosowanie sond RNA skierowanych przeciwko określonemu bakteryjnemu RNA pozwala na wykrycie żywych bakterii w jelicie kleszcza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie matryc DNA

  1. Pobierz sekwencję 16S rRNA specyficzną dla każdego rodzaju bakterii z bazy danych NCBI i zaprojektuj startery do przodu i do tyłu kompatybilne z reakcją łańcuchową polimerazy (PCR), które wzmocnią regiony specyficzne dla rodzajów (o długości ~200 - 250 par zasad), jak opisano wcześniej19. Zapoznaj się również z bazami danych online SILVA20,21 i probeBase22 dla sond oligonukleotydowych i starterów ukierunkowanych na rRNA, ponieważ sondy RNA dla niektórych rodzajów bakterii mogą być dostępne na rynku.
    Uwaga: Ważne jest, aby wybrać regiony genów, które są specyficzne dla określonych rodzajów i upewnić się, że zaprojektowane startery nie amplifikują pokrewnych rodzajów bakterii. Ma to kluczowe znaczenie dla uzyskania hybrydyzacji sondy specyficznej dla genu/rodzaju.
  2. Nakarm myszy kleszczami przez 24, 48 lub 72 godziny, wypreparuj wnętrzności kleszczy i przygotuj RNA i cDNA z wnętrzności kleszczy, jak opisano wcześniej23. Użyj cDNA jako matrycy do PCR, amplifikacji amplikonów specyficznych dla rodzajów za pomocą termocyklera. Przeprowadzić podwielokrotność produktu/amplikonu PCR na 1,5% żelu agarozowym i potwierdzić, że amplikon odpowiada oczekiwanemu rozmiarowi, wizualizując go w świetle ultrafioletowym (UV) za pomocą systemu obrazowania żelowego.
  3. Sklonuj bakteryjny amplikon rybosomalnego RNA 16S do dostępnego na rynku wektora TA (tabela materiałów) zawierającego promotory polimerazy RNA odpowiednie dla polimeraz bakteriofagowych (SP6, T7 lub T3). Sekwencjonuj klony, aby potwierdzić tożsamość amplikonu i kierunkowość klonu w odniesieniu do każdego z promotorów. Na tej podstawie określ promotor z wyboru do generowania sond RNA sensownych lub antysensownych (Rysunek 1).
  4. Linearyzować 1 mg plazmidu odpowiednim enzymem restrykcyjnym w objętości reakcji do 30 μl przez 2 godziny w temperaturach zalecanych przez producenta. Wybierz enzymy restrykcyjne w oparciu o promotor, który zostanie wykorzystany do wygenerowania sondy sensownej lub antysensownej (Rysunek 1). Zweryfikuj linearyzację poprzez wizualizację 2 μl reakcji trawienia na 1% żelu agarozowym.
  5. Pozostałe 28 μl strawionego DNA należy oczyścić za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania kolumny produktu PCR i określić ilościowo stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
    Uwaga: Niektóre sondy czujnikowe mogą powodować barwienie tła znacznie wyższe niż odpowiadająca im sonda antysensowna i może być konieczne zbadanie innych opcji. Alternatywne kontrole ujemne obejmują plazmidy kodujące sekwencje niereprezentowane w próbce lub inną sondę, która daje charakterystyczny wzór hybrydyzacji.

2. Budowa sond RNA Digoxygenin-UTP

  1. Przygotuj mieszaninę nukleotydów, łącząc 7,5 μl 100 mM UTP, 25 μl 10 mM digoksygeniny-UTP i po 10 μl 100 mM ATP, GTP i CTP w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Przeprowadzić transkrypcję in vitro przy użyciu dostępnych na rynku zestawów polimerazy RNA T7 lub Sp6, używając 1 μl mieszaniny nukleotydów (krok 2.1) i 0,25 - 1 μg matrycy DNA. Uzupełnić objętość do 20 μl wodą. Przesuń rurkę, aby połączyć i pulsacyjnie wirować. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2,5 - 3 h.
    Uwaga: Konstrukcja sondy powiodła się przy stężeniach trawionego plazmidu tak niskich, jak 7 ng/μl, ale typowe stężenia na tym etapie wahają się od 15 do 25 ng/μl. Reakcja transkrypcji może być również inkubowana przez noc w temperaturze 37 °C, ale nie zwiększa to znacząco wydajności RNA.
  3. Dodać 1 μl DNazy (2 000 jednostek/μl) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Nie należy przekraczać 10 minut, w przeciwnym razie enzym może rozpocząć degradację RNA.
  4. Dodaj 30 μl lodowatego 7,5 - 8 M chlorku litu i 30 μl schłodzonej wody wolnej od nukleaz, aby wytrącić RNA. Przesuń rurkę, aby wymieszać. Pozostawić wytrącanie RNA przez noc w temperaturze -20 °C.
  5. Zebrać RNA przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Umyć osad raz 1 ml świeżo przygotowanego 75% etanolu w wodzie z pirowęglanem dietylu (DEPC), a następnie powtórzyć wirowanie.
  6. Usuń i wyrzuć supernatant, odwróć probówkę na czystym ręczniku papierowym i pozostaw do wyschnięcia na 10 minut. Ponownie zawiesić osad w wodzie wolnej od nukleaz. Jeśli osad jest dobrze widoczny, należy go ponownie zamieszać w 25 μl. Jeśli osad jest bardzo mały lub niewidoczny, ponownie umieścić go w 15 - 20 μl. Uzyskać oszacowanie stężenia RNA za pomocą spektrofotometru.
    Uwaga: Typowe stężenia RNA wahają się od 200 do 500 ng/μL.

3. Wizualizacja sond RNA za pomocą elektroforezy w żelu formaldehydowym RNA w celu oceny czystości RNA

UWAGA: Formaldehyd stwarza zagrożenie wdychania; dlatego należy wytwarzać roztwory wymagane do analizy żelu RNA w dygestorium. Bromek etydyny jest podejrzewany jako czynnik rakotwórczy; Obchodź się ostrożnie.

  1. Przygotuj 1% żel agarozowy formaldehydu, jak opisano wcześniej24 i wlej żel do pudełka z żelem wolnym od RNaz. Po ostygnięciu napełnij pudełko żelowe 1x buforem do biegania (1x MOPS o pH 7,0, 5% formaldehydu).
  2. Przygotować bufor do próbek (5 μl 400 mg/ml bromku etydyny, 20 μl 10x MOPS, 35 μl formaldehydu i 100 μl formamidu). Połącz 2 μl sondy RNA (krok 2.6) z 8 μl buforu próbki. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  3. Przygotuj bufor ładujący RNA, łącząc 5 ml 50% glicerolu, 1 ml 10% formaldehydu, 40 mg błękitu bromofenolowego, 40 mg cyjanolu ksylenowego i 20 μl 0,5 M EDTA (pH 7,5). Po użyciu należy przechowywać ten bufor w temperaturze -20 °C.
  4. Dodać 3 μl buforu ładującego do próbki RNA z kroku 3.2 i wymieszać. Probówki z próbkami należy przechowywać na lodzie.
  5. Załadować do żelu całą objętość próbki z kroku 3.4. Załaduj podwielokrotność jednoniciowej drabinki RNA obok, aby zweryfikować rozmiar RNA. Uruchom żel przy napięciu 100 V lub niższym, aż niebieski barwnik będzie migrował w około 75% w dół żelu. Wizualizacja RNA w świetle UV za pomocą żelowego systemu obrazowania.
    Uwaga: Dobrej jakości sonda RNA powinna wyglądać jak dyskretne pasmo o ruchomości odpowiadającej oczekiwanemu rozmiarowi sondy (Rysunek 2, linia 1). Jeśli sonda wygląda jak rozproszona i rozmazana wstęga (Rysunek 2, pas 2), nie należy tego używać.

4. Zbieranie i utrwalanie jelit kleszcza

  1. Zbierz nimfy Ixodes scapularis, które żywiły się myszami w interesujących miejscach w czasie.
    Uwaga: Na potrzeby tej techniki najlepiej sprawdzają się kleszcze karmione przez 48 lub 72 godziny.
  2. Wypreparuj jelito od kleszcza do MEMFA (Tabela 1) na szklanym szkiełku pod mikroskopem preparacyjnym, unikając w jak największym stopniu uszkodzenia narządu. Umieść znacznika na czystym szkiełku mikroskopowym w 20 - 30 μl MEMFA. Za pomocą sterylnej żyletki ze stali wysokowęglowej #11 przetnij obszar głowy w miejscu tarczy kleszcza, pozostawiając ciało kleszcza. Delikatnie dociśnij ciało, aby wypchnąć uchyłki jelit i gruczoły ślinowe z naskórka ciała. Oddziel gruczoły ślinowe i jelita i zgarnij wnętrzności na żyletce.
  3. Zbierz wnętrzności do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl MEMFA. Inkubować probówkę w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem przez 1 godzinę lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Gruczoły ślinowe kleszczy mogą być również preparowane i podobnie utrwalane i barwione.
  4. Odwodnić tkankę, myjąc delikatnie 3 razy 1 ml lodowatego 100% etanolu. Pozwól wnętrznościom naturalnie opaść na dno probówki między każdym praniem, ponieważ wirowanie może uszkodzić tkankę. W przypadku długotrwałego przechowywania próbki należy przechowywać w 100% etanolu w temperaturze -20 °C.

5. Budowa siatkowych koszy na próbki i 24-dołkowego uchwytu na kosze

  1. Odetnij spód probówek wirówkowych typu snap-top o pojemności 2 ml lub 5 ml za pomocą rozgrzanej, jednosiecznej żyletki na skalpelu.
    UWAGA: Ostrze może wymagać kilkukrotnego podgrzania przed zakończeniem cięcia.
  2. Wytnij kwadraty siatki nylonowej o grubości 110 μm nieco większe niż nowy otwór na rurkę. Przymocuj siatkę do dolnej części rurki, lekko dociskając je do płyty grzejnej na średnim ogniu, aż do uzyskania dobrego uszczelnienia. Pozostaw do ostygnięcia, upewnij się, że nie ma szczelin między siatką a rurką i przytnij nadmiar siatki wokół krawędzi.
  3. Wyciąć otwory w pokrywie płytki 24-dołkowej w taki sposób, aby krawędź kosza na próbkę wykonanego w kroku 5.2 znajdowała się przy otworze i nie wypadała, co daje ustawienie, w którym dna koszy na próbki będą znajdować się w studzienkach po umieszczeniu ich w otworach w pokrywie.
  4. Użyj tego dopasowanego uchwytu na kosz, aby stosunkowo łatwo przenosić kosze z jednej płyty na drugą przez cały protokół hybrydyzacji in situ. Użyć dwóch płytek 24-dołkowych, tak aby podczas jednej inkubacji druga płytka była przygotowana do następnego przemycia.

6. Hybrydyzacja in situ: Dzień 1 (czas: 4 - 5 godzin)

  1. Przenieś jelita do oznakowanych koszy na próbki, oddzielonych warunkami eksperymentalnymi i zamierzoną sondą RNA.
    Uwaga: Zabarwić co najmniej 5 wnętrzności na warunek, aby uwzględnić naturalną zmienność między powtórzeniami.
  2. Próbki należy delikatnie uwodnić, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków powietrza do tkanki, stopniowo zwiększając stosunek soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do 0,1 % niejonowego środka powierzchniowo czynnego (PTw; Tabela 1) do etanolu w myjniach.
    Uwaga: Zakończ wszystkie prania w 24-dołkowym uchwycie kosza w temperaturze otoczenia, delikatnie mieszając, chyba że zaznaczono inaczej. Porcję 500 - 600 μl roztworów płuczących do każdego dołka posiadacza tak, aby wnętrzności w każdym koszu były całkowicie zanurzone. Przygotuj wszystkie roztwory wodą uzdatnioną DEPC, aby zapobiec degradacji RNA.
    1. Myć próbki przez 5 minut w 500 μl 100% etanolu.
    2. Przygotować co najmniej 500 μl na koszyk próbek 75%, 50% i 25% etanolu w PTw. Ponownie uwodnić próbki, przemłukując je przez 5 minut w każdym roztworze etanolu, przechodząc od najwyższego stężenia etanolu do najniższego.
    3. Przemyć próbki 4 razy przez 5 minut każda w PTw.
  3. Próbki należy przepuszczać proteinazą K (10 μg/ml) w PTw przez 5 minut.
  4. Przygotuj tkankę do hybrydyzacji za pomocą sond RNA.
    1. Przemyć próbki dwukrotnie, jak opisano w ppkt 6.2, w 24-dołkowym uchwycie kosza w temperaturze otoczenia, delikatnie mieszając przez 5 minut każda, w 500 μl buforu trietanoloaminy (0,1 M, pH 7,0-8,0) (Tabela 1) w celu utrzymania próbek w środowisku wolnym od amin.
    2. Próbki należy poddać dwukrotnej obróbce 500 μl 0,25% bezwodnika octowego w buforze trietanoloaminowym (0,1 M, pH 7,0 - 8,0) przez 5 minut, a następnie przemyć próbki dwukrotnie w PTw przez 5 minut każda.
      Uwaga: Bezwodnik octowy acetyluje wolne aminy w celu zneutralizowania ładunku dodatniego, co ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania niespecyficznym oddziaływaniom elektrostatycznym i zapewnienia specyficznego wiązania sondy z mRNA.
    3. Utrwal wnętrzności na 20 minut za pomocą 500 μl 4% paraformaldehydu w PTw, a następnie umyj 5 razy w PTw przez 5 minut każdy.
    4. Wstępną hybrydyzację przeprowadza się przez inkubację próbek w buforze do hybrydyzacji o pojemności 500 μl / w 24-dołkowym uchwycie kosza na płytce 24-dołkowej (tabela 1) przez 1,5 - 2,5 godziny w temperaturze 60 °C z delikatnym mieszaniem w wytrząsającej łaźni wodnej. Zapisz bufor hybrydyzacji używany na etapie prehybrydyzacji do ponownego użycia w protokole dnia 2 (krok 7.1).
    5. Przygotować roztwory hybrydyzacyjne sondy, rozcieńczając sondy RNA w buforze hybrydyzacyjnym do końcowego stężenia 1 μg/ml.  Próbki inkubować z roztworami hybrydyzacyjnymi sondy w 24-dołkowym uchwycie kosza w temperaturze 60 °C z delikatnym mieszaniem przez noc w wytrząsającej łaźni wodnej (tabela 2). Przykryj płytkę z uchwytem kosza szczelnie folią aluminiową, aby zapobiec parowaniu roztworu hybrydyzacyjnego.

7. Hybrydyzacja in situ: Dzień 2 (czas: 4,5 - 5,5 h)

  1. Usuń próbki z roztworów hybrydyzacyjnych sondy i umieść je w zarezerwowanym buforze hybrydyzacyjnym z poprzedniego dnia. Inkubować w temperaturze 60 °C z delikatnym mieszaniem przez 3 min.
    Uwaga: Roztwory hybrydyzacyjne sondy mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do ponownego użycia do 3 razy.
  2. Przygotować 2x bufor soli fizjologiczno-cytrynianowej (SSC), rozcieńczając 20x SSC w wodzie uzdatnionej DEPC (Tabela 1). Przemyć próbki dwukrotnie przez 3 minuty 2x SSC, a następnie 3 razy przez 20 minut 2x SSC w temperaturze 60 °C w celu usunięcia wszelkich śladów sondy i buforu hybrydyzacyjnego.
  3. Traktować RNazą A (20 μg / ml) i RNazą T1 (10 μg / ml) w 2x SSC przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby usunąć jednoniciową sondę RNA reprezentującą wolny niezhybrydyzowany RNA.
  4. Umyć raz 2x SSC przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować 0,2x SSC, rozcieńczając 2x SSC w wodzie uzdatnionej DEPC, a następnie przemyć dwukrotnie 0,2x SSC przez 30 minut w temperaturze 60 °C, aby usunąć nadmiar RNaz.
  5. Przemyć dwukrotnie 500 μl buforu kwasu maleinowego (MAB; Tabela 1) po 10 minut.
  6. Próbki inkubować z roztworem blokującym (2% odczynnik blokujący w MAB) przez 1,5 - 2 h.
    Uwaga: Odczynnik blokujący może być trudny do rozpuszczenia; Delikatne ogrzewanie wspomaga rozpuszczanie.
  7. Zastąpić roztwór blokujący 500 μl przeciwciała sprzężonego z fosfatazą alkaliczną anty-digoksygeniny w rozcieńczeniu 1:3 000 w roztworze blokującym i inkubować w temperaturze pokojowej przez około 4 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc.

8. Hybrydyzacja in situ: Dzień 3 (czas: od 6 godzin do nocy)

  1. Przemyć próbki co najmniej 5 razy przez 30 minut każdą 500 μl MAB w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał.
    Uwaga: Pranie to jest elastyczne i można je przedłużyć do 1 - 2 godzin lub 3 - 4 prania można zastąpić jednym myciem na noc w temperaturze 4 °C przy minimalnym wpływie na skuteczność.
  2. Przemyć dwukrotnie przez 5 minut alkalicznym buforem fosfatazy o pH 9,5 (bufor AP; Tabela 1).
  3. Reakcję barwną należy rozpocząć od zastąpienia ostatniego przemywania 500 μl podłoża chromogennego dla fosfatazy alkalicznej (tabela materiałów). Przykryj płytkę próbki folią aluminiową i pozwól barwieniu postępować w temperaturze pokojowej przez 3-5 godzin lub przez noc w temperaturze 4 °C. Okresowo monitoruj reakcję barwienia, oglądając tkankę pod mikroskopem preparacyjnym, aby uniknąć nadmiernego barwienia.
    Uwaga: Po zakończeniu barwienia w próbkach sondowanych antysensownie pod mikroskopem można wyczuć fioletowy odcień, ale nie należy dopuścić do tego, aby tkanka stała się bardzo ciemna. Barwienie przebiega bardzo wolno w temperaturze 4 °C i może trwać do 20 - 24 godzin.
  4. Zatrzymaj reakcję kolorystyczną, myjąc przez 5 minut w 500 μl MAB, a następnie utrwal tkankę na noc w roztworze Bouina.
    UWAGA: Z roztworem Bouina należy obchodzić się pod wyciągiem; Jest to czynnik rakotwórczy.

9. Hybrydyzacja in situ: Dzień 4 (czas: 3 - 3,5 h)

  1. Przygotować co najmniej 7 ml na kosz na próbkę 1x SSC, rozcieńczając 20x SSC w wodzie uzdatnionej DEPC. Usunąć roztwór Bouina, przemłukując próbki 4 do 6 razy 70% etanolem w 1x SSC, aż tkanka przestanie być żółta.
  2. Przygotować 500 μl na koszyk próbek zawierających 75%, 50% i 25% roztwory etanolu w 1x SSC. Myć próbki przez 5 minut w każdym roztworze, przechodząc od najwyższego stężenia etanolu do najniższego, aby ponownie nawodnić tkankę. Prać dwa razy po 5 minut w 1x SSC.
  3. Próbki inkubować w roztworze wybielacza (tabela 1) przez 90 minut na lightboxie w dygestorium.
    Uwaga: Ten krok pozwala na usunięcie wszelkich pigmentacji w próbkach lub zabarwienia z roztworu Bouinsa i wzmacnia sygnał sondy w celu uzyskania wyraźnej wizualizacji.
  4. Przemyć próbki dwukrotnie 500 μl 1x SSC przez 5 minut.
  5. Przenieś wnętrzności z minimalnymi uszkodzeniami, odwracając kosz na próbki do dołka nowej 24-dołkowej płytki i przemyj 70% etanolem przez dno siatki za pomocą pipety transferowej. W razie potrzeby przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Aby uzyskać przegląd wzorców barwienia wielu próbek, jak pokazano na Rysunek 3, utrzymuj wnętrzności w 70% etanolu na płytce 24-dołkowej i obejrzyj pod dowolnym mikroskopem jasnego pola. Aby zbadać poszczególne jelita pod mikroskopem jasnego pola, jak pokazano na Rysunek 4, Rysunek 5 i Rysunek 6, zamontuj wnętrzności w 100% glicerolu pod szkiełkami nakrywkowymi. Użyj plastikowej szpatułki, aby delikatnie manipulować tkanką przy minimalnych uszkodzeniach.
    Uwaga: Wysoka lepkość glicerolu pomaga chronić tkankę przed uszkodzeniem przez kompresję i umożliwia staranne ustawienie uchyłków, tak aby tkanka mogła być optymalnie oglądana przy większych powiększeniach.
  7. Rejestruj obrazy pod mikroskopem za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazów specyficznego dla mikroskopu (tabela materiałów) i eksportuj jako obrazy TIFF do ogólnego oprogramowania do edycji obrazów. Aby określić ilościowo względne różnice w barwieniu między zabiegami eksperymentalnymi, pobierz ogólne oprogramowanie do analizy obrazu (tabela materiałów). Otwórz obraz w oprogramowaniu do analizy i skorzystaj z instrukcji zawartych w oprogramowaniu, aby zmierzyć intensywność pikseli barwienia i obliczyć wykresy histogramu barwienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar i oszacowanie jakości sond RNA są kluczowe przed rozpoczęciem barwienia. Skuteczność transkrypcji in vitro zależy w dużym stopniu od ilości i jakości matrycy DNA. Rutynowo wizualizowaliśmy sondy RNA na żelu formaldehydowym, aby zweryfikować czystość i ilość sondy generowanej w reakcjach transkrypcji. Sondy powinny wyglądać jak jasne, dyskretne pasma (Rysunek 2). Spektrofotometryczne pomiary stężenia RNA były wysoce wskaźnikowe dla jakości sondy i dobrze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jest to pierwsze zastosowanie techniki hybrydyzacji in situ (WMISH) w celu zbadania mikrobioty stawonoga-wektora patogenów. Nasz protokół został zaadaptowany z protokołu użytego do badania rozwoju u Drosophila i w zarodkach żab25,26. Hybrydyzacja in situ całego RNA jest rutynowo stosowana do lokalizacji transkryptów genów przestrzennie i czasowo27, a wizualizację transkryptów można wykonać za pomocą jasnego pola ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy dr Mustafie Khokha, Yale University, za udostępnienie jego zasobów laboratoryjnych. Jesteśmy wdzięczni Panu Ming-Jie Wu za doskonałą pomoc techniczną. EF jest badaczem HHMI. Praca ta została wsparta darowizną z Funduszu Badań nad Boreliozą Johna Monsky'ego i Jennifer Weis Monsky.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sefar NITEX Siatka nylonowa, 110 mikronówAmazon03-110/47
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360
Digoxygenin-11-UTPRoche1209256910
dNTPNew England Biolabs N0447S
DNAza I (bez RNAse)New England BiolabsM0303S
Zestaw do syntezy RNA HiScribe SP6England BiolabsE2070S
HiScribe T7 Wysokowydajny zestaw do syntezy RNANew England BiolabsE2040S
Woda, wolna od RNaz, poddana działaniu DEPCAmerykańskiAB02128-00500
EDTA, 0,5 M, pH 8,0American BioanalyticalAB00502-01000
Formaldehyd, 37%JT Baker2106-01
Formamid AmericanBioanalyticalAB00600-00500
EGTASigma AldrichE-4378
DPBS, 10XGibco14300-075
Tween-20Sigma AldrichP1379-25ML
Proteinaza KSigma Aldrich3115879001
Trietanoloamina HClSigma AldrichT1502-100G
Bezwodnik octowySigma Aldrich320102-100ML
ParaformaldehydThermoScientific/Pierce28906
SSC, 20XAmerican BioanalyticalAB13156-01000
RNA z drożdżytorulaSigma AldrichR3629-5G
Heparyna, sól sodowaSigma AldrichH3393-10KU
Roztwór Denhardta, 50XSigma AldrichD2532-5ML
CHAPS hydratSigma AldrichC3023-1G
RNaza ASigma Aldrich10109142001
RNaza T1ThermoScientific EN0541
Kwas maleinowySigma AldrichM0375-100G
Odczynnik blokującySigma Aldrich11096176001
Anty-Digoxigenin-AP, fragmenty FabSigma Aldrich11093274910
Chlorowodorek lewamizoluSigma Aldrich31742-250MG
Chromogenny substrat do fosfatazy alkalicznejSigma Aldrich
Roztwór BouinaSigma AldrichHT10132-1L
Nadtlenek wodoruMallinkrodt Baker, Inc2186-01
Jednoniciowa drabinka RNAAmbion -MilleniumAM7151
 #11 Ostrza ze stali wysokowęglowej C i A Premiera Naukowa#11-9411
TermocyklerBioRad, CA1851148
SpektrofotometrThermoScientific NanoDrop 2000C
VWRDS-500E Cyfrowa wytrząsarka
Kąpiel wodna z wytrząsaniemBELLCO Glass, IncHot Shaker-7746-12110
Żel  system dokumentacjiBioRadGel Doc XR+ System
Mikroskop jasnego pola NikonNikonSM2745T
 ZeissAXIO Scope.A1
 ZeissSTEMI 2000-C
  Kaseton świetlnyVWR102097-658
Zestaw do oczyszczania PCR Qiagen28104
Oprogramowanie do przechwytywania obrazuZeissZen lite
Oprogramowanie do edycji obrazu Adobe Adobe Photoshop CS4 wersja 11.0
Oprogramowanie do analizy obrazuNational Institutes of HealthImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Oprzyrządowanie kompatybilne z automatyzacjąIntavis Bioanalytical Instruments, Tybinga, Niemcy). Intavis, Biolane HT1.16v
New 11442074001Wytrząsarka orbitalna oscylacyjnadokumentacji żeluMikroskop jasnego pola Mikroskop preparacyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107(2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573(2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87(2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184(2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38(2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wizualizacja przewodu pokarmowego kleszczatechnika preparatu ca egoanaliza mikrobiotydetekcja sond RNAsekcja tkanekutrwalanie w MEMFAsubstrat chromogennyprzemywanie w SSCkontrola jako ci sond

Powiązane artykuły