W tym artykule pokazujemy tworzenie kultur klonalnych jednokomórkowych koniugujących gatunków glonów zebranych z naturalnego stanowiska polowego.
Artykuł metodologiczny
Ustanowienie klonalnej hodowli jednokomórkowych glonów sprzężonych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niezbędne jest stworzenie klonalnych kultur mikroalg do wykorzystania w badaniach różnych tematów, takich jak fizjologia, genetyka, taksonomia i mikrobiologia. Dlatego niezwykle ważne jest opracowanie technik tworzenia kultur klonalnych. W tym artykule pokazujemy tworzenie kultur klonalnych sprzężonych glonów. Próbki wody pobierane są z pola. Następnie komórki izoluje się za pomocą szklanej pipety kapilarnej, umieszcza w pożywce i hoduje w warunkach odpowiednich do wytworzenia kultury klonalnej.
Wprowadzenie
Koniugujące glony (rzędu Zygnematales), znane również jako koniugaty, zajmują kluczową pozycję filogenetyczną jako najbliżsi żyjący krewni bezpośrednich przodków roślin lądowych1,2. Ugruntowane hodowle klonalne glonów doprowadziły w ostatnich latach do wielu różnych badań taksonomicznych, fizjologicznych i genetycznych. Techniki izolacji mikroorganizmów z naturalnego pola mają długą tradycję3,4. W ostatnich latach opracowano również techniki automatycznej izolacji z wykorzystaniem cytometrii przepływowej5. Najpowszechniejszą metodą stosowaną do uzyskania pojedynczej komórki w celu założenia hodowli klonalnej jest izolacja pojedynczej komórki za pomocą szklanej pipety kapilarnej6. Ta tradycyjna metoda wymaga umiejętności i precyzyjnego protokołu eksperymentalnego.
W tym artykule pokazujemy pobieranie próbek glonów z próbek terenowych oraz tworzenie kultur klonalnych jednokomórkowych koniugujących glonów, takich jak gatunki Closterium, za pomocą szklanej pipety kapilarnej. Próbkę wody zawierającą komórki wegetatywne pobiera się z terenu polowego (np. jeziora, stawu lub pola ryżowego). Komórki izoluje się od próbki wody za pomocą szklanej pipety kapilarnej, a następnie przemywa. Komórki hoduje się w probówce zawierającej pożywkę uzupełnioną azotem (pożywka CA) w temperaturze 24 °C w 16-godzinnym trybie jasnym: 8-godzinnym ciemnym. Ta metoda nadaje się również do izolowania innych mikroalg w celu wytworzenia kultur klonalnych.
Protokół
1. Pobieranie próbki wody zawierającej glony
UWAGA: Jednokomórkowe koniugaty rosną w stojących obszarach słodkowodnych, takich jak jeziora, bagna i pola ryżowe. Z jednego z tych środowisk pobiera się próbkę wody zawierającej glony w celu wytworzenia szczepu kulturowego. Przed rozpoczęciem procesu potrzebne są: siatka planktonowa, jednorazowa pipeta oraz butelka lub probówka o pojemności 50 ml do pobierania próbek wody.
- Użyj siatki planktonowej w środowisku jeziora, aby zebrać glony z wody. Użyj odpowiedniej siatki, w zależności od celu.
UWAGA: Górna część siatki jest przepuszczalna dla wody. Glony złapane przez sieć są skoncentrowane w dolnym pojemniku sieci planktonowej. Gruba siatka przepuszcza małe glony. Drobna siatka łatwo się zapycha. - Przenieś wodę (około 50 ml) do probówki o pojemności 50 ml lub plastikowej butelki o pojemności 100 ml. Przynieś skoncentrowaną próbkę wody do laboratorium.
- Jednokomórkowe koniugatity rosną również na bagnach lub polach ryżowych. W tych płytkich wodach próbkę wody zawierającą glony można pobrać bezpośrednio za pomocą zakraplacza. Następnie przenieś wodę (30 - 50 ml) do probówki o pojemności 50 ml lub plastikowej butelki o pojemności 50 ml.
UWAGA: Próbki wody są starannie pobierane nad powierzchnią gleby, tak aby próbka nie zawierała żadnej gleby.
2. Potwierdzenie obecności glonów
UWAGA: Wymagane są następujące elementy: lupa lub przenośny mikroskop oraz czasza 60 mm do obserwacji.
- Aby potwierdzić obecność glonów w próbce, gdy znajduje się ona w jednorazowej pipecie, użyj lupy do bezpośredniej obserwacji próbki.
UWAGA: Większe komórki o długości około 400 - 1 000 μm (np. Closterium ehrenbergii) można łatwo zaobserwować za pomocą tej metody. - Aby potwierdzić glony pod przenośnym mikroskopem, wlej próbkę wody do plastikowego naczynia laboratoryjnego.
- Umieścić próbkę (około 3 ml) na wewnętrznej części górnej połowy (pokrywy) płytki Petriego o średnicy 60 mm, a następnie umieścić dolną połowę, tak aby jej dolna część była skierowana w stronę wewnętrznej części pokrywki, na górze.
UWAGA: Ta metoda zapobiega przemieszczaniu się próbki i ułatwia obserwację.
- Umieścić próbkę (około 3 ml) na wewnętrznej części górnej połowy (pokrywy) płytki Petriego o średnicy 60 mm, a następnie umieścić dolną połowę, tak aby jej dolna część była skierowana w stronę wewnętrznej części pokrywki, na górze.
3. Przygotowanie szklanej pipety kapilarnej z pipety Pasteura do izolacji
UWAGA: Przed rozpoczęciem procesu potrzebne są następujące elementy: wysterylizowane pipety Pasteura, stojak na pipety Pasteura, rękawiczki, gumowa żarówka, lampa spirytusowa, metanol do lampy spirytusowej, zapalniczka, kleszcze, kosz na śmieci na szkło oraz clean room lub okap z przepływem laminarnym (jeśli to konieczne).
- Zapal palnik alkoholowy.
- Aby wyprodukować cienką szklaną pipetę kapilarną do izolacji, upewnij się, że płomień nie migocze. Naostrz płomień i rozpuść pipetę Pasteura na jej końcówce.
- Podgrzej sterylną szklaną pipetę Pasteura na płomieniu, podpartą ręcznie z boku gumowej bańki, a po stronie końcówki za pomocą kleszczy.
- Zdejmij pipetę Pasteura z ognia i rozciągnij ją.
- Gdy szklanka się topi, szybko wyjmij pipetę Pasteura z płomienia, a następnie pociągnij.
UWAGA: W tym eksperymencie pipeta Pasteura została przedłużona o 15 - 20 cm. Upewnij się, że pipeta nie pali się podczas ciągnięcia.
- Gdy szklanka się topi, szybko wyjmij pipetę Pasteura z płomienia, a następnie pociągnij.
- Odłamać końcówkę szklanej pipety kapilarnej na odpowiednią długość. Ponieważ część łukowa jest najlepsza, idealnie nadaje się do końcówki.
UWAGA: W tym badaniu przygotowano szklaną pipetę kapilarną z końcówką o długości 5 - 10 cm.- Pamiętaj, aby wyrzucić kapilarnę po jej stopieniu i upewnić się, że płomień został zgaszony.
- Pęcherzyki uwalniane ze szklanej pipety kapilarnej wskazują rozmiar otworu końcówki. Wybierz odpowiedni rozmiar komórki, która ma zostać odizolowana. Około 1 mm pęcherzyków jest odpowiednie do izolacji gatunków Closterium, o szerokości komórek 10 - 20 μm.
4. Izolacja pojedynczej komórki za pomocą szklanej pipety kapilarnej
UWAGA: Przed rozpoczęciem potrzebne są następujące elementy: mikroskop z odwróconym światłem, okulary zegarkowe, plastikowe naczynie i sterylne probówki z gwintem zawierające pożywkę CA (Tabela 1) lub kondycjonowaną pożywkę CA7.
- Przygotuj kilka szkieł zegarkowych (o średnicy 22 mm i głębokości 1 mm), z których każde zawiera 1 ml sterylnego podłoża CA.
- Wyizolować komórkę docelową od próbki wody pobranej na polu.
- Wlej próbkę wody (około 30 - 40 ml) zawierającą komórki docelowe do plastikowego naczynia.
- Obserwując próbkę w plastikowym naczyniu pod mikroskopem z odwróconym światłem, pobierz pojedyncze komórki za pomocą szklanej pipety kapilarnej.
- Umieść szklaną pipetę kapilarną w pobliżu komórki, aby ułatwić aspirację komórki przez działanie kapilarne.
- Przenieś komórki do szkła zegarka zawierającego 1 ml sterylnego podłoża CA (Rysunek 1a).
- Ponownie pobrać komórki za pomocą nowej szklanej pipety kapilarnej ze sterylnego podłoża CA i przenieść je do drugiego szkła zegarkowego zawierającego sterylne podłoże CA (Rysunek 1b).
UWAGA: Proces ten jest powtarzany, dopóki pojedyncza komórka nie zostanie wyizolowana w płytce punktowej (Rysunek 1c). - Pobrać pojedynczą komórkę za pomocą nowej szklanej pipety kapilarnej, a na koniec przenieść ją do probówki zawierającej 14 ml pożywki CA lub kondycjonowanej pożywki CA (Rysunek 1d). Próbkę inkubować w temperaturze 23 °C w 16-godzinnym cyklu światło: 8 godzin ciemności przez 2 tygodnie.
UWAGA: Nieznane czynniki proliferacji komórek, które są wydzielane z rosnących komórek do otaczającego środowiska, są zawarte w kondycjonowanej pożywce, aby ułatwić podział komórek4. Jeśli zostanie utworzona hodowla klonalna, przygotuj kondycjonowaną pożywkę CA z pożywki hodowlanej4. Kultura zmieni kolor na zielony, jeśli się powiedzie.
Wyniki
Próbkę wody (Inba1) o objętości 50 mL pobrano z jednego punktu poboru w jeziorze Inba-numa (pH 8.1, 24.7 °C; 35°44′30.2″N 140°12′08.2″E) w Sakura-shi, Chiba, Japonia, dnia 25 czerwca 2016 roku. Próbkę wody przechowywano w temperaturze 4 - 8 °C. Następnego dnia po pobraniu z próbki wody zawierającej komórki wegetatywne wyizolowano okaz Closterium sp. Z próbki wyizolowano piętnaście komórek wegetatywnych o identycznej morfologii (Inba1-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -11, -12, -13, -14 oraz -15), a następnie przemyto je metodą płukania pipetą. Piętnaście wyizolowanych pojedynczych komórek hodowano w oddzielnych probówkach zawierających 15 mL kondycjonowanego pożywki CA. Po 2 tygodniach inkubacji proliferację komórek zaobserwowano w 9 probówkach [Inba1-1, -3, -4, -5 (Rycyna 2a), -6, -9, -10, -12 (Rycyna 2b) oraz -13; Tabela 2]. Z izolatów próbki Inba1 utworzono dziewięć kultur klonalnych (Rycina 3).
Rycina 1: Schemat izolacji pojedynczej komórki. (a) Przeniesienie pojedynczej docelowej komórki alg z oryginalnej próbki wody do sterylnego medium w pierwszym szkiełku zegarkowym. (b, c) Ponowne przeniesienie komórki do kolejnego szkiełka zegarkowego w celu przemycia. Procedurę tę należy powtarzać do momentu, aż w medium nie będzie innych komórek ani zanieczyszczeń niż komórka docelowa; na schemacie pokazano trzy szkiełka zegarkowe jako przykład. (d) Na koniec przeniesienie przemytej komórki do probówki z odpowiednim medium wzrostowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Fotografie komórek wegetatywnych Closterium sp. (a) Inba1-5 oraz (b) Inba1-12. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: Utworzenie hodowli klonalnej z próbki Inba1. Probówki hodowane przez 2 tygodnie zostały sfotografowane od dołu. Gwiazdką zaznaczono proliferację komórek. Pasek skali = 2 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Nazwa pożywki | Bibliografia | Komentarze | |
| CA | Ichimura i Watanabe12 | Ca(NO3)23)24h2O | 2 mg |
| KNO3 | 10 mg | ||
| NH4NIE3 | 5 mg | ||
| β-Na2glicerofosforan·5H2O | 3 mg | ||
| MgSO₄4·7H2O | 2 mg | ||
| Witamina B12 | 0.01 μg | ||
| Biotyna | 0.01 μg | ||
| Chlorowodorek tiaminy | 1 μg | ||
| metale PIV | 0,1 ml | ||
| Fe (jako EDTA; stosunek molowy 1:1) | 0,1 ml | ||
| HEPES | 40 mg | ||
| Dopełnić wodą do objętości 100 mL | |||
| Dostosować pH do 7,2 za pomocą NaOH | |||
| Metale grupy IV P | Provasoli i Pintner13 | Na2EDTA·2H₂O2O | 100 mg |
| FeCl3·6h2O | 19,6 mg | ||
| MnCl22· 4h2O | 3,6 mg | ||
| ZnCl₂2* | 1,04 mg | ||
| $\text{CoCl}_2$26h2O | 0,4 mg | ||
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 mg | ||
| Dopełnić wodą do objętości 100 mL | |||
| Fe (jako EDTA; stosunek molowy 1:1) | Provasoli14 | Fe(NH₄)₂(SO₄)₂4)2(SO4)26 h2O, | 70,2 mg |
| Na2EDTA·2H2O, | 66 mg | ||
| Dopełnić wodą do objętości 100 mL | |||
| Warunkowana pożywka CA | Abe i wsp.7 | Inkubować komórki w świeżej pożywce CA przez 14–20 dni. Zebrać hodowlaną pożywkę poprzez filtrację przy użyciu jakościowego papieru filtracyjnego, a następnie wysterylizować przefiltrowaną pożywkę w autoklawie (121 °C przez 15 min). | |
| W NIES 1,04 mg ZnCl22 zastępuje się 2,2 mg ZnSO44·7H2O. | |||
Tabela 1: Składy pożywek użytych w niniejszym badaniu.
| Próbka wody | Nazwa komórki | Stan po hodowli | Nazwa szczepu |
| Inba1 | -1 | Komórki namnożyły się | Inba1-1 |
| -2 | Bez zmian | ||
| -3 | Komórki namnożyły się | inba1-3 | |
| -4 | Komórki namnożyły się | inba1-4 | |
| -5 | Komórki namnożyły się | inba1-5 | |
| -6 | Komórki namnożyły się | inba1-6 | |
| -7 | Bez zmian | ||
| -8 | Bez zmian | ||
| -9 | Komórki namnożyły się | inba1-9 | |
| -10 | Komórki namnożyły się | inba1-10 | |
| -11 | Bez zmian | ||
| -12 | Komórki namnożyły się | inba1-12 | |
| -13 | Komórki namnożyły się | inba1-13 | |
| -14 | Bez zmian | ||
| -15 | Bez zmian |
Tabela 2: Podsumowanie próby izolacji.
Dyskusja
Stosując niniejszą metodę, ustalono 9 szczepów klonalnych Closterium sp. z 15 komórek wyizolowanych z próbki wody (Inba1), co stanowi 60% wskaźnik sukcesu. Identyfikacja gatunków będzie w przyszłości prowadzona na podstawie obserwacji morfologicznej, a także analiz DNA, takich jak molekularna analiza filogenetyczna8.
W niniejszej metodzie świeżość próbki wody ma znaczenie dla wskaźnika sukcesu. Lepiej jest odizolować komórki od próbek wody tak szybko, jak to możliwe po pobraniu w terenie. Chociaż komórki z gatunku Closterium (np. C. ehrenbergii, kompleks C. peracerosum-strigosum-littorale ) mogą być utrzymywane w próbce wody przez około 7 dni, przechowując ją w temperaturze 4–8 °C, izolacja komórek jest pożądana w dniu pobrania lub następnego dnia. Ważne jest również, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia inne niż komórki docelowe, dlatego zwiększenie liczby powtórzeń mycia (tj. > 3x) może zapobiec zanieczyszczeniu kultur przez mikroorganizmy znajdujące się w glebie i komórkach.
Ograniczeniem tej techniki jest to, że pożywki hodowlane stosowane w tym protokole (CA lub kondycjonowane pożywki CA) nie zawsze są odpowiednie dla wszystkich koniugowanych glonów. W niektórych przypadkach może być konieczne rozważenie użycia innego medium, a także innych warunków oświetleniowych i temperaturowych. Ponadto, ponieważ trudno jest udowodnić, czy kultura wyrosła z jednej komórki, konieczne jest dokładne pobranie tylko 1 komórki podczas przenoszenia komórek do probówki. Dlatego przenoszenie powinno odbywać się za każdym razem za pomocą nowej szklanej pipety kapilarnej.
Ustanowienie hodowli klonalnej za pomocą tej metody mycia pipet jest klasyczną/standardową metodą i jest najbardziej niezawodną metodą do wykorzystania do izolacji pożądanych komórek do badania. Klonalne kultury koniugujących glonów używane w wielu badaniach 8,9,10,11 zostały ustalone przy użyciu niniejszej metody. Trudno jest analizować koniugujące glony bez hodowli klonalnej. Co więcej, w ostatnich latach sekwencje całego genomu de novo stały się łatwe do uzyskania (np. dzięki zastosowaniu sekwenatora nanoporowego MinION), a tworzenie kultur klonalnych jeszcze bardziej ułatwi sekwencjonowanie de novo. Innymi słowy, metoda ta jest pierwszym krokiem w przyszłych badaniach nad tymi algami, aby lepiej zrozumieć ich bioróżnorodność.
Aby ustalić stabilny szczep hodowlany, konieczne jest dokładne wykonanie pewnych krytycznych kroków w ramach protokołu. Najważniejszym krokiem jest przygotowanie szklanej pipety kapilarnej o optymalnym otworze, który umożliwia przejście tylko jednej komórki. Otwór szklanej pipety kapilarnej musi być nieco większy niż długość osi mniejszej komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Optymalna szklana pipeta kapilarna może zassać pojedynczą komórkę za pomocą działania kapilarnego. Jeśli jednak średnica otworu jest zbyt duża, kapilara będzie również przyciągać nieożywione materiały zanieczyszczające, a nawet inne organizmy, oprócz komórki docelowej.
Aby uzyskać szklaną pipetę kapilarną o optymalnym otworze, należy zwrócić uwagę na następujące punkty. Po pierwsze, słup płomienia musi być wąski podczas podgrzewania szklanej pipety kapilarnej. Następnie, wyciągając pipetę Pasteura, należy ją zdjąć z płomienia; w przeciwnym razie otwór pipety Pasteura zapadnie się.
Wyposażenie i pojemniki przedstawione w tym protokole są podstawowe i mogą być modyfikowane. Na przykład, używając płytek wielodołkowych zamiast szkieł zegarkowych z jednym dołkiem, mycie komórek może być bardziej wydajne. Ponadto pojemniki można zastąpić innymi podobnymi. Przenosząc pojedynczą komórkę do pożywki hodowlanej na ostatnim etapie, można ustalić hodowlę klonalną.
Przygotowanie wysterylizowanego pojemnika i praca w kapturze spowoduje powstanie aksenów (nieskażonych) szczepów. Aby zapobiec zanieczyszczeniu, konieczne jest powtórzenie etapu mycia ze świeżymi porcjami więcej niż 3 razy. Czasami bakterie są również sterylizowane przez dodanie antybiotyków15.
Metoda ta koncentrowała się na izolacji desmid (Zygnematales), ale zmieniając rozmiar szklanego otworu pipety kapilarnej, można ją zastosować do izolacji planktonu o różnej wielkości.
Podziękowania
Dziękujemy Hisayoshi Nozaki (Uniwersytet Tokijski), Takashi Nakada (Uniwersytet Keio), Yuka Marukawa Hashimoto (Japoński Uniwersytet Kobiet) i Hiroyuki Sekimoto (Japoński Uniwersytet Kobiet). Dziękujemy recenzentom za uwagi. Badanie to zostało wsparte grantem na badania naukowe (nr 26440223 i 15H04413) z Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki w Japonii oraz z grantu Fundacji Rozwoju Nowych Technologii dla Yuki Tsuchikane.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Sampling | |||
| Plankton net | RIGO, Japonia | N-NO380T | Rozmiar oczek: 32 &mikro; m |
| Mikroskop przenośny (np. Nature Scope FABRE) | Nikon, Japonia | STYCZEŃ: 4960759 206725 | Powiększenie: 20 razy; |
| Lupa (np. Lupa Steinheil Peak 1985 | Tohkai Sangyo Co. Ltd., Japonia | 1985-20 | Powiększenie: 20 razy; |
| Spuit | EIKEN CHEMICAL CO. LTD. Japonia | Sterylna rurka nr 4 | |
| 50 ml (probówki wirówkowe 50 ml z zakrętkami) | Labcon, USA | 3181-345-008 | |
| Butelka (100 ml butelka z poliwęglanu) | AS ONE Corporation, Japonia | 1-7403-01 | |
| Naczynie 60 mm | Asahi glass Co. Ltd., Japonia | 1010-060 | Do obserwacji glonów. 60 mm/naczynie nieobrobione |
| Przygotowanie pipety do mikropipet | |||
| Pasteura (bawełniane zatyczki 9") Pipety Pasteura) | Fisher Scientific, USA | 13-678-8B | 7 & razy; 225 mm |
| Gumowa bańka (SPOID SILICONE, 1 cc) | AS ONE Corporation, Japonia | 5-5669-01 | 10 i razy; 40 mm |
| Kleszcze ze stali nierdzewnej | AS ONE Corporation, Japonia | PT-09 | 110 mm |
| Izolacja jednokomórkowa | |||
| Szkło zegarkowe (tablica do reakcji krwi) | Sekiya Rika Co., Ltd, Japonia | F14-155-030 | do płukania komórek podczas izolacji. Średnica 22 mm i głębokość 1 mm |
| Probówki gwintowane | Fujimotorika, Co., Ltd, Japonia | XX142 | 18 & Oslash; × 170 mm |
| Mikroskop światła odwróconego | Olympus, Tokio, Japonia | CKX41N | do izolacji glonów. |
| Naczynie plastikowe | Asahi glass Co. Ltd., Japonia | SH90-15E | 90 i razy; Grubość 15 mm |
Bibliografia
- Wickett, N. J., et al. Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).
- Delwiche, C. F., Cooper, E. D. The evolutionary origin of a terrestrial flora. Current Biology. 25, R899-R910 (2015).
- Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms. British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).
- Pringsheim, E. G. Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance. , Cambridge University Press. London, UK. 119(1946).
- Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).
- Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).
- Abe, J., et al. Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).
- Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta). Phycological Research. 59, 74-82 (2011).
- Kanda, N., et al. CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Scientific Reports. 7, 17873(2017).
- Ichimura, T. Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini. Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).
- Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex. Planta. 182, 348-354 (1990).
- Ichimura, T., Watanabe, M. The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems. Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).
- Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).
- Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).
- Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).
Przedruki i uprawnienia
