Artykuł metodologiczny

Identyfikacja markerów wirulencji Mycobacterium abscessus do replikacji wewnątrzkomórkowej w fagocytach

DOI:

10.3791/57766

⸱

27 września 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
12I, UVSQ, INSERM UMR1173, Université Paris-Saclay, 2Institut Pasteur, Unité de Pathogénomique Mycobactérienne

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do badania interakcji Phagocyte-Mycobacterium abscessus: badanie przesiewowe biblioteki mutantów transpozonów pod kątem bakteryjnego niedoboru wewnątrzkomórkowego oraz określenie bakteryjnego transkryptomu wewnątrzkomórkowego na podstawie sekwencjonowania RNA. Oba podejścia zapewniają wgląd w zalety genomu i adaptacje transkryptomiczne, poprawiając sprawność bakterii wewnątrzkomórkowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tym, co odróżnia Mycobacterium abscessus od innych saprofitycznych prątków, jest zdolność do opierania się fagocytozie przez ludzkie makrofagi i zdolność do namnażania się wewnątrz takich komórek. Te cechy wirulencji sprawiają, że M. abscessus jest patogenny, szczególnie u wrażliwych gospodarzy z podstawową strukturalną chorobą płuc, taką jak mukowiscydoza, rozstrzenie oskrzeli lub gruźlica. Nie jest jasne, w jaki sposób pacjenci zarażają się M. abscessus. W przeciwieństwie do wielu prątków, M. abscessus nie występuje w środowisku, ale może znajdować się w amebach, fagocytach środowiskowych, które stanowią potencjalny rezerwuar M. abscessus. Rzeczywiście, M. abscessus jest oporny na fagocytozę amebową, a życie wewnątrz ameby wydaje się zwiększać zjadliwość M. abscessus w eksperymentalnym modelu infekcji. Jednak niewiele wiadomo na temat zjadliwości M. abscessus jako takiej. Aby rozszyfrować geny nadające przewagę wewnątrzkomórkowemu życiu M. abscessus, opracowano badania przesiewowe biblioteki mutantów transpozonów M. abscessus. Równolegle opracowano metodę ekstrakcji RNA z wewnątrzkomórkowych prątków po wspólnej hodowli z amebami. Metoda ta została zwalidowana i pozwoliła na sekwencjonowanie całych transkryptomów M. abscessus wewnątrz komórek; zapewniając po raz pierwszy globalne spojrzenie na adaptację M. abscessus do życia wewnątrzkomórkowego. Oba podejścia dają nam wgląd w czynniki wirulencji M. abscessus, które umożliwiają M. abscessus kolonizację dróg oddechowych u ludzi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rodzaj Mycobacterium obejmuje różne gatunki, od nieszkodliwych organizmów saprofitycznych po główne ludzkie patogeny. Dobrze znane gatunki chorobotwórcze, takie jak Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum i Mycobacterium ulcerans, należą do podgrupy prątków wolno rosnących (SGM). Natomiast podgrupa szybko rosnących prątków (RGM) charakteryzuje się zdolnością do tworzenia widocznych kolonii w czasie krótszym niż 7 dni na podłożu agarowym. Grupa RGM obejmuje ponad 180 gatunków, głównie niepatogennych prątków saprofitycznych. Badania nad interakcjami RGM z ich gospodarzami koncentrowały się głównie na Mycobacterium smegmatis i pokazują, że prątki te są szybko eliminowane przez bakteriobójcze działanie makrofagów.

Mycobacterium abscessus jest jednym z rzadkich RGM, które są chorobotwórcze dla ludzi i jest odpowiedzialne za szeroki zakres infekcji, począwszy od infekcji skóry i tkanek miękkich, a skończywszy na infekcjach płucnych i rozsianych. M. abscessus jest uważany, wraz z Mycobacterium avium, za główny patogen prątkowy u pacjentów z mukowiscydozą1.

Różne badania przeprowadzone na M. abscessus wskazują, że ten prątek zachowuje się jak wewnątrzkomórkowy patogen, zdolny do przetrwania bakteriobójczej odpowiedzi makrofagów i fibroblastów w płucach i skórze, co zwykle nie jest obserwowane w RGM2,3,4. Analiza genomu M. abscessus zidentyfikowała szlaki metaboliczne zwykle występujące w mikroorganizmach środowiskowych mających kontakt z glebą, roślinami i środowiskami wodnymi, w których często występują wolne ameby5. Wykazali również, że M. abscessus jest obdarzony kilkoma genami wirulencji, których nie ma w saprofitycznym i niepatogennym RGM, prawdopodobnie nabytymi przez horyzontalny transfer genów w niszy sprzyjającej wymianie genetycznej, która może gromadzić różne bakterie oporne na ameby.

Eksperymentalnie, jednym z pierwszych uderzających wyników była obserwacja wewnątrzkomórkowego wzrostu M. abscessus w makrofagach, jak również u M. tuberculosis6. M. abscessus jest również odporny na zakwaszenie fagosomu, apoptozę i autofagię, trzy podstawowe mechanizmy odporności komórkowej na infekcję2. Wykazano nawet, że M. abscessus jest w stanie ustanowić natychmiastową komunikację między fagosomem a cytozolem, środowiskiem bardziej bogatym w składniki odżywcze, które może sprzyjać namnażaniu się bakterii2. Bardzo niewiele wiadomo na temat zalet genomowych, które M. abscessus posiada lub nabył, aby umożliwić przetrwanie w środowisku wewnątrzkomórkowym. Kokultura ameby to skuteczna metoda, która pozwoliła na wyizolowanie wielu nowych bakterii opornych na ameby, takich jak Mycobacterium massiliense7,8. Zaobserwowano zdolność do namnażania się w obrębie ameb w modelu aerozolizacji M. abscessus u myszy, co może powodować zwiększoną zjadliwość M. abscessus4. Jedna z hipotez głosi, że M. abscessus rozwinął cechy genetyczne napotkane w tym środowisku, aby przetrwać w komórkach fagocytarnych, które różnią się od innych niepatogennych RGM. Te nabytki mogą sprzyjać zdolności do rozprzestrzeniania się i jej zjadliwości w ludzkim gospodarzu.

Ten raport opisuje narzędzia i metody podkreślające genomiczne korzyści płynące z przetrwania M. abscessus w środowisku ameb. W tym celu najpierw opisano badania przesiewowe mutantów transpozonu M. abscessus na szczepie typu Acanthamoeba castellanii, co pozwala na identyfikację mutantów wadliwych dla wzrostu wewnątrzkomórkowego. Opisano również drugie badanie przesiewowe makrofagów, aby potwierdzić, czy ta wada utrzymuje się u ludzkiego gospodarza. Po drugie, aby zrozumieć, jakie mechanizmy są wykorzystywane w M. abscessus do przystosowania się do życia w komórkach fagocytarnych i zwiększenia jego zjadliwości w organizmie gospodarza, opracowano metodę specjalnie dostosowaną do M. abscessus, po wspólnej hodowli w obecności ameb, która pozwoliła na ekstrakcję całkowitego RNA z bakterii wewnątrzamebowych. W związku z tym opracowano kompleksowe spojrzenie na geny M. abscessus, które są niezbędne do życia wewnątrzkomórkowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Selekcja w bibliotece

  1. Budowa biblioteki mutantów Tn
    1. Pobierz bibliotekę transpozonów.
      UWAGA: Na potrzeby tego eksperymentu biblioteka mutantów transpozonów została uzyskana od E.J. Rubina, Harvard School of Public Health, Boston, USA. Biblioteka została zbudowana z gładkiego szczepu klinicznego (43S) kompleksu M. abscessus (M. abscessus subsp. massiliense) z fagiem wprowadzonym do M. abscessus, umożliwiającym losowe wstawienie pojedynczego Tn do dinukleotydu TA (91 240 sekwencji TA w genomie M. abscessus). Aby uzyskać więcej informacji, zobacz odniesienie do Rubin et al.9 oraz Laencina et al.10.
  2. Miareczkowanie biblioteki i konserwacja mutantów M. abscessusTn w plates<br /> UWAGA: Trwa to tydzień.
    1. Rozmrozić bibliotekę na lodzie. Określić stężenie bakterii, wykonując seryjne rozcieńczenia w 1 ml wody (10-1 do 10-15). Umieść kroplę każdego rozcieńczenia na szalce Petriego zawierającej pożywkę agarową 7H11 z 250 mg/ml kanamycyny. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 3–4 dni.
      UWAGA: Tutaj odzyskano miareczkowanie 1011 bakterii/ml.
    2. Po określeniu stężenia w bibliotece, rozcieńczyć bibliotekę do końcowego stężenia 3,000 bakterii/ml w 10 ml 25% glicerolu i wody. Podziel bibliotekę na 10 krioprobówek z 1 ml biblioteki w każdej probówce. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
    3. Gdy jest to gotowe do użycia, rozmrozić jedną porcję rozcieńczonej biblioteki na lodzie i dodać 100 μl biblioteki do 10 kwadratowych płytek agarowych Muellera-Hintona (MH) (rozmiar 12 cm) w celu odzyskania 200-300 pojedynczych kolonii po 3–4 dniach inkubacji w temperaturze 37 °C.
    4. Za pomocą sterylnych wykałaczek przenieś poszczególne kolonie (około 6 000 kolonii na płytkach 60 x 96-dołkowych) na 96-dołkowe płytki wypełnione 200 μl pożywki 7H9 uzupełnionej 0,2% glicerolu, 1% glukozy, 250 mg/ml kanamycyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 dni bez wstrząsania.
    5. Przenieść 100 μl kultury (etap 1.2.4) na 96-dołkową płytkę zawierającą 100 μl pożywki 7H9 z 40% glicerolem. Przechowuj zamówioną bibliotekę w temperaturze -80 °C.
    6. Powtarzaj kroki od 1.2.3 do 1.2.5 z resztą biblioteki, aż zostanie odzyskanych 10 000 pojedynczych klonów (około 100 x 96-dołkowa płytka i 30 MH).
  3. Przygotowanie ameb
    1. Hodowla ameby Acanthamoeba castellanii (AC) w75 cm 2 kolbach do hodowli tkankowych w temperaturze pokojowej (RT) w 30 ml pożywki PYG (Tabela 1) w celu amplifikacji linii komórkowej11.
      UWAGA: Dojrzałe trofozoity z dużych komórek adhezyjnych z licznymi wakuolami trawiennymi są wyraźnie widoczne pod mikroskopem. Czas podwajania ogniw szacuje się na 25 godzin. Komórki amplifikowano co 3 dni poprzez rozprowadzanie jednej trzeciej początkowej kultury w kolbach do hodowli tkankowych o długości 75cm2.
    2. Usunąć pożywkę PYG za pomocą pipety o pojemności 25 ml. Umyj komórki 10 ml buforu AC (Tabela 2), który nie zawiera żadnych źródeł węgla ani azotu12. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
      UWAGA: Bufor AC, który nie zawiera źródeł węgla ani azotu, zapobiega zewnątrzkomórkowemu wzrostowi prątków. Ta minimalna pożywka prowadzi do otorbienia ameb. Aby to ograniczyć, inaktywowane termicznie E. coli dodano jako substrat (krok 1.4) do ameb i promowano bardzo krótkie czasy hodowli (48 godzin w przypadku badań przesiewowych mutantów i 4 godziny lub 16 godzin hodowli w eksperymentach RNAseq). Alternatywnie można użyć tego podłoża, ale wzbogaconego o pożywkę PYG (zwykle 10%).
    3. Oderwać amebę od dna kolby pojedynczym, energicznym potrząśnięciem kolby do hodowli tkankowej.
    4. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby dostosować stężenie komórek do 5 x 105 ameb/ml rozcieńczonych w buforze AC.
  4. Przygotowanie inaktywowanych termicznie bakterii Escherichia coli do karmienia ameby po zakażeniu
    1. Wyhodować kliniczny izolat E. coli z glicerolu w 100 ml bulionu Luria (LB) przez noc w temperaturze 37 °C.
    2. Zebrać bakterie przez odwirowanie przy 1,835 x g przez 10 minut w probówkach o pojemności 50 ml. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 10 ml 10% glicerolu i wody. Powtórz pranie jeszcze dwa razy.
    3. Zawiesić osad w 5 ml 10% glicerolu i wody. Podaniec 0,5 ml do probówek o pojemności 1,5 ml. Określ ilość bakterii/ml, wykonując seryjne rozcieńczenia i dodając rozcieńczenia na płytkach agarowych LB. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.
    4. Dzień przed zakażeniem amebą rozmrozić jedną porcję na lodzie i przystąpić do zabijania termicznego, inkubując probówkę w temperaturze 70 °C przez 60 min.
      UWAGA: Sprawdź inaktywację, posiewając 100 μl inaktywowanych bakterii na płytkach agarowych LB przez noc w temperaturze 37 °C. Po jednej nocy hodowli nie powinny być widoczne żadne kolonie.
    5. Rozcieńczyć bakterie zabite termicznie do stężenia10-7 bakterii w 50 μl buforu AC i przechowywać rozcieńczone bakterie w temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden tydzień.
  5. Wspólna hodowla ameb-M. abscessus Tn mutant: pierwsze przesiewanie
    UWAGA: Badanie przesiewowe 6 000 mutantów zajmuje 3-4 miesiące.
    1. Rozprowadzić 5 x 104 ameby/studzienkę na 96-dołkowej płytce w 100 μl buforu AC. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 32 °C bez wstrząsania. Pozwól pływającym trofozoitom ameb przylgnąć do studni.
      1. Podczas inkubacji rozmrażaj bakterie na lodzie przez 1 godzinę.
    2. Dodać 5 μl rozmrożonych kultur bakterii za pomocą elektronicznej pipety wielokanałowej. Infekować przez 1,5 godziny. Przebadaj około 6 000 zindywidualizowanych klonów z 96-dołkowej płytki Tn mutantów.
      UWAGA: MOI jest nieznany na tym etapie protokołu; jednak wszystkie 96-dołkowe płytki zawierające mutanty Tn były hodowane dokładnie w ten sam sposób. To pierwsze badanie przesiewowe ma na celu szybką identyfikację wewnątrzkomórkowych mutantów z niedoborem, bez uwzględniania różnic w gęstości inokulum.
    3. Po 1,5 godziny infekcji odwróć 96-dołkową płytkę na sterylnych gazach umieszczonych w wysterylizowanej metalowej tacy, aby usunąć medium AC pod wyciągiem. Uzupełnij 200 μl medium AC. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    4. Dodać 200 μl świeżej pożywki uzupełnionej 100 μg/ml amikacyny, aby wyeliminować pozostałe prątki zewnątrzkomórkowe.
    5. Inkubować przez 2 godziny przed przystąpieniem do 3 dodatkowych płukań (jak opisano w kroku 1.5.3). Po umyciu utrzymuj kultury z 50 μg/ml amikacyny w 200 μl buforu AC.
    6. Dodać 5 x 107 inaktywowanych termicznie bakterii Escherichia coli (z kroku 1.4) pod koniec infekcji i co 24 godziny, aby zapobiec otorbieniu się ameb.
    7. Po 48 godzinach kohodowli poddać komórki lizie, dodając 10 μl 10% SDS (dodecylosiarczan sodu) do każdego dołka i inkubować przez 30 minut w temperaturze 32 °C. Kontynuować seryjne rozcieńczanie i dodać na płytkach agarowych Columbia zawierających 5% krwi owczej (płytki COS) w celu oceny liczby wewnątrzkomórkowych prątków. Uszczelnić płytkę parafilmem i inkubować w temperaturze 37 °C.
    8. Gdy po 3-4 dniach na płytkach agarowych pojawią się kolonie, sfotografuj płytkę i zidentyfikuj mutanty upośledzone pod względem wzrostu wewnątrzkomórkowego, obserwując osady z najmniejszą liczbą kolonii bakteryjnych.
      UWAGA: Nie przejmuj się kształtem, wysokością ani gęstością kolonii (Rysunek 1A). Zidentyfikowano 136/6000 mutantów.
  6. Kokultura ameb-M. abscessusTn mutant: drugie badanie przesiewowe mutantów zidentyfikowanych podczas pierwszego badania przesiewowego
    UWAGA: Trwa to 2 tygodnie. Drugie badanie przesiewowe należy przeprowadzić na 136 atenuowanych mutantach uzyskanych po pierwszym badaniu, aby dokładnie określić ilościowo liczbę zaszczepionych bakterii i liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych, które przeżyły 2 dni po zakażeniu.
    1. Wyhodowano 1 kolonię każdego zaatakowanego mutanta w probówkach o pojemności 50 ml wypełnionych 20 ml pożywki 7H9 uzupełnionej 0,2% glicerolu, 1% glukozy i 250 mg/ml kanamycyny. Pozwól bakteriom osiągnąć fazę wykładniczą (0,6
    2. Przemyć kulturę przez odwirowanie (1,835 x g przez 10 min) w pożywce prądu przemiennego. Odrzucić supernatant. Powtórz to płukanie jeszcze dwa razy z 20 ml pożywki 7H9 uzupełnionej 0,2% glicerolu, 1% glukozy i 250 mg/ml kanamycyny.
    3. Ponownie zawiesić bakterie w 5 ml buforu AC.
    4. Określić stężenie jednostek tworzących kolonie (CFU) mutantów. Na płytkach 24-dołkowych dodaj 1 ml wody do dwóch pierwszych rzędów. Dodać 100 μl zawiesiny bakteryjnej do pierwszego dołka. Za pomocą mikropipety wymieszaj trzy razy. Następnie odessać 100 μl i umieścić w drugiej studzience.
    5. Z nową końcówką powtórz krok 1.6.4 od drugiego dołka do trzeciego itd., aż do dwunastego dołka.
    6. Odessać 30 μl rozcieńczenia 10-12 i dodać do płytki COS. Powtórzyć dla pozostałych rozcieńczeń.
    7. Owinąć płytkę COS parafilmem i inkubować przez 3–4 dni w temperaturze 37 °C. Oznaczyć stężenie, licząc kolonie.
    8. Przeprowadzić testy współhodowli, jak opisano powyżej, w trzech powtórzeniach na 24-dołkowej płytce z 5 x 104 amebami na basenik w 1 ml pożywki do kohodowli AC. Zaszczepić się wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 10.
    9. Po 48 godzinach kohodowli należy przystąpić do lizy komórek zgodnie z opisem w kroku 1.5.7. Wykonać seryjne rozcieńczenia w wodzie (10-1 do 10-6) i dodać 30 μl do płytek COS. Inkubować płytki przez 4 dni w temperaturze 37 °C przed przystąpieniem do liczenia CFU.
      UWAGA: Po tym drugim ekranie 60 ze 136 mutantów zostało zakonserwowanych.
    10. Przechowuj dotknięte mutanty dla ich przetrwania w komórkach. Dodaj kolonię do krioprobówki zawierającej pożywkę LB z glicerolem (20% końcowy) lub do krioprobówki zawierającej roztwór handlowy i mikrogranulki, aby sprzyjać długotrwałej konserwacji i ułatwić przyszłą inokulację, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.
    11. Ocenić wzrost mutantów in vitro, mierząc gęstość optyczną (OD) przy 600 nm co 2 dni.
      1. Wyhoduj 1 kolonię każdego zaatakowanego mutanta w probówkach o pojemności 50 ml wypełnionych 20 ml pożywki 7H9 uzupełnionej 0,2% glicerolu, 1% glukozy i 250 mg/ml kanamycyny. Pozwól bakteriom osiągnąć fazę wykładniczą (0,6
      2. Wyklucz mutanty z wadą wzrostu in vitro w porównaniu ze szczepem WT z zestawu wewnątrzkomórkowych mutantów z niedoborem.
  7. Współhodowla makrofagów-M. abscessus Tn mutant wadliwy dla życia wewnątrz ameby
    UWAGA: Trwa to 1 miesiąc.
    1. Rozprowadzić 5 x 104 mysich makrofagów J774.2 na dołek 24-dołkowej płytki w 1 ml bogatej pożywki, DMEM uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS). Inkubować płytki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w celu umożliwienia adhezji makrofagów. Podaj 3 powtórzenia.
    2. Wykonaj infekcję. Inokulować mutanty Tn o MOI równym 10, rozcieńczone w DMEM z 10% FCS w objętości 100 μL.
    3. Po 3 godzinach infekcji należy wykonać trzy płukania 1 ml DMEM (można użyć pompy próżniowej). Następnie potraktuj 250 μg/ml amikacyny (w DMEM z 10% FCS) przez 1 godzinę w celu wyeliminowania pozostałych prątków zewnątrzkomórkowych.
      1. Po 3 dodatkowych płukaniach 1 ml DMEM, utrzymuj kultury w 250 μg/ml amikacyny (w DMEM z 10% FCS) do końcowej objętości 1 ml, aby zapobiec namnażaniu się zewnątrzkomórkowych prątków.
    4. 72 godziny po kohodowli usuń pożywkę i poddaj makrofagi lizie, dodając 1 ml zimnej wody. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Wykonaj testy CFU na płytkach COS, aby ocenić liczbę bakterii wewnątrzkomórkowych.
      1. Na 24-dołkowej płytce dodaj 1 ml wody do dwóch pierwszych rzędów. Dodać 100 μl lizatu kokomórkowego do pierwszego dołka. Za pomocą mikropipety wymieszaj trzy razy. Odessać 100 μl i umieścić je w drugiej studzience.
      2. Z nową końcówką powtórz rozcieńczenie od drugiego dołka do trzeciego itd. aż do dwunastego dołka. Następnie odessać 30 μl rozcieńczenia 10-12 i dodać go do płytki COS.
      3. Powtórzyć dla pozostałych rozcieńczeń. Owiń płytkę COS parafilmem i odczekaj 3-4 dni, aby zaobserwować i policzyć kolonie.
  8. Identyfikacja i sekwencjonowanie miejsca insercji Tn w mutantach M. abscessus
    UWAGA: Zajmuje to 1,5 miesiąca dla 60 mutantów.
    1. Ekstrakcja genomowa zidentyfikowanych mutantów M. abscessus
      1. Hoduj mutanty w probówce o pojemności 50 ml z 20 ml pożywki 7H9 uzupełnionej 0,2% glicerolu, 1% glukozy i kanamycyny 250 mg / ml do fazy wykładniczej (OD600 = 0,8).
      2. Zbierz 10 ml kultur (2 396 x g, 5 min). Odrzucić supernatant. Zawiesić bakterie w 500 μl roztworu I (25% sacharozy, 50 mM Tris pH 8, 10 mg/ml lizozymu, 40 mM tiomocznik). Przenieść roztwór do probówek o pojemności 2 ml z zakrętką i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
      3. Dodać 500 μl roztworu II (25% sacharozy, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA). Po pipetowaniu w górę i w dół 5-10 razy, dodaj kulki cyrkonu do uzyskania objętości 500 μl w probówce.
      4. Kontynuuj lizę komórek za pomocą homogenizatora (3 x 6,000 obr./min, 45 s) z 1-minutową inkubacją na lodzie między każdą rundą.
      5. Dodać 5 μl 20 mg/ml proteinazy K (100 μg/ml wersji końcowej) i inkubować próbki przez noc w temperaturze 55 °C.
      6. Dodać 1 ml zimnego fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1) pod wyciągiem. Wymieszać próbki przez wirowanie przed przystąpieniem do wirowania w temperaturze pokojowej i 16 500 x g przez 30 minut.
      7. Po odwirowaniu odzyskać fazę wodną i dodać równą objętość zimnego roztworu fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego pod maską. Odwirować próbki o masie 16 500 x g przez 30 minut, aby ponownie odzyskać fazę wodną.
      8. Dodać 0,7 objętości izopropanolu RT do odzyskanej fazy wodnej pod wyciągiem. Powoli odwróć probówki, aby umożliwić wytrącenie DNA i inkubuj 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wirować przez 10 minut przy 16 500 x g i RT.
      9. Usunąć supernatant i umyć osad 500 μl 70% etanolu pod maską. Odwirować probówki przez 10 minut przy 16 500 x g w temperaturze pokojowej przed usunięciem etanolu. Inkubować przez 10 minut, aby umożliwić odparowanie pozostałego alkoholu.
      10. Na koniec zawiesić osad DNA w 100 μl wody wolnej od DNazy/RNazy. Określ wydajność i czystość DNA za pomocą spektrofotometru.
      11. Usunąć 1 μg genomowego DNA i trawić za pomocą 10 j. ClaI przez jedną noc w celu subklonowania miejsca insercji Tn. Użyj protokołu producenta.
        UWAGA: Enzym ClaI jest jednym z najsilniej reprezentowanych enzymów restrykcyjnych w genomie M. abscessus (2,173 miejsca restrykcyjne). Miejsce restrykcji ClaI znajduje się również w sekwencji Tn przed kasetą oporności na kanamycynę mutanta Tn. W ten sposób subklonowanie za pośrednictwem ClaI umożliwia identyfikację miejsca insercji Tn.
    2. Podklonowanie w plazmidzie genomowego DNA zawierającego Tn
      UWAGA: Przed przystąpieniem do subklonowania Tn w plazmidzie opornym na ampicylinę pUC19 o długości 2,686 pz, należy dodać miejsce restrykcyjne ClaI w miejscu wielokrotnego klonowania plazmidu. Sekwencję plazmidu pUC19 można znaleźć pod tym linkiem https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. Postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby trawić plazmid pUC19 za pomocą EcoRI i HindIII, który uwalnia fragment 51 pz i fragment 2635 pz. Oczyść podwójnie strawiony wektor za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR, aby wyeliminować uwolniony fragment o długości 51 pz.
      2. Zmieszać 1 μl (stężenie 25 pmol/μL) dwóch komplementarnych oligonukleotydów (5'AGCT, TATA AGATCT, TATA ATCGAT, TATA3' i 5'AAT TAA, TAA, TPG, ATT ATA, AGA, TAT A3'), o objętości 28 pz, z których każdy zawiera miejsce restrykcji ClaI, a na końcach miejsca restrykcyjne HindIII i EcoRI. Podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 10 minut, a następnie schłodzić w celu ich związania.
      3. Przetrawić sparowane startery EcoRI i HindIII zgodnie z protokołem producenta.
      4. Związać 150 ng plazmidu pUC19 z ograniczeniami EcoRI/HindIII o różnym stężeniu sparowanych starterów (50 pmol/μL, 25 pmol/μL, 2,5 pmol/μL) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1 U ligazy DNA T4 w końcowej objętości 20 μL. Sprawdź klonowanie za pomocą innego trawienia enzymatycznego.
      5. Trawić zmodyfikowany plazmid za pomocą ClaI przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
      6. Zligować 50 ng plazmidu pUC19 z ograniczeniami ClaIi 50 ng genomowego DNA trawionego przez ClaI przez 1 godzinę w temperaturze RT z 1 U ligazy DNA T4 w 10 μl.
      7. Przystąpić do transformacji bakterii elektrokompetentnych E. coli za pomocą 5-10 μl ligacji (2500 V, 200 Ohm, 25 μF). Wybierz klony na płytkach agarowych LB uzupełnionych 50 μg / ml kanamycyny i 50 μg / ml ampicyliny, aby wybrać bakterie zawierające plazmidy z porcjami sekwencji Tn.
      8. Hoduj odporne klony przez noc w płynnym podłożu LB z odpowiednim doborem antybiotyków (50 μg/ml kanamycyny i 50 μg/ml ampicyliny).
      9. Ekstrakcja plazmidowego DNA. Sprawdź obecność wstawki za pomocą ograniczenia enzymatycznego i zsekwencjonuj koniec 3' Tn w celu zidentyfikowania zakłóconego genu za pomocą oligonukleotydu (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') odpowiadającego ostatnim 17 parom zasad kasety oporności na kanamycynę Tn.
      10. Dopasuj sekwencję do szczepu M. abscessus GO 06, wykonując blast nukleotydowy (BLAST-N).

2. Ekstrakcja RNA wewnątrzkomórkowych prątków do analizy Rnaseq

UWAGA: To zajmuje 4 miesiące na eksperymenty i 4 miesiące na analizę RNAseq.

  1. Kokultura ameb-M. abscessus w partiach
    UWAGA: W poniższym eksperymencie kohodowlę przeprowadza się w probówkach o pojemności 50 ml z mieszaniem, aby sprzyjać kontaktom bakterii z komórkami.
    1. Hoduj M. abscessus w pożywce 7H9 uzupełnionej 0,2% glicerolu, 1% glukozy do środkowej fazy wykładniczej przy 120 obr./min.
    2. Umyj bakterie dwukrotnie 10 ml buforu AC.
    3. Oszacuj stężenie bakterii, mierząc OD600nm (1 OD600 = 4 x 108 prątków). Dodaj 8,5 x 108 prątków do 8,5 x 106 ameb w 10 ml pożywki AC.
    4. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C, delikatnie mieszając (około 80 obr./min).
    5. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 253 x g przez 12 minut. Usunąć supernatant i zawiesić komórki w 10 ml buforu AC. Powtórz to pranie jeszcze dwa razy.
    6. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml buforu AC zawierającego 50 μg/ml amikacyny w celu wyeliminowania bakterii zewnątrzkomórkowych i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 30 °C z delikatnym mieszaniem (80 obr./min). Ponownie umyj komórki dwukrotnie.
  2. Ekstrakcja całkowitego RNA z wewnątrzkomórkowego M. abscessus
    UWAGA: Kroki 2.2.1–2.2.3 należy wykonać pod wyciągiem ze względu na użycie toksycznych odczynników.
    1. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić zakażone ameby w 4 ml zimnego roztworu III (Tabela 3) z doraźnym doprowadzeniem 280 μl β-merkaptoetanolu w celu rozbicia ameby. Jest to etap tiocyjanianu guanidyny (GTC). Utrzymać zawiesinę na lodzie przez 10 minut. Odwirować lizat komórkowy przez 30 minut w temperaturze 2,396 x g i temperaturze 4 °C w celu osadzenia uwolnionych bakterii wewnątrzkomórkowych.
    2. Usunąć sklarowany osad i zawiesić osad bakteryjny w 1 ml zimnego roztworu III. Zebrać bakterie w temperaturze 2396 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad w 1 ml buforu ekstrakcyjnego i przenieść do probówki śrubowej o pojemności 2 ml zawierającej kulki cyrkonu (do uzyskania 500 μl objętości probówki). Probówki należy przechowywać przez co najmniej 24 godziny w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Przechowywanie w odczynniku do lizy pozwala na inaktywację RNaz i rozpuszczenie komórek.
    3. Gdy próbki są gotowe do użycia, rozmrażać je na lodzie i poddawać je lizie za pomocą homogenizatora, wykonując dwie rundy z prędkością 6 000 obr./min przez 25 s, a następnie jedną rundę z prędkością 6 000 obr./min przez 20 s z 1-minutową inkubacją na lodzie między każdą rundą.
    4. Aby schłodzić próbkę, inkubować je na lodzie przez 10 minut. Następnie dodać 200 μl chloroformu rozcieńczonego w alkoholu izoamylowym. Po wirowaniu próbek przez 1 minutę, odwirować przez 15 minut w temperaturze 16 500 x g i temperaturze 4 °C.
    5. Dodać 0,8 ml zimnego izopropanolu do fazy wodnej i inkubować próbki przez 2–3 godziny w temperaturze 20 °C. Odwirować próbki przez 35 minut w temperaturze 16 500 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    6. Umyj osad RNA, dodając 500 μl zimnego 70% etanolu (nie mieszać).
    7. Odwirować próbki o masie 16 500 x g przez 10 minut w celu usunięcia etanolu. Odessać roztwór i wysuszyć w koncentratorze odśrodkowym.
    8. Po wysuszeniu ponownie zawiesić granulki w 100 μl wody wolnej od DNazy/RNazy.
      UWAGA: Próbki należy dwukrotnie poddać działaniu DNaz w celu usunięcia zanieczyszczeń DNA zgodnie z zaleceniami producenta.
    9. Oceń integralność RNA na żelu agarozowym i potwierdź, mierząc liczbę integralności RNA (RIN) i stosunek rybosomalny za pomocą metody elektroforezy kapilarnej opartej na chipie.
      UWAGA: RIN uwzględnia cały ślad elektroforetyczny. Algorytm oprogramowania RIN pozwala na klasyfikację całkowitego RNA w oparciu o system numeracji od 1 do 10, gdzie 1 oznacza najbardziej zdegradowany profil, a 10 najbardziej nienaruszony. Aby przystąpić do przygotowania biblioteki cDNA, RIN musi wynosić ponad 8, a stosunek rybosomalny [28S/18S] musi być jak najwyższy, przy czym idealna wartość to 2, w zależności od organizmu i jego specyfiki.
    10. Próbki RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przygotowania biblioteki cDNA do sekwencjonowania.
  3. Przygotowanie biblioteki cDNA
    1. Aby przystąpić do przygotowania biblioteki, należy skorzystać z dostępnego na rynku zestawu do syntezy cDNA (Tabela Materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
    2. Sprawdź w bibliotece stężenie i jakość na chipie DNA.
      UWAGA: Bardziej precyzyjną i dokładną ocenę ilościową można przeprowadzić za pomocą czułych testów ilościowych opartych na fluorescencji.
  4. Sekwencjonowanie biblioteki
    1. Znormalizować próbki do 2 nM i przystąpić do multipleksowania zgodnie z organizacją komórki przepływowej.
    2. Denaturacja próbek przy stężeniu 1 nM przy użyciu 0,1 N NaOH przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Rozcieńczyć próbki o temperaturze 10 pM. Załadować każdą próbkę do kuwety przepływowej o godzinie 10 wieczorem.
    4. Kontynuuj sekwencjonowanie za pomocą wysokowydajnego systemu sekwencjonowania, który umożliwia genomikę na dużą skalę. W tym przypadku przebieg był serią SRM (SR: Single Read, PE: Paired-end Reads, M: multiplexed samples) składającą się z 51 cykli z odczytanymi 7 podstawami indeksów.
    5. Oceń jakość sekwencjonowania za pomocą zewnętrznego programu FastQC13.
    6. Po przycięciu sekwencji adaptera przystąp do dopasowania odczytu względem genomu referencyjnego. Dopasuj do genomu komórki eukariotycznej, aby ocenić zanieczyszczenie próbki i, jeśli to konieczne, przystąp do przycinania odczytów niebakteryjnych.
  5. analiza statystyczna
    1. Skorzystaj z kilku programów dostępnych online, aby zdefiniować zestawy genów o zróżnicowanej ekspresji: oprogramowanie R, pakiety Bioconductor, w tym DESeq2 i pakiet PF2tools (wersja 1.2.12) opracowany na platformie "Transcriptome et Epigénome" (Instytut Pasteura, Paryż).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M. abscessus ma zdolność opierania się i ucieczki przed bakteriobójczymi reakcjami makrofagów i pierwotniaków środowiskowych, takich jak ameby. M. abscessus wykazuje ekspresję czynników wirulencji, gdy rośnie w kontakcie z amebami, co czyni go bardziej zjadliwym u myszy4. Pierwszym celem tych metod była identyfikacja genów obecnych w M. abscessus, umożliwiających jego przetrwanie i namnażanie się w obrębie ameb.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowanie M. abscessus jest znacznie bardziej podobne do zachowania patogennego SGM, takiego jak M. tuberculosis, niż jakichkolwiek innych prątków należących do RGM2. Kluczowym elementem patogeniczności SGM jest ich zdolność do przetrwania, a nawet namnażania się w komórkach prezentujących antygen, takich jak makrofagi i komórki dendrytyczne.

M. abscessus uzyskał pewne zalety genomowe, o czym świadczy całkowita sekwencja jego genomu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bardzo dziękujemy Pr. E.J. Rubinowi (Harvard Medical School, Boston, USA) za cenny dar biblioteki mutantów oraz Dr. Benowi Marshallowi (Wydział Lekarski, University of Southampton, Wielka Brytania) za poprawki manuskryptu. Serdecznie dziękujemy Francuskiemu Stowarzyszeniu Pacjentów z Mukowiscydozą "Vaincre la Mucoviscidose" i "L'Association Gregory Lemarchal" za ich wsparcie finansowe (RF20150501377). Dziękujemy również Narodowej Agencji Badawczej (program ANR DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) oraz Région Ile-de-France (Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) za ufundowanie stypendium podoktorskiego dla V.L-M. L. L. jest doktorantem w "Ministère de L'Enseignement Supérieur et de la Recherche".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nazwa materiału
24-dołkowe płytkiThermofisher11874235
96-dołkowe Thermofisher10687551
Beadbeater Bioanalizator BertinPrecellys 24
Agilent
Genepulser XcellBiorad
Spektrofotometr Nanodrop 2000Fluorometr Thermofisher
QuBit
Koraliki cyrkonowe/kulki krzemionkoweProdukty Biospec11079101ZKoraliki
Nazwa odczynnika/komórek
Acanthamoeba  Castellanii  ATCC30010
szczep Amikacyna Mylan150927-Aw proszku
B-merkaptoetanol Roztwór Sigma-AldrichM6250
CaCl2Sigma-AldrichC1016>93% granulowany bezwodny
chloroform Fluka25666roztwór
ClaI enzymNew England BiolabsR0197S
agar Columbia Biomerieux4304190 mm
D-GlucoseSigma-AldrichG8270 proszek
DMEM Thermofisher11500596pożywkę
wolną od DNaz i RNaz Invitrogen10977-035solution
E.  COLI Elektrokompetentny Bakterie Thermofisher18265017
EDTASigma-AldrichE4884proszek
Escherichia coli  Kliniczny izolatosobistychbakterii
zapasowych Fe(NH4)2(SO4)-6H20 EMS15505-40roztwór siarczanu 4% wodny
Płodowa surowica cielęcaGibco10270surowica
GlicerolSigma-AldrichG5516roztwór
Tiocyjanian guanidu EuromedexEU0046-Dw proszku
Izopropanol Roztwór Sigma-AldrichI9516
Makrofagi J774.2Sigma-AldrichJ774.2Szczep
kanamycyny Sigma-Aldrich60615proszek
KH2PO4Sigma-AldrichP0662Monobasic, bezwodny
płynny LB średni Invitrogen12795-027proszek
LizozymRoche10837059001proszek
MgSO4LabosiM275pur
Microbank TM (krioprobówki z kulkami)Pro-Lab DiagnosticPL.170/M
Middlebrook 7H11 mediumSigma-AldrichM0428proszek
Middlebrook 7H9 mediumThermofisher11753473w proszku
Mü ller-Hinton agarBiorad3563901proszek
N-laurylo-sarkozynaMerckS37700 416proszek
Na2HPO4-7H2OSigma-AldrichS939098-102%
Fenol/chloroform Roztwór Sigma-Aldrich77617
Proteinaza KThermofisherEO0491proszek
pepton proteozyBD211684enzymatyczne trawienie tkanek zwierzęcych
plazmid pUC19 NewEngland Biolabs54357plazmid
SDS  20%Roztwór 1610418 Biorad
Cytrynian soduCalbiochem567446proszek
TiomocznikSigma-Aldrich88810proszek
TrisSigma-Aldrich154563proszek
Trizol Thermofisher12044977rozwiązanie
Tween 80Sigma-AldrichP1754 rozwiązanie
Ekstrakt drożdżowy Zestaw BD212750
Kit
AMBION DNaza Zestaw Thermofisher
10792877 Chip DNA Agilent Zestaw Agilent5067-1504
Zestaw GeneJET Plasmid Miniprep Zestaw ThermofisherK0503
Zestaw do oczyszczania PureLink PCRZestawdo K310001Invitrogen
Zestaw do testów Quant-It"Zestaw ThermofisherQ33140/Q32884
Ligaza DNA T4 Zestaw InvitrogenY90001
Zestaw przygotowawczy TruSeq Stranded RNA LTZestawdo 15032611Illumina

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185(2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2 (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83 (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660(2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170 (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055(2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42 (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36 (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60 (1), 296-301 (1992).
  13. FastQC program. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  14. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4 (6), 5660(2009).
  15. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  16. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 413-433 (2004).
  17. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9 (1), 87834(2014).
  18. Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10 (10), 2728-2745 (2008).
  19. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7 (1), (2012).
  20. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11 (3), 271-276 (2008).
  21. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
  22. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12 (7), 0181121(2017).
  23. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8 (1), 3939(2018).
  24. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529(2017).
  25. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48 (20), (2014).
  26. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65 (9), (1997).
  27. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198 (9), 1361-1368 (2003).
  28. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14 (11), 677-691 (2016).
  29. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9 (5), 533-539 (2003).
  30. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12420-12425 (2003).
  31. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76 (12), 5478-5487 (2008).
  32. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198 (5), 693-704 (2003).
  33. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76 (2), 717-725 (2008).
  34. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17 (1), 553(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Amebyprzesiewowa analiza biblioteki mutant wekstrakcja RNAanaliza transkryptomicznaczynniki wirulencjiycie wewn trzkom rkoweinterakcje gospodarz patogen

Powiązane artykuły