Tutaj prezentujemy dwa protokoły do badania interakcji Phagocyte-Mycobacterium abscessus: badanie przesiewowe biblioteki mutantów transpozonów pod kątem bakteryjnego niedoboru wewnątrzkomórkowego oraz określenie bakteryjnego transkryptomu wewnątrzkomórkowego na podstawie sekwencjonowania RNA. Oba podejścia zapewniają wgląd w zalety genomu i adaptacje transkryptomiczne, poprawiając sprawność bakterii wewnątrzkomórkowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja markerów wirulencji Mycobacterium abscessus do replikacji wewnątrzkomórkowej w fagocytach
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Tym, co odróżnia Mycobacterium abscessus od innych saprofitycznych prątków, jest zdolność do opierania się fagocytozie przez ludzkie makrofagi i zdolność do namnażania się wewnątrz takich komórek. Te cechy wirulencji sprawiają, że M. abscessus jest patogenny, szczególnie u wrażliwych gospodarzy z podstawową strukturalną chorobą płuc, taką jak mukowiscydoza, rozstrzenie oskrzeli lub gruźlica. Nie jest jasne, w jaki sposób pacjenci zarażają się M. abscessus. W przeciwieństwie do wielu prątków, M. abscessus nie występuje w środowisku, ale może znajdować się w amebach, fagocytach środowiskowych, które stanowią potencjalny rezerwuar M. abscessus. Rzeczywiście, M. abscessus jest oporny na fagocytozę amebową, a życie wewnątrz ameby wydaje się zwiększać zjadliwość M. abscessus w eksperymentalnym modelu infekcji. Jednak niewiele wiadomo na temat zjadliwości M. abscessus jako takiej. Aby rozszyfrować geny nadające przewagę wewnątrzkomórkowemu życiu M. abscessus, opracowano badania przesiewowe biblioteki mutantów transpozonów M. abscessus. Równolegle opracowano metodę ekstrakcji RNA z wewnątrzkomórkowych prątków po wspólnej hodowli z amebami. Metoda ta została zwalidowana i pozwoliła na sekwencjonowanie całych transkryptomów M. abscessus wewnątrz komórek; zapewniając po raz pierwszy globalne spojrzenie na adaptację M. abscessus do życia wewnątrzkomórkowego. Oba podejścia dają nam wgląd w czynniki wirulencji M. abscessus, które umożliwiają M. abscessus kolonizację dróg oddechowych u ludzi.
Wprowadzenie
Rodzaj Mycobacterium obejmuje różne gatunki, od nieszkodliwych organizmów saprofitycznych po główne ludzkie patogeny. Dobrze znane gatunki chorobotwórcze, takie jak Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium marinum i Mycobacterium ulcerans, należą do podgrupy prątków wolno rosnących (SGM). Natomiast podgrupa szybko rosnących prątków (RGM) charakteryzuje się zdolnością do tworzenia widocznych kolonii w czasie krótszym niż 7 dni na podłożu agarowym. Grupa RGM obejmuje ponad 180 gatunków, głównie niepatogennych prątków saprofitycznych. Badania nad interakcjami RGM z ich gospodarzami koncentrowały się głównie na Mycobacterium smegmatis ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Selekcja w bibliotece
- Budowa biblioteki mutantów Tn
- Pobierz bibliotekę transpozonów.
UWAGA: Na potrzeby tego eksperymentu biblioteka mutantów transpozonów została uzyskana od E.J. Rubina, Harvard School of Public Health, Boston, USA. Biblioteka została zbudowana z gładkiego szczepu klinicznego (43S) kompleksu M. abscessus (M. abscessus subsp. massiliense) z fagiem wprowadzonym do M. abscessus, umożliwiającym losowe wstawienie pojedynczego Tn do dinukleotydu TA (91 240 sekwencji TA w genomie M. abscessus). Aby uzyskać więcej informacji, zobacz odniesienie ....
- Pobierz bibliotekę transpozonów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
M. abscessus posiada zdolność do opierania się i ucieczki przed odpowiedziami bakteriobójczymi makrofagów oraz pierwotniaków środowiskowych, takich jak ameby. M. abscessus wykazuje ekspresję czynników wirulencji podczas wzrostu w kontakcie z amebami, co zwiększa jego wirulencję u myszy4. Pierwszym celem opisanych metod było zidentyfikowanie genów obecnych w M. abscessus, które umożliwiają jego przeżycie i namnażanie się wewnątrz ameb.
.......Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zachowanie M. abscessus jest znacznie bardziej podobne do zachowania patogennego SGM, takiego jak M. tuberculosis, niż jakichkolwiek innych prątków należących do RGM2. Kluczowym elementem patogeniczności SGM jest ich zdolność do przetrwania, a nawet namnażania się w komórkach prezentujących antygen, takich jak makrofagi i komórki dendrytyczne.
M. abscessus uzyskał pewne zalety genomowe, o czym świadczy całkowita sekwencja jego genomu
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Bardzo dziękujemy Pr. E.J. Rubinowi (Harvard Medical School, Boston, USA) za cenny dar biblioteki mutantów oraz Dr. Benowi Marshallowi (Wydział Lekarski, University of Southampton, Wielka Brytania) za poprawki manuskryptu. Serdecznie dziękujemy Francuskiemu Stowarzyszeniu Pacjentów z Mukowiscydozą "Vaincre la Mucoviscidose" i "L'Association Gregory Lemarchal" za ich wsparcie finansowe (RF20150501377). Dziękujemy również Narodowej Agencji Badawczej (program ANR DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) oraz Région Ile-de-France (Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) za ufundowanie stypendium podoktorskiego dla V.L-M. L. L. jest doktorantem w "Ministère de ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Nazwa materiału | |||
| 24-dołkowe płytki | Thermofisher | 11874235 | |
| 96-dołkowe Thermofisher | 10687551 | ||
| Beadbeater | Bioanalizator Bertin | Precellys 24 | |
| Agilent | |||
| Genepulser Xcell | Biorad | ||
| Spektrofotometr Nanodrop 2000 | Fluorometr Thermofisher | ||
| QuBit | |||
| Koraliki cyrkonowe/kulki krzemionkowe | Produkty Biospec | 11079101Z | Koraliki |
| Nazwa odczynnika/komórek | |||
| Acanthamoeba Castellanii | ATCC | 30010 | |
| szczep Amikacyna | Mylan | 150927-A | w proszku |
| B-merkaptoetanol | Roztwór Sigma-Aldrich | M6250 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | >93% granulowany bezwodny |
| chloroform | Fluka | 25666 | roztwór |
| ClaI enzym | New England Biolabs | R0197S | |
| agar Columbia | Biomerieux | 43041 | 90 mm |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | proszek |
| DMEM | Thermofisher | 11500596 | pożywkę |
| wolną od DNaz i RNaz | Invitrogen | 10977-035 | solution |
| E. COLI Elektrokompetentny | Bakterie Thermofisher | 18265017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | proszek |
| Escherichia coli | Kliniczny izolat | osobistych | bakterii |
| zapasowych Fe(NH4)2(SO4)-6H20 | EMS | 15505-40 | roztwór siarczanu 4% wodny |
| Płodowa surowica cielęca | Gibco | 10270 | surowica |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | roztwór |
| Tiocyjanian guanidu | Euromedex | EU0046-D | w proszku |
| Izopropanol | Roztwór Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Makrofagi J774.2 | Sigma-Aldrich | J774.2 | Szczep |
| kanamycyny | Sigma-Aldrich | 60615 | proszek |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | Monobasic, bezwodny |
| płynny LB średni | Invitrogen | 12795-027 | proszek |
| Lizozym | Roche | 10837059001 | proszek |
| MgSO4 | Labosi | M275 | pur |
| Microbank TM (krioprobówki z kulkami) | Pro-Lab Diagnostic | PL.170/M | |
| Middlebrook 7H11 medium | Sigma-Aldrich | M0428 | proszek |
| Middlebrook 7H9 medium | Thermofisher | 11753473 | w proszku |
| Mü ller-Hinton agar | Biorad | 3563901 | proszek |
| N-laurylo-sarkozyna | Merck | S37700 416 | proszek |
| Na2HPO4-7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | 98-102% |
| Fenol/chloroform | Roztwór Sigma-Aldrich | 77617 | |
| Proteinaza K | Thermofisher | EO0491 | proszek |
| pepton proteozy | BD | 211684 | enzymatyczne trawienie tkanek zwierzęcych |
| plazmid pUC19 New | England Biolabs | 54357 | plazmid |
| SDS 20% | Roztwór 1610418 Biorad | ||
| Cytrynian sodu | Calbiochem | 567446 | proszek |
| Tiomocznik | Sigma-Aldrich | 88810 | proszek |
| Tris | Sigma-Aldrich | 154563 | proszek |
| Trizol | Thermofisher | 12044977 | rozwiązanie |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | rozwiązanie |
| Ekstrakt drożdżowy | Zestaw BD | 212750 | |
| Kit | |||
| AMBION DNaza | Zestaw Thermofisher | ||
| 10792877 Chip DNA Agilent Zestaw Agilent | 5067-1504 | ||
| Zestaw GeneJET Plasmid Miniprep | Zestaw Thermofisher | K0503 | |
| Zestaw do oczyszczania PureLink PCR | Zestaw | do K310001 | Invitrogen |
| Zestaw do testów Quant-It" | Zestaw Thermofisher | Q33140/Q32884 | |
| Ligaza DNA T4 | Zestaw Invitrogen | Y90001 | |
| Zestaw przygotowawczy TruSeq Stranded RNA LT | Zestaw | do 15032611 | Illumina |
Bibliografia
- Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15 (3), 380-385 (2016).
- Roux, A. -L., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
