Protokoły są opisane do oceny toksyczności chemii dla niedojrzałych i dorosłych komarów do rozwoju jako nowe klasy larwobójców, adultycydów i endektocydów. Protokoły umożliwiają wysokoprzepustowe testowanie wielu substancji chemicznych przy dawce jednopunktowej, a następnie ocenę za pomocą testu dawka-odpowiedź w celu określenia toksyczności w kontakcie lub po spożyciu.
Artykuł metodologiczny
Protokoły badania toksyczności nowych środków owadobójczych dla komarów
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nowe klasy insektycydów o nowych sposobach działania są potrzebne do zwalczania odpornych na insektycydy populacji komarów, które przenoszą choroby takie jak Zika, denga i malaria. Przedstawiono testy do szybkich, wysokoprzepustowych analiz nieopracowanych nowych substancji chemicznych przeciwko larwom komarów i dorosłym osobnikom. Opisujemy protokoły testów pojedynczej dawki punktowej i odpowiedzi na dawkę w celu oceny toksyczności drobnocząsteczkowych substancji chemicznych dla wektora Aedes aegypti wirusa Zika, dengi i żółtej febry, wektora malarii Anopheles gambiae i północnego komara domowego, Culex quinquefasciatus, w kontakcie i po spożyciu. Na przykład oceniliśmy toksyczność amitryptyliny, małocząsteczkowego antagonisty receptorów sprzężonych z białkiem G, za pomocą testu larwalnego, miejscowego dla dorosłych i dorosłego żywienia krwią. Protokoły stanowią punkt wyjścia do zbadania potencjału owadobójczego. Wyniki są omawiane w kontekście dodatkowych eksperymentów mających na celu zbadanie zastosowań produktów i mechanizmów dostarczania.
Wprowadzenie
Komary przenoszą czynniki wywołujące choroby zakaźne, które wpływają na zdrowie ludzi na całym świecie1. Trzy najważniejsze rodzaje komarów wpływające na zdrowie człowieka to Aedes, Anopheles i Culex. Gatunki komarów Aedes przenoszą arbowirusy wywołujące wirusy Zika, dengę, żółtą febrę i chikungunya. Gatunki Anopheles, wektory, malaria, pasożyty i gatunki Culex, przenoszą wirusa Zachodniego Nilu i nicienie filarialne2. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) wezwała do wyeliminowania dziesięciu zaniedbanych chorób tropikalnych (NTD) do 2020 roku3 i określiła zwalczanie komarów jako najbardziej realną strategię. Insektycydy są potężnymi narzędziami do zwalczania komarów i ograniczania przenoszenia chorób4,5. Jednak pojawienie się populacji komarów odpornych na insektycydy zagraża ciągłej kontroli wielu chorób6,7,8. Konsorcjum Innovative Vector Control Consortium (IVCC) rozpoczęło pierwszą dedykowaną akcję mającą na celu opracowanie zastępczych środków owadobójczych do zwalczania komarów9. Potrzebne są nowe insektycydy o nowych sposobach działania (MoA), aby osiągnąć cele WHO i osiągnąć kontrolę choroby. Odkrycie i opracowanie nowych klas insektycydów z nowymi MoA wymaga testów całego organizmu w celu szybkiej, wysokoprzepustowej analizy chemicznej i porównania ze standardami branżowymi10.
Dostępnych jest wiele testów do oceny odstraszania i toksyczności insektycydów dla larw i dorosłych komarów, a niektóre są odpowiednie do oceny nowych formuł lub nieformułowanych substancji chemicznych. Protokół WHO 11 to test kontaktowy używany do testowania produktów przeciwko larwom czwartego stadium rozwojowego. Opublikowane badania opisują również różne testy larwalne stosowane do badania toksyczności chemii małych cząsteczek dla larw Aedes aegypti, Anopheles gambiae i Culex quinquefasciatus10,12,13,14,15,16. Test biologiczny butelkowy Centers for Disease Control and Prevention (CDC) służy do oceny odporności na insektycydy w populacjach dorosłych komarów złapanych w terenie poprzez ocenę stężenia śmiertelnego (LC) i czasu śmiertelności (LT) w porównaniu ze standardową dawką diagnostyczną komercyjnego środka owadobójczego17. Test wrażliwości WHO oferuje inne podejście do oceny odporności na insektycydy u dorosłych komarów, w którym komary są wystawiane na działanie papieru nasączonego insektycydami wewnątrz szklanych fiolek przez 1 godzinę, a śmiertelność ocenia się na 24 godziny 18. Inne testy rozpylają preparaty wewnątrz szczelnych klatek i rejestrują powalenie i śmierć komarów w żądanych punktach czasowych19. Miejscowe stosowanie na klatkę piersiową komara zostało wykorzystane do oceny siły działania różnych pestycydów20. Liverpool Insect Testing Establishment (LITE)21 stosuje standardowe procedury operacyjne do oceny bioaktywności substancji chemicznych u dorosłych komarów. Test miejscowy LITE dla dorosłych nakłada niewielką objętość badanego produktu na klatkę piersiową dorosłych komarów ze śmiertelnością ocenianą po 48 godzinach. Test umożliwia ilościowe określenie dawki otrzymanej dla każdego pojedynczego mosquito21. Test LITE stępu ocenia toksyczność badanego produktu dla dorosłych komarów spoczywających na powierzchni poddanej działaniu substancji chemicznej i jest stosowany do identyfikacji substancji chemicznych o potencjale rozwoju jako opryski resztkowe w pomieszczeniach (IRS) lub stosowanie w moskitierach nasączonych środkami owadobójczymi (ITN) w celu zwalczania komarów Anopheles.
Testy WHO i CDC mają ograniczenia w testowaniu nowych, nieformułowanych substancji chemicznych, a celem testu biologicznego butelki CDC jest ocena wrażliwości w krótkich okresach testowych (dwie godziny), a nie toksyczności22,23. Ponadto brakuje testów do oceny toksyczności substancji chemicznych dostarczanych w mączce z krwi oraz potencjału do opracowywania produktów o działaniu ogólnoustrojowym (tj. endektocydów). W tym miejscu opisujemy testy do testowania działania cykobójczego nowych substancji chemicznych, które są rozpuszczalne w wodzie lub jednym z kilku rozpuszczalników organicznych przeciwko larwom i dorosłym osobnikom Aedes, Anopheles i Culex. Po pierwsze, demonstrujemy test larwalny opisany wcześniej przez naszą grupę10,12,13,16, i przeprowadzony tutaj jako (1) badanie przesiewowe do szybkiej oceny wielu substancji chemicznych przy pojedynczej dawce punktowej oraz (2) test odpowiedzi na dawkę w celu określenia stężenia śmiertelnego (np. LC50, LC75 lub LC90,) pojedynczej substancji chemicznej. Następnie opisujemy dwa testy dla dorosłych do oznaczania dawki śmiertelnej (LD). Pierwszym z nich jest adaptacja protokołu LITE do testowania miejscowo stosowanych, nowatorskich substancji chemicznych przeciwko dorosłym komarom w porównaniu z kontrolą pozytywną. Drugi to test żywieniowy do oceny substancji chemicznych dostarczanych ogólnoustrojowo za pośrednictwem mączki z krwi.
Protokół
UWAGA: Wszystkie szczepy i odczynniki wymagane do pracy opisanej w poniższych protokołach oraz dostawcy są wymienieni w Tabeli Materiałów.
1. Kultura larw komarów i dorosłych komarów
UWAGA: Szczepy komarów podatne na insektycydy są dostępne w Repozytorium Badań nad Malarią i Odczynnikami. Zalecane szczepy to: szczep Aedes aegypti Liverpool (LVP), szczep Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) i szczep Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB).
- Hodowla larw komarów z jaj w cyklu 12 godzin dzień/12 godzin nocy w temperaturze 28 °C i wilgotności względnej 75-85% (RH) w plastikowych tacach o wymiarach 25 cm x 40 cm (~ 400 larw na tacę), zgodnie z opisem Nuss29. Nakarm larwy mielonym myszoskoczkiem (A. aegypti i An. gambiae) lub płatkowym pokarmem dla ryb (C. quinquefasciatus). W przypadku testów larwalnych należy pobrać larwy w trzecim stadium larwalnym (L3).
- Hodować dorosłe komary z poczwarek, które zostały przeniesione do plastikowych kubków i umieszczać w plastikowych klatkach o pojemności 20 litrów w owadach w warunkach opisanych powyżej. Utrzymuj komary na 20% roztworze cukru, jak opisano w innym miejscu29. Dorosłe osobniki zbierać po 3-5 dniach od wschodu.
2. Test kontaktowy z larwami (test dawki pojedynczej lub test dawka reagująca)
UWAGA: Test może być przeprowadzony przy użyciu substancji chemicznych rozpuszczalnych w wodzie lub dimetylosulfotlenku (DMSO), pod warunkiem, że końcowe stężenie DMSO w studniach testowych nie przekracza 1%. Alternatywne rozpuszczalniki mogą być opcją, ale ważne jest, aby najpierw potwierdzić, że końcowe stężenie nie powoduje więcej niż 10% śmiertelności po 72 godzinach od ekspozycji. Test może być przeprowadzony jako test dawki pojedynczej lub test dawka-odpowiedź. W przypadku wykonywania tego ostatniego zaleca się przetestowanie zakresu stężeń (co najmniej pięciu), obejmującego oczekiwany LC50.
- Oznacz dołki przezroczystej 24-dołkowej płytki tkankowej, jak pokazano na Rysunek 1.
- Przygotować roztwór podstawowy testowej chemii w probówce o pojemności 1,5 ml.
- Zważyć każdą substancję chemiczną za pomocą wagi analitycznej i w zależności od charakterystyki rozpuszczalności, ponownie zawiesić w sterylnym ddH2O, DMSO lub innym odpowiednim rozpuszczalniku organicznym do wyboru (patrz Rysunek 2).
UWAGA: W obliczeniach należy wziąć pod uwagę czystość chemii. Na przykład, aby uzyskać chemię o czystości 99%, rozpuść 10,1 mg w 1,000 μl acetonu, aby uzyskać 1% roztwór. Uszczelnić folią parafinową i przechowywać w temperaturze -20 °C.
- Zważyć każdą substancję chemiczną za pomocą wagi analitycznej i w zależności od charakterystyki rozpuszczalności, ponownie zawiesić w sterylnym ddH2O, DMSO lub innym odpowiednim rozpuszczalniku organicznym do wyboru (patrz Rysunek 2).
- Określić końcowe stężenie badanej substancji chemicznej, która będzie oceniana, i odpowiednio przygotować seryjne rozcieńczenia z roztworu podstawowego, używając odpowiedniego rozpuszczalnika.
UWAGA: Stężenie i objętość chemii i rozpuszczalnika można obliczyć za pomocą wzoru C1 * V1 = C2 * V2 gdzie C1 = stężenie próbki 1, C2 = stężenie próbki 2, V1 = objętość próbki 1 i V2 = objętość próbki 2. Zobacz przykładowe obliczenia pokazane w Rysunek 2 i Tabela 1.- Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM i seryjne rozcieńczenia zgodnie z wymaganiami w celu uzyskania pożądanych stężeń testowych (Tabela 1B).
- Za pomocą plastikowej pipety transferowej o szerokim otworze przenieś pięć larw L3 do studzienki płytki do badania kultur tkankowych; Larwy L3 można rozpoznać po długości (~ 2,5 - 3,5 mm) i szerokości torebki głowy ~ 0,025 mm24. Delikatnie usuń wodę pipetą o pojemności 1 ml i zastąp żądaną objętością ddH2O (patrz poniżej). Powtórzyć czynność, aby uzyskać n = 4 kontrpróby techniczne na zabieg (tj. łącznie 20 larw na zabieg).
- Dodaj odpowiednią objętość testowej chemii do każdej z czterech kontrprób w 24-dołkowej płytce testowej i delikatnie obracaj płytką, aby zapewnić równomierne wymieszanie chemii. Umieść płytkę w komorze testowej lub wzrostowej w stałych warunkach (np. Zaleca się 25 °C i ~ 75-85% wilgotności względnej, a jeśli to możliwe, cykl 12 godzin światła/12 godzin ciemności).
UWAGA: Aby zapewnić powtarzalność między eksperymentami, upewnij się, że kolejne testy są wykonywane w tych samych warunkach środowiskowych. - Zapisać liczbę martwych/niereagujących larw w każdym dołku po 30 minutach, 1, 1,5, 2, 3, 24, 48 i 72 godzinach po ekspozycji (lub w alternatywnych punktach czasowych) na arkuszu punktowym (tabela 2). Delikatnie postukaj w bok talerza. Jeśli nie zaobserwujesz żadnego ruchu, delikatnie dotknij larwy sterylną wykałaczką. Larwy, które nie reagują na stukanie/dotyk, należy uznać za "martwe".
UWAGA: Można zaobserwować i rejestrować inne fenotypy morfologiczne i behawioralne. - W razie potrzeby skorygować śmiertelność kontrolną przy użyciu zmodyfikowanego wzoru Abbotta, w następujący sposób:
Śmiertelność (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
gdzie X = procent śmiertelności w próbce poddanej działaniu substancji, a Y = procent śmiertelności w próbie kontrolnej. - Wykres wyników w postaci histogramu lub krzywej logarytmicznej za pomocą wybranego oprogramowania, takiego jak Graph-pad Prism 6 lub podobne, i oblicz wartości stężenia śmiertelnego (LC) w stosunku do kontroli.
- Powtórzyć test, używając oddzielnej partii komarów, aby uzyskać n = 3 lub więcej kontrprób biologicznych.
3. Test miejscowy dla dorosłych (test dawki pojedynczej lub dawki oddzielnej)
UWAGA: Test miejscowy dla dorosłych jest przeprowadzany przy użyciu acetonu jako rozpuszczalnika. Alternatywne rozpuszczalniki mogą być opcją, ale ważne jest, aby najpierw potwierdzić, że końcowe stężenie nie powoduje więcej niż 10% śmiertelności po 48 godzinach od ekspozycji. Test może być przeprowadzony jako test dawki pojedynczej lub test dawka-odpowiedź i jest stosowany do określenia dawki śmiertelnej (LD). W przypadku wykonywania tej ostatniej czynności zaleca się przetestowanie zakresu stężeń (minimum pięciu), obejmującego oczekiwany LD50.
- Określ liczbę dorosłych samic komarów wymaganych do przeprowadzenia testu.
UWAGA: Test dawki punktowej z pojedynczą substancją chemiczną będzie wymagał co najmniej 90 komarów (30 dla kontroli dodatniej, 30 dla kontroli negatywnej zawierającej tylko aceton i 30 dla badanej chemii). - Posadź 3 do 5-dniowe dorosłe samice komarów i przenieś je do oddzielnego plastikowego wiadra o pojemności 20 ml za pomocą aspiratora (Ryc. 3).
- Oznacz papierowe kubki o pojemności 9 uncji nazwą i stężeniem testowej chemii. Odłóż na bok kwadraty o wymiarach 10 cm x 10 cm i gumki na każdą filiżankę (patrz Rysunek 4).
- Wybrać istniejący środek owadobójczy jako kontrolę pozytywną (np. syntetyczny pyretroid, bifentryna) i przygotować 1% roztwór podstawowy (10 μg/μL) w acetonie.
UWAGA: W obliczeniach należy wziąć pod uwagę czystość chemii. Na przykład, aby uzyskać chemię o czystości 99%, rozpuść 10,1 mg w 1,000 μl acetonu, aby uzyskać 1% roztwór. Uszczelnić folią parafinową i przechowywać w temperaturze -20 °C. - Stosując tę samą procedurę, co powyżej, przygotować roztwór podstawowy testowego roztworu chemicznego.
UWAGA: Wiele testowych substancji chemicznych jest bardzo labilnych, a roztwory powinny być przygotowywane świeże za każdym razem, gdy wykonywany jest test biologiczny. - Przygotować seryjne rozcieńczenia kontroli pozytywnej i testować chemię z roztworów podstawowych, jak pokazano na Rysunek 5, używając szklanych fiolek o pojemności 20 ml uprzednio przepłukanych acetonem.
- Oczyść szklaną strzykawkę o pojemności 1 ml acetonem, napełnij acetonem i zabezpiecz w mikroaplikatorze dostosowanym do objętości 0,25 μl.
- Pracując partiami po dziesięć, wyjmij 3-5-dniowe dorosłe samice komarów z klatek za pomocą aspiratora i znieczulaj przez maksymalnie pięć minut w temperaturze 4 °C w lodówce lub na lodzie. Następnie przenieś komary na szalkę Petriego i ułóż na lodzie na maksymalnie 10 minut.
- Działając szybko, usuń pojedynczą samicę za pomocą cienkiej pęsety i nałóż 0,25 μl roztworu testowego na grzbietową klatkę piersiową za pomocą mikroaplikatora strzykawkowego. Potwierdź dostarczenie chemii poprzez obserwację za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby upewnić się, że każdy komar otrzyma odpowiednią objętość testowej chemii.
- Przenieś komara do oznaczonego papierowego kubka spoczywającego na lodzie i powtórz dziewięć razy, aby uzyskać n = 10 leczonych komarów. Zamknij komary w kubku kwadratem siatki zabezpieczonym gumką i przenieś do plastikowej wanny lub komory wzrostowej w stałych warunkach 28 °C i 75-85% wilgotności względnej (preferowany jest cykl 12 godzin w dzień / 12 godzin w nocy).
- Powtórzyć powyższy eksperyment dwukrotnie, aby uzyskać n = 3 kontrpróby techniczne (tj. łącznie 30 komarów) na grupę badaną lub kontrolną.
- Powtórzyć kroki 3.7 - 3.10 najpierw z badaniem chemicznym, a następnie z kontrolą pozytywną.
UWAGA: Inną przydatną kontrolą, którą należy uwzględnić, jeśli dostępna jest wystarczająca ilość komarów, jest "ślepa próba" 30 znieczulonych komarów, które nie otrzymują ani chemii testowej, ani rozpuszczalnika. - Należy odnotować liczbę "martwych/niereagujących" komarów po 30 minutach, 60 minutach, 2, 24 i 48 godzinach od ekspozycji (lub w alternatywnych punktach czasowych) przy użyciu arkusza punktacji (tabela 3). Oceniaj komary jako "martwe/niereagujące", jeśli wykazują brak ruchu, zdefiniowany jako leżenie na boku lub na plecach i niezdolność do latania.
- W razie potrzeby skorygować śmiertelność kontrolną, stosując zmodyfikowany wzór Abbotta w następujący sposób:
Śmiertelność (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
gdzie X = procent śmiertelności w próbce poddanej działaniu substancji, a Y = procent śmiertelności w próbie kontrolnej. - Wyświetlanie wyników w postaci histogramu lub krzywej wykładniczej. W przypadku testu dawka-odpowiedź należy obliczyć wartość LD50, LD75 lub LD90 dla badanego składu chemicznego w stosunku do kontroli.
- Powtórzyć test co najmniej dwa razy, używając oddzielnych partii komarów w celu uzyskania n = 3 lub więcej kontrprób biologicznych.
4. Test żywienia krwią u dorosłych (test dawki pojedynczej lub dawki reagującej)
- Zbierz około 150 4-5-dniowych dorosłych samic komarów i przenieś je do osobnej klatki. Powtórz tę czynność, aby uzyskać 6 klatek, jeśli wykonujesz test dawka-odpowiedź. Usuń źródło cukru 1-24 godziny przed testem karmienia.
- Przygotować podstawowy roztwór chemiczny, jak opisano powyżej, biorąc pod uwagę czystość chemii (typowy roztwór podstawowy to 80 mM w wodzie lub buforze soli), a następnie przygotować seryjne rozcieńczenia w wodzie/buforze zgodnie z wymaganiami.
- Dodać 40 μl każdego z rozcieńczeń do 960 μl zdefibrynowanej krwi królika w celu uzyskania pożądanego stężenia testowego. Nałóż folię membranową na jednostkę podającą i uszczelnij gumowym pierścieniem. Przenieś 1 ml krwi za pomocą pipety i podłącz urządzenie do karmienia do urządzenia grzewczego.
- Delikatnie przetrzyj powierzchnię membrany świeżo przygotowanym 10% roztworem kwasu mlekowego i umieść karmnik w klatce dorosłych komarów. Przykryj klatkę ciemną szmatką lub czarnym workiem na śmieci i pozwól komarom żerować przez godzinę.
- Powtórzyć kroki 4.2-4.4 dla pozostałej części roztworów badanych i kontroli ujemnej (tylko we krwi).
- Po zakończeniu karmienia umieść wiadra w temperaturze 4 °C w lodówce na 5 minut, aby znieczulić komary. Usunąć samce komarów i niekarmione samice komarów oraz policzyć i zapisać całkowitą liczbę karmionych i częściowo karmionych komarów poprzez badanie jamy brzusznej.
- Zatrzymaj częściowo i w pełni odżywione samice komarów, dążąc do uzyskania co najmniej 50 komarów karmionych krwią na dawkę.
- Przenieś wiadra do plastikowej wanny lub komory wzrostowej w stałych warunkach 28 °C i 75 - 85% wilgotności względnej (preferowany jest cykl 12 godzin w dzień / 12 godzin w nocy).
- Zapisać całkowitą liczbę martwych/niereagujących komarów po 0,5, 1, 1,5, 2, 24, 48 i 72 godzinach (lub alternatywnych punktach czasowych w zależności od potrzeb) przy użyciu arkusza wyników (tabela 4).
- Trzeciego dnia po karmieniu krwią wprowadź kubek na jajka do klatki i zbieraj jaja przez 72 godziny. Policz całkowitą liczbę jaj wyprodukowanych podczas jednego zabiegu pod mikroskopem preparacyjnym.
- Obliczyć procentową śmiertelność i płodność w funkcji całkowitej liczby karmionych komarów dla każdej grupy badanej i grupy kontrolnej. W razie potrzeby skorygować śmiertelność kontrolną przy użyciu zmodyfikowanego wzoru Abbotta.
- Wyświetlanie danych dotyczących toksyczności i płodności w postaci wykresu histogramu lub krzywej wykładniczej (w przypadku wykonywania testu dawka-odpowiedź) za pomocą wybranego oprogramowania. W przypadku wykonywania testu dawka-odpowiedź należy obliczyć wartość LD50, LD75 lub LD90 dla badanego składu chemicznego w stosunku do kontroli.
- Powtórzyć test co najmniej dwa razy, używając oddzielnych partii komarów w celu uzyskania n = 3 lub więcej kontrprób biologicznych.
Wyniki
Rycina 6 przedstawia procent śmiertelności L3 Ae. aegypti po ekspozycji na pięć dawek amitryptyliny, antagonisty receptorów dopaminergicznych, w porównaniu z kontrolą negatywną (sama woda) po 24, 48 i 72 h. W tym przykładzie dane zebrane w każdym z punktów czasowych wykazują typową krzywą logarytmiczną i ujawniają zależny od dawki wpływ amitryptyliny na śmiertelność larw. Wartość LC50 maleje w czasie trwania eksperymentu i może zostać obliczona na podstawie danych z 72 h (t.j. punktu środkowego krzywej logarytmicznej).
Rysunek 7 przedstawia procentową śmiertelność 3–5-dniowych dorosłych samic Ae. aegypti po ekspozycji na dawkę 400 µM (10 µg/µL) amitryptyliny, antagonisty receptorów dopaminy, w porównaniu do dodatniej kontroli z syntetycznym pyretroidem, bifentryną (stopień techniczny; 500 pg/µL), ujemnej kontroli z samym acetonem oraz niepoddanych działaniu preparatów komarów (blank). W tym przykładzie zarówno amitryptylina, jak i bifentryna powodują znaczną śmiertelność dorosłych osobników w stosunku do kontroli ujemnej. Należy zauważyć, że śmiertelność dorosłych osobników spada w czasie, co prawdopodobnie wynika z metabolicznej detoksykacji testowanych substancji chemicznych.
Rysunek 8 przedstawia procentową śmiertelność (lewa oś y) dorosłych samic Ae. aegypti w wieku 3-5 dni, które otrzymały posiłek krwi z jedną z czterech dawek amitryptyliny (antagonisty receptorów dopaminergicznych), oraz płodność (prawa oś y; średnia liczba jaj na samicę) w pierwszym cyklu gonotroficznym po ekspozycji w porównaniu z komarami kontrolnymi (karmienie samą krwią; kontrola negatywna). Dane wykazują, że amitryptylina nie ma istotnego wpływu na śmiertelność osobników dorosłych w stosunku do grupy kontrolnej, ale wykazują, że amitryptylina znacząco zwiększa płodność przy najwyższej dawce (400 µM).
Rycina 1. Układ testu odpowiedzi larw na dawkę. Obraz przedstawiający układ testu odpowiedzi larw na dawkę, przeprowadzonego z wykorzystaniem larw L3 Aedes aegypti na płytce 24-dołkowej.
Rysunek 2. Schemat przedstawiający procedurę przygotowania (A) pojedynczej dawki lub (B) testu dawka-odpowiedź na larwach w płytce 24-dołkowej. Po przeniesieniu pięciu larw L3 do dołków, nadmiar wody jest delikatnie usuwany za pomocą pipety i zastępowany świeżą, sterylną ddH2O. Następnie przygotowuje się roztwór zapasowy oraz rozcieńczenia seryjne badanej substancji chemicznej, które są dodawane do końcowej objętości 1 mL/dołek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3. Hodowla dorosłych komarów. Obraz przedstawiający plastikowe wiadro o pojemności 20 L użyte do hodowli dorosłych komarów oraz zastosowanie aspiratora do usuwania komarów.
Rycina 4Analiza miejscowa u osobników dorosłych, przeprowadzona z użyciem samic w wieku 4–5 dni. Aedes aegypti. Po poddaniu działaniu substancji chemicznej lub rozpuszczalnika, dorosłe komary umieszcza się w papierowych kubeczkach i przenosi do komory testowej na czas trwania analizy.
Rysunek 5. Rozcieńczenia zapasowe i szeregowe. Schemat przedstawiający procedurę przygotowania (A) roztworu zapasowego i (B) szeregu roztworów testowych do badania miejscowego u dorosłych osobników. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 6. Reprezentatywne dane z testu odpowiedzi na dawkę kontaktową dla larw. Reprezentatywne dane z testu odpowiedzi na dawkę kontaktową dla larw, przedstawiające procent śmiertelności larw L3 Aedes aegypti po ekspozycji na amitryptylinę, antagonista receptorów dopaminergicznych, w czasie 24, 48 i 72 h. Każdy punkt danych reprezentuje średnią w µM ± SEM. Dane reprezentują n = 3 powtórzenia biologiczne.
Rysunek 7. Reprezentatywne dane z testu odpowiedzi na dawkę naniesioną miejscowo u osobników dorosłych. Reprezentatywne dane z testu odpowiedzi na dawkę naniesioną miejscowo u osobników dorosłych, wykazujące toksyczność antagonisty receptorów dopaminy, amitryptyliny (10 µg/µL), wobec 3-5 dniowych samic Aedes aegypti w porównaniu do kontroli pozytywnej z syntetycznym pyretrydem, bifentryną (500 pg/µL), oraz kontroli negatywnej (sam rozpuszczalnik acetonowy) w czasie 2, 24 i 48 h. Dane reprezentują n = 3 powtórzeń biologicznych. Słupki błędów oznaczają SEM.
Rycina 8Reprezentatywne dane z testu spożycia przez dorosłe osobniki. Reprezentatywne dane z testu podania doustnego u osobników dorosłych, wykazujące toksyczność amitryptyliny, antagonisty receptorów dopaminergicznych, przy 100 µM, 200 µM i 400 µM dawka dla dorosłych samic w wieku 3–5 dni Aedes aegypti oraz wpływ na płodność (wyrażoną jako średnia całkowita liczba jaj na samicę w pierwszym cyklu gonotroficznym). Dane reprezentują n = 3 powtórzeń biologicznych ± SEM.
| A. Analizy dawki w pojedynczym punkcie z wykorzystaniem trzech metod chemicznych | |||||
| Chemia | Stężenie (400 uM) | ||||
| Amitryptylina | Roztwór zapasowy 80 mM: 2 mg amitryptyliny X 98% (czystość proszku) X 0,001 g/1 mg X 1 mol /313,86 g X 1 L/0,08 mol X 106 µL/L = 78.06 µL wody. | ||||
| Rozcieńczenia seryjne: Rozcieńczyć roztwór stokowy w stosunku 1:2 wodą ddH2O2O, a następnie 1:4, aby uzyskać stężenie 10 mM. Dodać 40 µL roztworu stokowego 10 mM do studzienki zawierającej 960 µL z ddH2O2aby uzyskać końcowe stężenie wynoszące 400 µM/wellPrzygotować rozcieńczenia seryjne roztworu stokowego o stężeniu 10 mM w stosunku 1:2, aby uzyskać roztwory stokowe o stężeniach 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mM i 0,625 mM. | |||||
| Cis-(Z)-flupentixol | Roztwór zapasowy 80 mM: 2 mg cis(z)flupentixolu X 98% (czystość proszku) X 0,001 g/1 mg X 1 mol/507,44 g cis(z)flupentixolu X 1 L/0,08 mol X 106 µL/L = 48.28 µL wody. | ||||
| Rozcieńczenia seryjne: Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. | |||||
| Amitraz | Roztwór zapasowy 80 mM: 2 mg amitrazu X 0,001 g/1 mg X 1 mol/293,4 g amitrazu X 1 L/0,08 mol X 106 µL/1 L = 85.21 µL DMSO (uwaga: Amitraz jest rozpuszczalny tylko w DMSO). | ||||
| Rozcieńczenia seryjne: Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. | |||||
| B. Analiza zależności dawka-odpowiedź | |||||
| Chemia | Dawka 1 | Dawka 2 | Dawka 3 | Dawka 4 | Dawka 5 |
| 400 µM | 200 µM | 100 µM | 50 µM | 25 µM | |
| np. amitryptylina, cis-(Z)-flupentyksol lub amitraz | 40 µL | 40 µL | 40 µL | 40 µL | 40 µL |
| stężenie zapasowe 10 mM | stok 5 mM | roztwór stokowy 2,5 mM | roztwór zapasowy 1,25 mM | Roztwór stokowy 0,625 mM | |
Tabela 1. Przykładowe obliczenia dla Aedes aegypti w (A) pojedynczym punkcie dawkowania dla larw L3 oraz (B) w badaniu zależności dawka-odpowiedź.
Tabela 2. Przykładowy arkusz wyników używany do rejestrowania danych z testu zależności dawka-odpowiedź na larwach komarów. Kontrola: sama woda lub woda z 1% DMSO lub innym samym rozpuszczalnikiem. Typowe dawki stosowane do testowania chemii antagonistów małocząsteczkowych, takich jak amitryptylina, to 25 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM i 400 µM.
| Analiza miejscowa u dorosłych komarów (w wieku 3–5 dni) | ||||||
| Data rozpoczęcia: | ||||||
| Badacz: | ||||||
| Gatunek/szczep: | ||||||
| Rodzaj analizy: Pojedyncza dawka/odpowiedź na dawkę | ||||||
| A. Śmiertelność (liczba martwych komarów) | ||||||
| Czas (godziny) | Dawka 1 | Dawka 2 | Dawka 3 | Dawka 4 | Dawka 5 | Kontrola |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
| B. Procent śmiertelności | ||||||
| Czas (godziny) | Dawka 1 | Dawka 2 | Dawka 3 | Dawka 4 | Dawka 5 | Kontrola |
| 0.5 | ||||||
| 1 | ||||||
| 1.5 | ||||||
| 2 | ||||||
| 2.5 | ||||||
Tabela 3. Przykładowy arkusz wyników używany do rejestrowania danych z testu odpowiedzi na dawkę miejscową u osobników dorosłych.
| Analiza spożycia u dorosłych komarów (w wieku 3–5 dni) | ||||||
| Data rozpoczęcia: | ||||||
| Badacz: | ||||||
| Gatunek/Szczep: | ||||||
| Rodzaj analizy: Pojedyncza dawka/odpowiedź na dawkę | ||||||
| A. Liczba nakarmionych komarów | ||||||
| Dawka 1 | Dawka 2 | Dawka 3 | Dawka 4 | Dawka 5 | Kontrola | |
| Karmione | ||||||
| Niekarmione | ||||||
| Suma | ||||||
| % karmione | ||||||
| % Nie karmione | ||||||
| B. Śmiertelność (liczba martwych komarów) | ||||||
| Czas (godziny) | Dawka 1 | Dawka 2 | Dawka 3 | Dawka 4 | Dawka 5 | Kontrola |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
| C. Procent śmiertelności | ||||||
| Czas (godziny) | Dawka 1 | Dawka 2 | Dawka 3 | Dawka 4 | Dawka 5 | Kontrola |
| 2 | ||||||
| 24 | ||||||
| 48 | ||||||
| 72 | ||||||
Tabela 4. Przykładowy arkusz wyników używany do rejestracji danych z testu żerowania na krwi dorosłych osobników. Typowe dawki stosowane do testowania małych cząsteczek antagonistów, takich jak amitryptylina, to 50 µM, 100 µM, 200 µM i 400 µM.
Dyskusja
Insektycydy są potężnymi narzędziami do zwalczania chorób przenoszonych przez komary, takich jak malaria25, denga i Zika26. Intensywne stosowanie insektycydów wytworzyło populacje komarów, które są odporne na zwalczanie chemiczne, co prowadzi do rozwoju odporności na insektycydy, która jest uważana za największe zagrożenie dla dalszej kontroli choroby. W ostatniej dekadzie nastąpił dramatyczny wzrost populacji Anopheles spp. odpornych na syntetyczne pyretroidy (SP) stosowane w moskitierach w Afryce7. Populacje Aedes albopictus, wektora dengi i wirusa Zika, zostały zgłoszone na Florydzie i New Jersey, które są odporne na organofosforany6. Podobnie oporność na DDT i pyretroidy została udokumentowana w populacjach Anopheles i Aedes spp. w Kolumbii27,28. Istnieje pilna potrzeba opracowania nowych larwocydów i dorosłychcydów, które wiążą się z różnymi miejscami ortosterycznymi lub allosterycznymi na znanych celach molekularnych lub które zakłócają nowe cele (tj. nowe substancje chemiczne MoA)29,30 i mają minimalny wpływ na środowisko. Coraz częściej dostrzega się również potencjał endektocydów w zwalczaniu komarów 31,32,33.
Aby ułatwić szybki rozwój takich produktów, opisujemy szereg protokołów opracowanych do oceny toksyczności drobnocząsteczkowych substancji chemicznych dla larw komarów i dorosłych komarów za pośrednictwem dwóch dróg dostarczania - kontaktu i spożycia. Protokoły, takie jak test wrażliwości WHO i test butelkowy CDC, są powszechnie stosowane do oceny toksyczności i odstraszania istniejących preparatów owadobójczych 1,2. Testy te mają jednak ograniczenia w zakresie analiz niesformułowanych nowych jednostek chemicznych (NCE) i nie nadają się do testowania dużej liczby substancji chemicznych w umiarkowanej lub wysokiej przepustowości.
W tym miejscu opisujemy standardowy test larwalny do szybkiej oceny NCE w dawce jednopunktowej, który można skalować do analiz o wysokiej przepustowości. Opisujemy również adaptację testu opracowanego przez LITE21 do oceny toksyczności kontaktowej drobnocząsteczkowych substancji chemicznych dla dorosłych komarów. Na koniec opisujemy test spożycia w celu oceny toksyczności NCE dostarczanych z mączką z krwi dorosłym samicom komarów i badamy potencjał endektocydu. Te testy larwalne i dorosłe mogą być wykonywane w różnych dawkach w celu określenia odpowiednio wartości LC i LD, a zarówno testy kontaktowe larw, jak i dorosłych mogą być przeprowadzane w porównaniu z jednym lub kilkoma istniejącymi preparatami chemicznymi. Test miejscowy dla dorosłych umożliwia również obliczenie wartości LD dla każdego pojedynczego komara. Protokoły mogą być wykonywane przy użyciu gatunków Aedes, Anopheles i Culex16,29 i mogą być modyfikowane w celu uwzględnienia specyficznych cech biologicznych gatunku, jeśli jest to pożądane. Z naszego doświadczenia wynika, że chemia komabolidowa zazwyczaj wykazuje szeroką aktywność w tych trzech rodzajach16,29, ale ocena selektywności gatunków ma wartość.
Testy są punktem wyjścia do szybkiego badania przesiewowego wielu substancji chemicznych pod kątem aktywności owadobójczej. Te substancje chemiczne, które wykazują toksyczność w jednym lub kilku testach, mogą być wybrane do dalszych analiz za pomocą testów drugorzędowych i trzeciorzędowych. Przykłady obejmują test LITE stępu i test karmienia cukrem34,35. Wybór dodatkowych testów jest zwykle determinowany względami dotyczącymi przewidywanego rynku i zastosowania, a wyniki dostarczają informacji na temat możliwych sposobów dostarczania produktu. W przedstawionych tutaj reprezentatywnych wynikach badamy toksyczność amitryptyliny, antagonisty receptorów dopaminy ssaków i bezkręgowców, która została oceniona pod kątem potencjału jako nowego insektycydu MoA 10,12,13,16. Amitryptylina wykazywała toksyczność dla larw i osobników dorosłych Ae. aegytpi w zakresie μg, co sugeruje aktywność larwobójczą i osobniczą oraz dostarcza uzasadnienia dla badania szeregu chemicznego opartego na amitryptylinie w celu zidentyfikowania analogów o dużej sile działania. Nie zaobserwowano istotnego wpływu na śmiertelność lub płodność u Ae. aegypti narażonych na amitryptylinę w mączce z krwi. Chociaż stabilność chemii w zdefibrynowanej krwi i skuteczna dawka otrzymywana na komara nie są znane, znaczące ograniczenia testu, dane sugerują, że amitryptylina i inne związki aktywne GPCR mogą mieć niewielki potencjał jako endektocydy, przynajmniej w stanie niesformułowanym.
Niezbędne są środki ostrożności mające na celu ograniczenie zmienności biologicznej między testami. Wszystkie testy powinny być wykonywane w standardowych warunkach temperatury i wilgotności, najlepiej w komorze do hodowli owadów, w celu zapewnienia odtwarzalności. Konieczne jest ujednolicenie procedur oceny fenotypowych punktów końcowych, ponieważ mogą one być wysoce subiektywne, co prowadzi do znacznych różnic w danych rejestrowanych przez różny personel laboratoryjny. Test larwalny najlepiej nadaje się do oceny substancji chemicznych, które są rozpuszczalne w wodzie, chociaż test można przeprowadzić przy użyciu rozpuszczalników organicznych, takich jak DMSO, pod warunkiem, że końcowe stężenie jest mniejsze niż 1% na studzienkę. Zdajemy sobie sprawę z kilku ograniczeń testu miejscowego dla dorosłych. Po pierwsze, konieczna jest szybka praca podczas przygotowywania seryjnych rozcieńczeń i dostarczania dawek, ponieważ nośnik (aceton) jest wysoce lotny, a parowanie może powodować różnice w ilości dostarczanej chemii. Po drugie, należy zadbać o ograniczenie okresu znieczulenia, ponieważ może to przyczynić się do śmiertelności. Należy również zauważyć, że rozpuszczalniki, takie jak aceton, mogą wywoływać szybki efekt "powalający" w ciągu pierwszych kilku godzin testu miejscowego, którego nie należy mylić z efektami wynikającymi z chemii testowej. Zwracamy uwagę, że objętość mączki z krwi komara różni się u poszczególnych osób, co komplikuje ocenę dawki otrzymanej na osobę dorosłą w teście spożycia przez osobę dorosłą. Wreszcie, dane z badań nie powinny być brane pod uwagę w przypadkach, gdy śmiertelność w kontroli ujemnej przekracza 10 %.
Produkty, które działają synergistycznie, są coraz częściej rozpoznawane ze względu na ich potencjał do rozszerzania użyteczności istniejących produktów i zapewniania kontroli populacji szkodników odpornych na insektycydy 15,16,36. Testy larwalne wykorzystano do zbadania synergii między pestycydem formamidyny, amitrazem, a różnymi substancjami chemicznymi, które zaburzają receptory oktopaminy bezkręgowców14,15. Opisany test na larwach i test miejscowy dla dorosłych osobników są odpowiednie do oceny efektów synergicznych lub addytywnych między kombinacjami badanych substancji chemicznych. Zwracamy uwagę, że synergetyki, takie jak butotlenek piperonylu (PBO), można włączyć do każdego z trzech opisanych tutaj testów.
Wyżej opisane testy stanowią znormalizowaną serię eksperymentalną do oceny niesformułowanych, małocząsteczkowych leków przeciwko wodnym i lądowym etapom życia komarów. Testy te są specjalnie zaprojektowane do oceny toksyczności i oferują kilka zalet w porównaniu z istniejącymi testami w powszechnym użyciu. Co ważne, testy są podatne na automatyzację i mogą być wykonywane na skalę przemysłową, aby umożliwić ocenę tysięcy badanych związków. Wreszcie, w związku z tym, że w tej dziedzinie rozważa się rozwój produktów działających za pośrednictwem nowych MoA, w tym poprzez zakłócanie nowych celów molekularnych i szlaków biochemicznych, konieczne będzie uzyskanie wielu fenotypowych punktów końcowych oprócz takich jak śmiertelność i paraliż. Powyższe testy pozwalają na takie badania, stanowiąc tym samym krok w kierunku wysoce innowacyjnych technologii owadobójczych jutra.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy dziękują H. Ransonowi, Liverpool School of Tropical Medicine za pomoc w opracowaniu testu i dostarczeniu protokołu LITE, oraz M. Scharfowi, Purdue University za porady dotyczące projektowania testów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Szczepy komarów wrażliwe na insektycydy | Repozytorium referencyjne badań nad malarią i odczynników | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Zalecane szczepy: szczep Aedes aegypti Liverpool (LVP), szczep Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) i szczep Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) | |
| CAS 33089-61-1 | Wymaga rozcieńczenia w DMSO | ||
| Amitryptylina | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Może być rozcieńczany w acetonie |
| Bifentryna | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Syntetyczny pyretoryl stosowany jako kontrola pozytywna |
| Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Testowany farmakologicznie jako zaburzający receptory dop-podobne |
| Defibrynowana krew królika | Hemostat | DRB0100 | Źródło krwi dla komarów przystosowanych do sztucznego karmienia |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Rozpuszczalnik organiczny stosowany do rozpuszczania amitrazu |
| Membranowy system podawania Hemotek | Hemotek Ltd | Nr seryjny 1303 | Używany do karmienia komarów |
| Mikroaplikator | Burkard Manufacturing Co. | - | Narzędzie potrzebne do eksperymentów z zastosowaniem miejscowym: |
| 24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej z pokrywką | Corning Incorporated | 3526-Advantage | |
| gumki | Alliance Rubber Co. | - | Służy do uszczelniania kubków papierowych |
| Szklana strzykawka (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Potrzebne do mikroaplikacji. Szkło jest lepsze niż plastik |
| Jednorazowe fiolki scyntylacyjne (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Szklane fiolki zapobiegają parowaniu |
| Tkanina tiulowa, biała | Walmart | - | - |
| Kubki papierowe | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Służy do utrzymywania dorosłych komarów w testach miejscowych dla dorosłych Szalki |
| Petriego (150 mm) | Corning Life | Sciences-Służy | do utrzymywania komarów "śpiących" na zimno bez bezpośredniego kontaktu z lodem |
| Pipety transferowe | Fisher Scientific | 13-711-7M | Służy do sortowania larw |
| Mikroskop stereoskopowy | Olympus | SZ6045 | Służy do oceny testów larwalnych i wykonywania mikroaplikacje |
| Pęseta (cienka) | Fontax | - | Służy do radzenia sobie z dorosłymi komarami |
Bibliografia
- World Health Organization. A global brief on vector-borne diseases. , Available from: www.who.int/about/Licensing/copyright_form/en (2014).
- World Health Organization. Vector-borne diseases. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs387/en (2016).
- World Health Organization. Report by the Secretariat. Neglected tropical diseases; Prevention, control, elimination and eradication. , Available from: http://www.who.int/neglected_diseases/A66_20_Eng.pdf (2013).
- Tolle, M. A., et al. Mosquito-borne diseases. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).
- Chen, C. D., et al. Dengue vectors surveillance in endemic areas in kuala lumpur city centre and selangor state, malaysia. Dengue Bulletin. 30, (2006).
- Marcombe, S., et al. Insecticide resistance status of united states populations of Aedes albopictus and mechanisms involved. PLoS ONE. 9 (7), e101992(2014).
- Ranson, H., et al. Pyrethroid resistance in African anopheline mosquitoes: what are the implications for malaria control? Trends in Parasitology. , 1-8 (2010).
- Hemingway, J., Ranson, H. Insecticide resistance in insect vectors of human disease. Annual Review of Entomology. 45, 371-391 (2000).
- Hemingway, J., Beaty, B. J., Rowland, M., Scott, T. W., Sharp, B. L. The Innovative Vector Control Consortium: improved control of mosquito-borne diseases. Trends in Parasitology. 22 (7), 308-312 (2006).
- Meyer, J. M., et al. A "genome-to-lead" approach for insecticide discovery: Pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D 1-like dopamine receptors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6 (1), e1478(2012).
- World Health Organization. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. , Available from: http://apps.who.int/iris/handle/10665/69615 (1981).
- Hill, C. A., et al. Re-invigorating the insecticide discovery pipeline for vector control: GPCRs as targets for the identification of next gen insecticides. Pestide Biochemistry and Physiology. 106 (3), 141-148 (2013).
- Conley, J. M., et al. Evaluation of AaDOP2 Receptor antagonists reveals antidepressants and antipsychotics as novel lead molecules for control of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeautics. 352 (1), 53-60 (2015).
- Ahmed, M. A. I., Matsumura, F. Synergistic actions of formamidine insecticides on the activity of pyrethroids and neonicotinoids against Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 49 (6), 1405-1410 (2012).
- Ahmed, M. A. I., Vogel, C. F. A. Synergistic action of octopamine receptor agonists on the activity of selected novel insecticides for control of dengue vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) mosquito. Pesticide Biochemistry and Physiology. 120, 51-56 (2015).
- Hill, C. A., et al. Comparative pharmacological characterization of D1-like dopamine receptors from Anopheles gambiae, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus suggests pleiotropic signaling in mosquito vector lineages. Parasites Vectors. 9 (1), 192(2016).
- Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for evaluating insecticide resistance in vectors using the CDC bottle bioassay. , Available from: https://www.cdc.gov/malaria/resources/pdf/fsp/ir_manual/ir_cdc_bioassay_en.pdf (2011).
- World Health Organization. Test procedures for insecticide resistance monitoring in malaria vector mosquitoes. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/250677/1/9789241511575-eng.pdf (2013).
- Geneva: World Health Organization. Guidelines for efficacy testing of insecticides for indoor and outdoor ground-applied space spray applications control of neglected tropical diseases who pesticide evaluation scheme. , Available from: http://www.who.int/iris/handle/10665/70070 2-53 (2009).
- Pridgeon, J. W., et al. Susceptibility of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Say, and Anopheles quadrimaculatus Say to 19 pesticides with different modes of action. Journal of Medical Entomolog. 45 (1), 82-87 (2008).
- Liverpool Insect Testing Establishment. , Available from: http://www.lite-testing-facility.com (2018).
- Aïzoun, N., et al. Comparison of the standard WHO susceptibility tests and the CDC bottle bioassay for the determination of insecticide susceptibility in malaria vectors and their correlation with biochemical and molecular biology assays in Benin, West Africa. Parasites Vectors. 6, 147(2013).
- Owusu, H. F., Jančáryová, D., Malone, D., Müller, P. Comparability between insecticide resistance bioassays for mosquito vectors: time to review current methodology? Parasites Vectors. 8, 357(2015).
- Savignac, R., Maire, A. A simple character for recognizing second and third instar larvae of five Canadian mosquito genera (Diptera: Culicidae). , (1981).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. eLife. 4, 174(2015).
- Zaim, M., et al. Alternative insecticides: an urgent need. Trends in Parasitology. 18 (4), 161-163 (2002).
- Fonseca, I., Quinoñes, M. L. Resistencia a insecticidas en mosquitos (Diptera: Culicidae): mecanismos, deteccion y vigilancia en salud publica. Revista Colombiana de Entomologia. 31 (2), 107-115 (2005).
- Fonseca-Gon Alez, I., Qu, M. L., Lenhart, A., Brogdon, W. G. Insecticide resistance status of Aedes aegypti (L.) from Colombia. Pest Management Science. 67, 430-437 (2011).
- Nuss, A. B., et al. Dopamine receptor antagonists as new mode-of-action insecticide leads for control of Aedes and Culex mosquito vectors. PLOS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 1-19 (2015).
- Shidrawi, G. R. A WHO Global Programme for monitoring vector resistance to pesticides. Bulletin of the World Health Organization. 68 (4), 403(1990).
- Sylla, M., Kobylinski, K. C., Foy, B. D. Gates grand challenges explorations award: endectocides for controlling transmission of mosquito-borne diseases. Malariaworld Journal. 4 (5), (2013).
- Foy, B. D., Kobylinski, K. C., da Silva, I. M., Rasgon, J. L., Sylla, M. Endectocides for malaria control. Trends in Parasitology. 27 (10), 423-428 (2011).
- Chaccour, C. J., et al. Ivermectin to reduce malaria transmission: a research agenda for a promising new tool for elimination. Malaria Journal. 12 (1), 153(2013).
- Olson, D. M., Fadamiro, H., Lundgren, J. G., Heimpel, E. Effects of sugar feeding on carbohydrate and lipid metabolism in a parasitoid wasp. Physiol Entomol. 25, 17-26 (2000).
- World Health Organization. Report of the WHO Informal Consultation. Evaluation and testing of insecticides. , Available from: http://www.who.int/whopes/resources/ctd_whopes_ic_96.1/en/ (1996).
- Huang, Q., Deng, Y., Zhan, T., He, Y. Synergistic and antagonistic effects of piperonyl butoxide in fipronil-susceptible and resistant rice stem borrers, Chilo suppressalis. Journal of Insect Science. 10, 182(2010).
Przedruki i uprawnienia
