Kwantyfikacja mRNA i ekspresji białek powierzchniowych w pojedynczych komórkach w limfocytach T CD4 + zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności wyizolowanych od makaków rezusów

Summary

Opisana jest metodologia ilościowego oznaczania ekspresji 96 genów i 18 białek powierzchniowych przez pojedyncze komórki ex vivo, pozwalająca na identyfikację genów i białek o zróżnicowanej ekspresji w komórkach zakażonych wirusem w stosunku do komórek niezainfekowanych. Stosujemy podejście do badania limfocytów T CD4 ⁺ zakażonych SIV wyizolowanych od makaków rezusów.

Abstract

Analiza pojedynczych komórek jest ważnym narzędziem do analizowania heterogenicznych populacji komórek. Identyfikacja i izolacja rzadkich komórek może być trudna. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowano metodologię łączącą indeksowaną cytometrię przepływową i wysokoprzepustową ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR). Celem było zidentyfikowanie i scharakteryzowanie komórek zakażonych małpim wirusem niedoboru odporności (SIV) obecnych u makaków rezusów. Poprzez ilościowe oznaczanie białka powierzchniowego przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i mRNA za pomocą qPCR, komórki zakażone wirusem są identyfikowane przez ekspresję genów wirusa, która jest łączona z pomiarami genów gospodarza i białek w celu stworzenia wielowymiarowego profilu. Podejście to nazywamy ukierunkowaną oceną proteo-transkrypcji pojedynczej komórki (ang. Single-Cell Proteo-Transcriptional Evaluation, tSCEPTRE). Aby wykonać tę metodę, żywe komórki barwi się przeciwciałami fluorescencyjnymi specyficznymi dla markerów powierzchniowych stosowanych do izolacji FACS podzbioru komórek i/lub dalszej analizy fenotypowej. Pojedyncze komórki są sortowane, a następnie następuje natychmiastowa liza, odwrotna transkrypcja multipleksowa (RT), wstępna amplifikacja PCR i qPCR o wysokiej przepustowości do 96 transkryptów. Pomiary FACS są rejestrowane w momencie sortowania, a następnie łączone z danymi dotyczącymi ekspresji genów według pozycji dołka w celu utworzenia połączonego profilu białkowego i transkrypcyjnego. Aby zbadać komórki zakażone SIV bezpośrednio ex vivo, komórki zidentyfikowano za pomocą wykrywania qPCR wielu gatunków wirusowego RNA. Kombinacja transkryptów wirusa i ilość każdego z nich zapewnia ramy do klasyfikowania komórek na różne etapy cyklu życia wirusa (np. produktywne i nieproduktywne). Ponadto tSCEPTRE komórek SIV⁺ porównano z niezakażonymi komórkami wyizolowanymi z tej samej próbki w celu oceny genów i białek gospodarza o zróżnicowanej ekspresji. Analiza ujawniła wcześniej niedocenianą niejednorodność ekspresji wirusowego RNA wśród zakażonych komórek, a także potranskrypcyjną regulację genów in vivo za pośrednictwem SIV z rozdzielczością pojedynczej komórki. Metoda tSCEPTRE jest istotna dla analizy dowolnej populacji komórek nadającej się do identyfikacji przez ekspresję markera (markerów) białka powierzchniowego, genu(-ów) gospodarza lub genu(-ów) patogenu, lub ich kombinacji.

Introduction

Wiele wewnątrzkomórkowych patogenów polega na maszynerii komórek gospodarza do replikacji, często zmieniając biologię komórki gospodarza lub celując w bardzo specyficzne subpopulacje komórek gospodarza, aby zmaksymalizować ich szanse na rozmnażanie. W rezultacie procesy biologiczne komórek są często zakłócane, co ma szkodliwe konsekwencje dla ogólnego stanu zdrowia gospodarza. Zrozumienie interakcji między wirusami a komórkami gospodarza, w których się replikują, wyjaśni mechanizmy chorobowe, które mogą pomóc w opracowaniu ulepszonych terapii i strategii zapobiegania infekcjom. W tym celu niezbędne są bezpośrednie narzędzia analityczne, które umożliwiają badanie interakcji gospodarz-patogen. Analiza pojedynczych komórek jest jedynym sposobem na jednoznaczne przypisanie fenotypu komórkowego do określonego genotypu lub statusu infekcji¹. Na przykład infekcje chorobotwórcze często wywołują zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie zmiany w komórkach gospodarza. Dlatego odróżnienie zakażonych komórek od ich niezakażonych odpowiedników jest konieczne, aby przypisać zmiany w komórkach gospodarza bezpośredniej infekcji lub skutkom wtórnym, takim jak uogólnione zapalenie. Co więcej, w przypadku wielu patogenów, takich jak SIV i ludzkie wirusy niedoboru odporności (HIV), zakażenie komórkami gospodarza przebiega przez wiele etapów, takich jak wczesny, późny lub utajony, z których każdy może charakteryzować się odrębnymi profilami ekspresji genów i białek^2,3,4,5. Masowe analizy mieszanin komórkowych nie zdołają uchwycić tej niejednorodności⁶. Z kolei wysoce multipleksowane analizy pojedynczych komórek, które są w stanie określić ilościowo ekspresję zarówno genów wirusa, jak i gospodarza, oferują sposób na rozwiązanie perturbacji komórkowych specyficznych dla infekcji, w tym różnic między etapami infekcji. Co więcej, analiza interakcji gospodarz-patogen w fizjologicznie istotnych warunkach ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji zdarzeń zachodzących w zakażonych organizmach. W związku z tym metody, które można zastosować bezpośrednio ex vivo, prawdopodobnie najlepiej uchwycą procesy in vivo.

SIV i HIV celują w limfocyty T CD4⁺, w których przeciwdziałają przeciwwirusowym czynnikom "restrykcyjnym" gospodarza i obniżają poziom cząsteczki prezentujące antygen, aby ustanowić produktywną infekcję i uniknąć nadzoru immunologicznego7^,8,9,10,11. Bez leczenia infekcja powoduje masową utratę limfocytów T CD4⁺, co ostatecznie prowadzi do zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS)¹². W przypadku terapii antyretrowirusowej utajone zakażone rezerwuary komórkowe utrzymują się przez dziesięciolecia, stanowiąc potężną barierę dla strategii leczniczych. Zrozumienie właściwości komórek zakażonych wirusem HIV/SIV in vivo może ujawnić cechy komórek gospodarza odgrywające zasadniczą rolę w patogenezie i trwałości. Było to jednak bardzo trudne, przede wszystkim ze względu na niską częstotliwość zakażeń komórek i brak odczynników umożliwiających ich łatwą identyfikację. Szacuje się, że komórki, które transkrybują wirusowe RNA, są obecne w 0,01–1% limfocytów T CD4 ⁺ we krwi i tkance limfatycznej ^13,14,15. W przypadku terapii supresyjnej utajone zakażone komórki występują jeszcze rzadziej w ^10-3–^{10-7 16,17,18}. Testy barwienia białek wirusowych, które dobrze sprawdzają się w badaniu infekcji in vitro, takich jak wewnątrzkomórkowy Gag, są nieoptymalne ze względu na barwienie tła na poziomie 0,01–0,1%, podobne lub większe niż częstość zakażonych komórek^13,14. Udowodniono również, że barwienie powierzchni białka Env przy użyciu dobrze scharakteryzowanych przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla SIV/HIV Env jest trudne, prawdopodobnie z podobnych powodów. Ostatnio nowatorskie narzędzia mają na celu poprawę wykrywania komórek wykazujących ekspresję Gag poprzez włączenie testów specyficznych dla RNA gag lub zastosowanie alternatywnych technologii obrazowania^14,15,19. Jednak takie podejścia pozostają ograniczone pod względem liczby pomiarów ilościowych wykonywanych na każdej komórce.

Tutaj opisujemy metodologię, która (1) identyfikuje pojedyncze komórki zakażone wirusem bezpośrednio ex vivo za pomocą ilościowego qPCR wrażliwego i specyficznego genu wirusa oraz (2) określa ilościowo ekspresję do 18 białek powierzchniowych i 96 genów dla każdej zainfekowanej (i niezainfekowanej) komórki. Metodologia ta łączy pomiar białek powierzchniowych pojedynczej komórki za pomocą FACS, a następnie natychmiastową lizę komórek i analizę ekspresji genów przy użyciu multipleksowanego ukierunkowanego qPCR w systemie Biomark. Technologia zintegrowanego obwodu fluidycznego (IFC) umożliwia multipleksowaną ocenę ilościową 96 genów z 96 próbek jednocześnie, realizowaną przez matrycę 9 216 komór, w których przeprowadzane są poszczególne reakcje qPCR. Sortowanie FACS żywych komórek rejestruje pomiary obfitości białek o wysokiej zawartości, zachowując jednocześnie cały transkryptom do analizy wykonywanej bezpośrednio po nim. Aby zidentyfikować komórki zakażone wirusem, do analizy qPCR dołącza się testy specyficzne dla alternatywnie splicingowanych i niesplicowanych wirusowych RNA (vRNA), wraz z panelem zdefiniowanych przez użytkownika testów o łącznej wartości do 96 genów, co stanowi maksymalną liczbę testów obecnie dostępnych w IFC. Ekspresja genów i informacje o białkach zebrane dla każdej komórki są połączone przez dobre położenie. Wcześniej informowaliśmy o wynikach tej analizy w innym miejscu²⁰. W tym miejscu przedstawiamy bardziej szczegółowe wytyczne metodologiczne, a także dalsze opisowe fenotypowanie limfocytów T CD4 ⁺ zakażonych SIV.

To podejście, które nazywamy tSCEPTRE, może być zastosowane do zawiesin dowolnej żywotnej populacji komórek reagujących na fluorescencyjnie znakowane przeciwciała i wykazujących ekspresję transkryptomu zgodnego z dostępnymi testami qPCR. Na przykład, może być stosowany do charakteryzowania zróżnicowanej ekspresji genów i białek w rzadkich komórkach lub komórkach, które nie są łatwo rozróżniane przez markery białka powierzchniowego. Przygotowanie próbki opiera się na standardowym protokole barwienia przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał. Cytometry z możliwością sortowania pojedynczych komórek są również dostępne na rynku, ale do przetwarzania zakaźnych żywych komórek wymagane są dodatkowe środki ostrożności w zakresie bezpieczeństwa biologicznego. Rejestrowanie profilu ekspresji białek jednokomórkowych dla każdej komórki według pozycji studzienki, określane tutaj jako sortowanie indeksowane, jest powszechną cechą dostępnego na rynku oprogramowania do sortowania FACS. Analiza obliczeniowa genów gospodarza o zróżnicowanej ekspresji wśród populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania nie jest tutaj opisana, ale podano odniesienia do wcześniej opublikowanych metod.

Protocol

UWAGA: Schemat przepływu pracy protokołu jest pokazany w Rysunek 1. Składa się z trzech głównych etapów: wstępnej amplifikacji FACS, RT i cDNA oraz qPCR dla maksymalnie 96 genów jednocześnie. Dwie wersje protokołu, sortowanie komórek w ograniczaniu rozcieńczeń i sortowanie pojedynczych komórek, są opisane bardziej szczegółowo odpowiednio w kroku 5 i kroku 6. Strategie te odnoszą się do różnych pytań badawczych, ale opierają się na podobnych procedurach.

1. Wstępne lub wcześniejsze analizy

1. Zweryfikuj wszystkie testy ekspresji genów, które mają być używane zgodnie z wcześniejszym opisem⁶.
   UWAGA: Ten krok jest wykonywany na długo przed datą eksperymentu. Walidacja wszystkich testów, komercyjnych i niestandardowych, jest wymagana, aby zapewnić wydajną i liniową amplifikację odpowiedniego RNA do poziomu pojedynczej komórki. Wiele dostępnych na rynku i niestandardowych testów nie spełnia tych specyfikacji. Przetwarzanie i automatyczne dopasowywanie krzywych do jednoczesnej kwalifikacji testów ekspresji do 96 genów jest dostępne w uzupełniających plikach kodowania 1–5, ale indywidualne testy można kwalifikować za pomocą R² i nachylenia dopasowania liniowego. Reprezentatywne wykresy kwalifikacyjne udanych i nieudanych testów są pokazane na Rysunek 2.
2. Opracowanie panelu cytometrii przepływowej zawierającego przeciwciała do barwienia markerów powierzchniowych komórek będących przedmiotem zainteresowania.
   1. Miareczkować przeciwciała poprzez barwienie odpowiedniej próbki, na przykład komórek jednojądrzastych krwi obwodowej rezusów (PBMC), każdym przeciwciałem. Zacznij od 20 μl przeciwciała na test w 100 μl reakcji barwienia i utwórz osiem podwójnych rozcieńczeń seryjnych. Zidentyfikuj optymalne stężenie, które wykazuje maksymalną intensywność barwienia, zachowując jednocześnie wyraźną separację między populacjami negatywnymi i pozytywnymi.
   2. Ocenić połączone barwienie na dodatkowej próbce (próbkach) komórek przy użyciu mieszaniny wszystkich przeciwciał o optymalnym stężeniu określonym w kroku 1.2.1. Upewnij się, że barwienie jest podobne do obserwowanego dla poszczególnych barwień przeciwciał. Jeśli barwienie jest mniejsze niż to, co obserwuje się, gdy zastosowano jakiekolwiek przeciwciało w izolacji, należy rozważyć alternatywne koniugaty fluorochromowe w celu zastąpienia takich przeciwciał.

2. Przygotowanie testu ekspresji genów

1. Połącz 96 testów ekspresji genów w probówce 1–15 ml wolnej od RNaz / DNaz (rozmiar może się różnić w zależności od liczby płytek sortujących). Panel testów zastosowanych w tym badaniu określono w Tabelach 1 i 2. Otrzymany materiał jest określany jako "mieszanka testowa". Dodać każdy test do końcowego stężenia 180 nM starterów do przodu i do tyłu. Dodać bufor zawiesiny DNA, aby uzyskać odpowiednie rozcieńczenie mieszanki testowej.
   UWAGA: Ze względów praktycznych, niestandardowe (generowane przez użytkownika) zestawy testowe mogą być przygotowane przy 18 μM, aby były zgodne ze stężeniem dostępnych na rynku testów qPCR z ekspresją genów "20x" (tabela materiałów). 18 μM mieszanin niestandardowego startera do przodu i do tyłu dla każdego genu jest wytwarzanych z roztworów podstawowych w buforze zawiesiny DNA. Dostępne na rynku testy (tabela materiałów) obejmują również sondy, ale sondy nie są wymagane do wstępnej amplifikacji RT lub cDNA, a zatem można je pominąć w testach niestandardowych. Zaleca się włączenie jednego lub więcej genów porządkowych do wykorzystania w kontroli jakości w celu oceny wydajności sortowania, odzyskiwania komórek i syntezy cDNA. Użycie losowych starterów do generowania cDNA nie zostało określone, ale oczekuje się, że będzie mniej wydajne niż startery specyficzne dla genu.
2. Przygotować 2x płytkę testową do użycia w kroku 7.1 (multiplex qPCR). Dla każdej przewidywanej matrycy chipów 96 x 96 należy pobrać pipetę po 6 μl każdego testu do każdego wyznaczonego dołka na 96-dołkowej płytce PCR. Na przykład w przypadku 5 chipów 30 μl każdego testu zajmie pojedynczą studzienkę na płytce 96-dołkowej. W przypadku stosowania 96 testów, każda studzienka na 96-dołkowej płytce będzie zawierała test. Uszczelnij płytkę za pomocą uszczelki samoprzylepnej.
   Uwaga: Idealnie byłoby, gdyby kroki 2.1 i 2.2 były wykonywane jednocześnie, aby uniknąć wielu cykli zamrażania i rozmrażania w testach ekspresji genów. Wszystkie geny znajdujące się na płytce testowej muszą być również obecne w mieszance testowej (etap 2.1). Zarówno mieszanina testowa, jak i płytka testowa mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub 4 °C odpowiednio do długotrwałego lub krótkoterminowego stosowania.

3. Powierzchnia plami żywe komórki

UWAGA: Barwienie wewnątrzkomórkowe, przepuszczalność i utrwalanie nie są zgodne z tą metodą, ponieważ zagrażają RNA.

1. Przygotować próbki kompensacyjne, dodając każde przeciwciało wymienione w tabeli materiałów do 40 μl kulek kompensacyjnych o stężeniu 2,5-krotnie wyższym niż stężenie używane do barwienia komórek. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 25 °C, chroniąc przed światłem. Dodać 3 ml PBS do kulek i odwirować przy 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 25 °C. Odessać PBS i ponownie zawiesić kulki w ~300 μl PBS.
2. Przygotuj sortownik komórek z cytometrią przepływową do przetwarzania próbki: zdobądź probówki kompensacyjne, utwórz matrycę kompensacyjną i zastosuj matrycę do plików akwizycji próbek eksperymentalnych.
3. Przygotować główną mieszaninę koktajlu przeciwciał fluorescencyjnych, łącząc odpowiednią objętość każdego przeciwciała, jak określono w tabeli materiałów, w bursztynowej probówce o pojemności 1,5 ml dla wszystkich próbek, które mają być barwione. Wirować i odwirowywać koktajl przy 21 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 25 °C w celu osadzenia agregatów przeciwciał.
   Uwaga: Stosowane tutaj przeciwciała są wymienione w Tabeli materiałów.
4. Rozmrażać kriokonserwowane komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty. Dodać 0,5–2 ml zawiesiny komórek do 12 ml PBS w probówce o pojemności 15 ml, odwirować przy 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 25 °C i odessać PBS. Zawiesić ponownie w 3 ml PBS i przenieść do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml. Odwirować jak powyżej i odessać PBS, pozostawiając ~20 μL resztki PBS.
   UWAGA: Temperaturę barwienia można dostosować do cieplejszych lub niższych temperatur, w zależności od potrzeb dla określonych zastosowań, odpowiednio modyfikując warunki barwienia miareczkowania przeciwciał (patrz krok 1.2).
5. Zawiesić maksymalnie 2 x 10⁷ umytych komórek w 80 μl koktajlu przeciwciał i inkubować przez 20 minut w temperaturze 25 °C, chroniąc przed światłem. W przypadku próbek o wymiarach przekraczających 2 x 10⁷ komórek należy odpowiednio zwiększyć objętość reakcji barwienia, aby utrzymać <2 x 10⁷ komórek/100 μl.
6. Przemyć komórki, dodając 3 ml PBS, odwirowując przy 500 x g przez 3 minuty i odsysając supernatant.
7. Dokładnie zawiesić komórki w 300–500 μl PBS i przefiltrować, pipetując przez nylonową nasadkę sitową o średnicy 35 μm. Trzymaj komórki na lodzie i chroń przed światłem do czasu sortowania.

4. Przygotuj płytki do pobierania komórek, wykonaj sortowanie FACS i wygeneruj cDNA

1. Połączyć składniki RT-preamp Reaction Mix (Tabela 3) przez pipetowanie do pojedynczej sterylnej probówki wolnej od RNAzy/DNAzy.
   UWAGA: Ten krok można wykonać przed lub w trakcie barwienia w kroku 3. Enzym RT można tutaj pominąć, aby określić udział matrycy DNA w sygnale qPCR.
2. Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 10 μl mieszanki reakcyjnej RT-preamp do żądanej liczby 96-dołkowych płytek zbiorczych do PCR. Uszczelnij płytki folią samoprzylepną i umieść płytki na wstępnie schłodzonych 96-dołkowych blokach aluminiowych.
3. Ustal schemat bramkowania sortowania komórek na cytometrze przepływowym, uzyskując dane z około 20 000 komórek barwionej próbki. Upewnij się, że macierz wynagrodzeń została zastosowana do zebranych danych. Narysuj bramki i zdefiniuj drzewo bramkowania, które identyfikuje populację komórek będących przedmiotem zainteresowania, które mają zostać wyizolowane do analizy ekspresji genów.
   UWAGA: Drzewo bramkowania używane do zbierania potencjalnych komórek SIV vRNA⁺ jest pokazane na Rysunek 3.
4. Wprowadź odpowiednie ustawienia instrumentu, aby określić liczbę i podzbiór komórek, które mają zostać posortowane do każdej studzienki. Dodatkowe szczegółowe instrukcje dotyczące sortowania serii rozcieńczeń ograniczających komórek lub pojedynczych komórek znajdują się odpowiednio w krokach 5 i 6.
5. FACS sortuje komórki na przygotowane 96-dołkowe płytki do pobierania PCR. Usuń uszczelkę samoprzylepną przed sortowaniem i zastąp ją nową uszczelką po sortowaniu.
   UWAGA: Płyty należy przechowywać na wstępnie schłodzonych blokach aluminiowych przez cały czas, w tym podczas sortowania.
6. Bezpośrednio po sortowaniu należy odwirować i odwirować płytkę zbiorczą o masie 2 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
7. Poddać termocykli płytkę w maszynie do PCR z podgrzewaną pokrywką w następujących warunkach: 50 °C przez 15 minut (RT), 95 °C przez 2 minuty, a następnie 18 cykli po 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 4 minuty (wstępne amplifikacja).
8. Rozcieńczyć cDNA w stosunku 1:5, przenosząc 5 μl cDNA do 20 μl buforu zawiesiny DNA w nowej 96-dołkowej płytce PCR. W tym momencie rozcieńczony cDNA może być przechowywany w temperaturze 4 °C lub -20 °C przez czas nieokreślony. cDNA jest teraz gotowe do użycia jako matryca do qPCR (kroki 5.2, 7.4).
   UWAGA: To rozcieńczenie zapewnia, że startery obecne w reakcji RT-preamp nie przyczyniają się do dalszego qPCR.

5. Wariant A: FACS sortuje komórki w serię ograniczającego rozcieńczenia, aby określić częstotliwość komórek vRNA⁺ lub przeprowadzić eksperymentalną kontrolę jakości

UWAGA: Przed wykonaniem sortowania pojedynczych komórek, może to być przydatne do określenia częstotliwości interesujących komórek, poprzez sortowanie komórek na seryjne rozcieńczenia w replikach. Ten krok zapewnia również cenną kontrolę jakości pod kątem wydajności sortowania, lizy komórek, odzyskiwania RNA i syntezy cDNA, zgodnie z opisem w kroku 5.3. Wcześniejsze określenie częstości komórek vRNA⁺ pozwala na dokładniejsze oszacowanie liczby pojedynczych komórek, które muszą zostać posortowane, aby osiągnąć wystarczającą wielkość próbki do odpowiednio zasilanej analizy ekspresji genów komórkowych vRNA⁺.

1. FACS sortuje komórki na 96-dołkowe płytki przygotowane jak w krokach 4.1–4.2 i zbiera 1–1,000 komórek na studzienkę w wielu powtórzeniach.
   UWAGA: Liczba studzienek replikowanych przy każdym rozcieńczeniu komórki jest zwykle odwrotnie proporcjonalna do stężenia komórek w basenie. Gdy częstość występowania zakażonych komórek jest znacznie niższa niż 1%, rozcieńczenia komórek powinny koncentrować się na 100-1000 komórek na studzienkę. Przykładowa mapa tablic sortowania znajduje się w Rysunek 1, w lewym górnym rogu. Należy unikać przekraczania 1000 komórek na studzienkę ze względu na wynikający z tego wzrost objętości reakcji i zakłócenia w dalszej syntezie i kwantyfikacji cDNA.
2. Połączyć odczynniki qPCR w roztworze mieszaniny głównej przedstawionym w tabeli 4. Dla objętości reakcyjnej 25 μl, 22,5 μl mieszanki wzorcowej łączy się z 2,5 μl rozcieńczonej matrycy cDNA z kroku 3.9. Przeprowadzić qPCR w standardowych warunkach cyklicznych (np. 94 °C przez 5 minut, a następnie 40 cykli w temperaturze 94 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę).
   UWAGA: Reakcje qPCR typu singleplex przy użyciu konwencjonalnego instrumentu qPCR w czasie rzeczywistym są zalecane jako ekonomiczna analiza wstępna jednego lub kilku testów w celu wykazania wydajnego sortowania komórek, odzyskiwania RNA i syntezy cDNA. Może być również używany do obliczania częstotliwości komórek vRNA⁺. Multipleksowe reakcje qPCR z wykorzystaniem Biomark są zazwyczaj bardziej odpowiednie do wielkoskalowych analiz pojedynczych komórek.
3. W celu kontroli jakości wykreśl wartości Et (Et = Ct_max − Ct) w stosunku do liczby komórek posortowanych na studzienkę w skali logarytmicznej₁₀ i zastosuj analizę regresji liniowej.
   UWAGA: Konsekwentne powtórzenia, nachylenie regresji liniowej wynoszące 3,3 (± 0,3) i R² >0,9 wskazują na efektywny eksperyment. Przykłady optymalnego i nieoptymalnego sortowania eksperymentów z przedwzmacniaczem RT są pokazane na Rysunek 4.
4. Aby określić częstość komórek vRNA⁺, wykreśl liczbę komórek posortowanych według dołka na osi x (skala logarytmu₁₀) oraz frakcję dołków dodatnich dla vRNA przy każdym rozcieńczeniu komórki na osi y. Dla przykładu, zobacz Rysunek 1 (lewy dolny róg, rozkład Poissona). Zastosuj model regresji liniowej do danych, aby określić liczbę komórek, w których średnio znajduje się jedna komórka dodatnia, co odpowiada 63,2% dodatnich studzienek (0,632 na osi y)²¹. Przelicz tę liczbę rozcieńczenia komórek (przecięcie osi x) na częstotliwość wyrażoną w procentach. Na przykład jedna komórka vRNA⁺ na 48 komórek odpowiada częstości 2,1%.

6. Wariant B: FACS sortuje komórki do analizy pojedynczej komórki

1. Wykonaj kroki 4.1–4.8 i określ jedną komórkę posortowaną na studzienkę za pomocą funkcji sortowania indeksowego cytometru przepływowego, aby utworzyć indywidualne pliki FCS dla każdej posortowanej komórki, zmapowane według pozycji studzienki.
   UWAGA: Jeśli liczba sortujących płytek zbiorczych przekracza liczbę dostępnych termocyklerów, cykle można zatrzymać po etapie inaktywacji odwrotnej transkryptazy (95 °C przez 2 min), a cDNA można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy termocyklery będą dostępne. W takim przypadku należy rozpocząć wstępne wzmacnianie w pierwszym cyklu w temperaturze 95 °C przez 15 s.
2. Opcjonalnie: Utwórz "pule" cDNA składające się z cDNA ze zdefiniowanych przez użytkownika partii pojedynczych komórek w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w poszukiwaniu rzadkich komórek będących przedmiotem zainteresowania przy użyciu resztkowych nierozcieńczonych cDNA. Przenieś 2 μl nierozcieńczonego, wstępnie amplifikowanego cDNA z pojedynczej komórki za pomocą pipety wielokanałowej do nowej płytki 96-dołkowej. Powtórzyć tę czynność, pipetując 2 μl cDNA ze wszystkich dodatkowych pojedynczych komórek z wyznaczonej puli do tego samego dołka. Badanie przesiewowe puli cDNA pod kątem genów będących przedmiotem zainteresowania (np. vRNA) w celu określenia tych, które zawierają komórki dodatnie za pomocą konwencjonalnego qPCR. Ponieważ łączenie wymaga tylko niewielkiej porcji cDNA z każdej komórki, pozostałe ~8 μL cDNA jest nadal dostępne do analiz pojedynczych komórek.
   UWAGA: Przed wykonaniem analiz ekspresji genów w pojedynczej komórce zaleca się strategie łączenia w celu zmniejszenia liczby pojedynczych komórek badanych za pomocą wymagającego dużej ilości zasobów multipleksowego qPCR. Jest on odpowiedni w sytuacjach, w których komórki będące przedmiotem zainteresowania (np. SIV mRNA+) można zidentyfikować za pomocą wstępnego testu qPCR z pojedynczym pleksem. Proste, wysokoprzepustowe strategie tworzenia pul cDNA obejmują połączenie 2 μl nierozcieńczonego cDNA z rzędów płytki do sortowania kolekcji (tj. wszystkich 12 komórek w wierszu A) lub kolumn (tj. wszystkich 8 komórek w kolumnie 1) do jednego dołka w nowej płytce. Aby określić najlepszą strategię łączenia grup, należy wziąć pod uwagę oczekiwaną częstotliwość występowania komórek zainteresowania z kroku 5.4. Na przykład, jeśli oczekuje się, że 10% komórek będzie dodatnich, pule składające się z sześciu próbek cDNA z jednej komórki będą często ujemne, a komórki reprezentowane w tej puli mogą być w ten sposób wyłączone z dalszych analiz pojedynczych komórek.

7. Multipleksowy qPCR na platformie Biomark

UWAGA: Ta sekcja może być zgodna z wersją A lub B opisaną powyżej. W opisanym tutaj badaniu zastosowano go wyłącznie do analizy pojedynczych komórek.

1. Przygotować płytkę do oznaczania qPCR, pipetując po 4 μl każdego testu z płytki do oznaczania 2 razy (przygotowanej w kroku 2.2) do nowej 96-dołkowej płytki do PCR zawierającej 4 μl odczynnika ładującego test w każdym dołku. Utrzymywać płytkę testową w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Płytka testowa jest stabilna w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia i w temperaturze -20 °C przez jeden miesiąc. W związku z tym przydatne może być przygotowanie wystarczającej ilości materiału na wiele wiórów i odpowiednie przechowywanie.
2. Dozować płyny z przewodu sterującego ze strzykawek zalewających do dwóch zaworów wlotowych chipa. Usuń plastikową osłonę spod płyty. Umieść chip na kontrolerze IFC tak, aby strona z karbem znajdowała się w pozycji A1. Z menu głównego wybierz skrypt "Prime". Uruchom skrypt.
3. Przygotuj mieszaninę reakcyjną w czasie rzeczywistym, mieszając 50 μl odczynnika do ładowania próbki z 500 μl PCR Master Mix (tabela materiałów) dla każdego chipa mikroprzepływowego. Odpipetować 4,4 μl do każdego dołka nowej 96-dołkowej płytki PCR, zwanej dalej "płytką do próbki".
4. Pobrać pipetę 3,6 μl cDNA rozcieńczonego w stosunku 1:5 z kroku 4.8 do płytki z próbką zawierającą mieszaninę reakcji w czasie rzeczywistym
   UWAGA: Jeśli przeprowadzono selekcję w dół PCR w celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem rzadkich komórek (np. vRNA⁺) do dalszej analizy, jak omówiono w kroku 6.2, uwzględnij tylko komórki reprezentowane w pulach dodatnich.
5. Po zakończeniu zalewania wiórów należy załadować wloty wiórów, dozując 5 μl z płytki testowej do odpowiedniego dołka po stronie karbowanej (testowej) chipa i 5 μl z płytki próbki do odpowiedniego dołka po drugiej stronie (próbki) chipa. Włóż chip do kontrolera IFC i uruchom skrypt "Load mix".
6. Przenieś chip na platformę Biomark, aby przeprowadzić multipleksowany qPCR. Kontynuuj konfigurację urządzenia i programowanie qPCR zgodnie z instrukcjami krok po kroku dostarczonymi przez oprogramowanie do analizy PCR w czasie rzeczywistym i przy użyciu protokołu Gene Expression (GE) 96.96 Standard V.1 z 40 cyklami PCR. Zapisz plik ChipRun w wyznaczonym folderze.
   UWAGA: Wiele żetonów może być uruchamianych dziennie i przez wiele dni.
7. Przeanalizuj dane qPCR.
   1. Otwórz oprogramowanie do analizy PCR w czasie rzeczywistym. Otwórz plik "ChipRun.bml" z menu "Plik | Otwórz".
   2. Znajdź "Chip Explorer" i "Chip Run Summary" w lewym górnym rogu okna oprogramowania. Zidentyfikuj trzy składniki podsumowania przebiegu chipa: widoki analizy, konfiguracja próbki i konfiguracja detektora.
   3. Kliknij "Ustawienia detektora". W sekcji "Zadanie" kliknij "Nowy" i wybierz typ kontenera "Płyta SBS" i format kontenera "SBS96". Obok "Mapowanie" kliknij przycisk ... i wybierz "M96-Assay-SBS96.dsp".
      1. Opcjonalnie: Przypisz każdemu detektorowi (testowi) numer lub nazwę w sekcji "nazwa" każdego dołka, klikając dwukrotnie 1. studzienkę. Przejdź do następnego dołka, naciskając "F2".
   4. Kliknij "Przykładowa konfiguracja". W sekcji "Zadanie" obok "Mapowanie" kliknij przycisk ... i wybierz "M96-Sample-SBS96.dsp".
   5. Kliknij "Widoki analizy". W sekcji "Zadanie" w zakładce "qPCR" wybierz "Korekta linii bazowej dla liniowej (pochodnej)" i "Metoda progu Ct dla użytkownika (detektory)". W zakładce "Progi Ct" zaznacz pole "Inicjalizuj z Auto". Kliknij przycisk "Analizuj" powyżej.
   6. W prawym górnym kwadrancie "Widoki analizy" kliknij drugą zakładkę "Tabela wyników". Z menu rozwijanego wybierz "Widok mapy ciepła". Pojawi się mapa cieplna z danymi.
      1. Opcjonalnie: Aby zapewnić jednolitą fluorescencję ROX na chipie, wybierz "Widok obrazu" zamiast "Widok mapy cieplnej" z tego samego menu. W drugim od prawej oknie nad mapą ciepła wybierz "ROX". W pierwszym z prawego okna wybierz jeden z 1–40 cykli. Kliknij na czwarte z prawego okna, aby przełączyć się na czarno-biały wyświetlacz fluorescencji ROX. Pojawi się obraz, który informuje o rozpryskach, cząstkach lub defektach na chipie. Jeśli jednorodność ROX jest rażąco zasłonięta, uruchom ponownie chip.
   7. Pod mapą cieplną kliknij "Próg" i "Wykres loga". Dostosuj progi Ct ręcznie dla każdego detektora, klikając testy (kolumny mapy cieplnej) i przeciągając próg w razie potrzeby, aby przeciąć krzywe wzmocnienia w fazie wykładniczej. Po zakończeniu kliknij "Analizuj".
8. Wyeksportuj dane qPCR jako plik .csv. Zaimportuj dane do arkusza kalkulacyjnego lub oprogramowania do analizy statystycznej (np. JMP) i odwzoruj wyniki według pozycji próbki i testu na chipie. Uporządkuj komórki w grupy na podstawie ekspresji genów wirusa, tworząc nową kolumnę i używając formuły warunkowej. W sekcji "Analizuj" wybierz "Dopasuj Y do X" i wykreśl ekspresję genów w stosunku do grupy. Zastosuj analizę statystyczną.
   UWAGA: Reprezentatywna ekspresja ilościowa pojedynczej komórki czterech gatunków RNA SIV jest przedstawiona na wykresach dwuwymiarowych w Rysunek 5A. Ilościowa ekspresja genu gospodarza w komórkach SIV RNA⁺ jest pokazana w Rysunek 5B.
9. Wyodrębnij ilościowe wartości ekspresji białek z danych FACS pojedynczej komórki.
   1. Otwórz pliki .fcs z sortowania FACS (krok 6.1) odpowiadające płytce 96-dołkowej przy użyciu FlowJo w wersji 9. Po podświetleniu nazwy pliku wybierz "Platforma | Brama z numerem wydarzenia | Utwórz indeksowane bramki sortowania". Poszczególne komórki będą wyświetlane według wierszy.
   2. Zaznacz wszystkie 96 komórek (nie wiersze) i wybierz "Przestrzeń robocza | Eksport | Zaznacz wszystkie skompensowane fluoryzacje". W sekcji "Typ danych" wybierz "Plik FCS", kliknij "Eksportuj" i wybierz wyznaczony folder.
   3. Przeciągnij nowe pliki .fcs dla poszczególnych komórek do nowego obszaru roboczego FlowJo. Zaznacz wszystkie komórki, kliknij "Dodaj statystyki" (przycisk "Σ" w lewym górnym rogu) "| Średnia| Wszystkie parametry fluoru".
   4. Otwórz "Edytor tabel", klikając czwarty przycisk od lewej w lewym górnym rogu. Zaznacz wszystkie fluoryzatory pierwszej komórki i przeciągnij je do okna edytora tabel. W oknie edytora tabel kliknij ten sam przycisk u góry "Utwórz i wyświetl tabelę". Spowoduje to utworzenie tabeli zawierającej 96 komórek i parametru liczbowego dla każdego fluoru.
   5. Skopiuj dane wyjściowe do oprogramowania bazy danych (np. MS Excel, JMP), kopiując/wklejając lub klikając "Zapisz i uruchom aplikację" (czwarty od lewej przycisk nad tabelą).
      UWAGA: Ta procedura jest specyficzna dla FlowJo w wersji 9. FlowJo w wersji 10 wykorzystuje inną procedurę do importowania indeksowanych danych. Indeksowane dane przepływu można również kopiować/wklejać do JMP bezpośrednio z plików .csv utworzonych przez sorter komórek.
10. Scal jednokomórkowe dane FACS i dane qPCR według numeru płyty i pozycji studzienki. Wykonywanie analiz graficznych i statystycznych na połączonych danych dotyczących genów jednokomórkowych (qPCR) i ekspresji białek (FACS).
    Uwaga: Przykłady połączonych danych qPCR i FACS dla pojedynczych komórek są pokazane w Rysunek 6 (profile ekspresji białek powierzchniowych gospodarza dla zakażonych SIV, splicowanych komórek makaków rezusów vRNA⁺), Rysunek 7 (ekspresja genu CD4 w porównaniu z ekspresją białka powierzchniowego CD4 w splicowanych komórkach makaków rezusów vRNA⁺), oraz wcześniej opublikowany²⁰. W celu zidentyfikowania genów o zróżnicowanej ekspresji w populacjach komórek będących przedmiotem zainteresowania, zalecane są opisane wcześniej metody analizy pojedynczych komórek^20,22,23,24, które uwzględniają odsetek komórek z dodatnim wynikiem dla genu, a także wartość ciągłej ekspresji genu.

Results

Przebieg pracy dla całego protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1. Składa się z dwóch wariantów zdefiniowanych przez liczbę posortowanych komórek: albo ograniczających rozcieńczenie, albo jako pojedyncze komórki, jak opisano w tekście. Przykłady analiz kwalifikacyjnych starter-probe na 2-krotnych seryjnych rozcieńczeniach RNA pokazano w Rysunek 2. Strategia bramkowania w celu identyfikacji potencjalnych komórek SIV⁺ j...

Discussion

Opisany tutaj protokół, określany jako tSCEPTRE, integruje ilościowe oznaczanie białek powierzchniowych pojedynczych komórek za pomocą wieloparametrowej cytometrii przepływowej z ilościową ekspresją mRNA pojedynczej komórki za pomocą wysoce multipleksowanego RT-qPCR. Połączenie tych dwóch technologii umożliwia tworzenie wysokiej jakości migawek połączonego profilu transkrypcyjnego i białkowego pojedynczych komórek w formacie o wysokiej przepustowości. Używamy tej metody do identyfikacji dotychczas nieuchwytnych komórek z...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Odczynniki i materiały eksploatacyjne do ekstrakcji <>RNA i PCR
Genemate 96-dołkowa płytka do PCR z półspódniczką	BioExpress/VWR	T-3060-1
Samoprzylepne uszczelki do PCR	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-dołkowa płytka do PCR	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optyczny film samoprzylepny	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Szklana woda destylowana	Teknova	W3345
Indeks górny III Platynowy jednoetapowy zestaw qRT-PCR	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
Inhibitor RNAZY SUPERase	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Barwnik referencyjny (jeśli oddzielnie od zestawu)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
Bufor zawiesinowy DNA	Teknova	T0223
RNAwodny zestaw	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan testy ekspresji genów niewymienione w tabeli 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Odczynniki Biomark
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Odczynnik do ładowania testu	Fluidigm	85000736
Odczynnik do ładowania próbki	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS odczynniki
SPHERO COMPtrol Goat anty-mysie (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Probówka polistyrenowa z sitkiem	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	rozcieńczony 1:800
mysz Klon anty-ludzki CD3 BV650 SP34-2	<>	563916	rozcieńczony 1:40
mysz Klon anty-ludzki CD4 BV786 L200	BD Biosciences	563914	rozcieńczony 1:20
Mysz anty-ludzki klon CD8 BUV496 RPA-T8	BD Biosciences	564804	rozcieńczony 1:10
Mysz anty-ludzka klon CD28 BV711 CD28.2	Biolegend	302948	rozcieńczony 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 klon DX2	BD Biosciences	564710	rozcieńczony 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 klon M5E2	Biolegend	301842 <	p>rozcieńczony 1:83
Mouse Klon Anti-Human CD16 BV510 3G8	Biolegend	302048	rozcieńczony 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 klon 2H7	Biolegend	302340	rozcieńczony 1:37
> Klon Anty-CD38-R PE OKT10	< p>NHP odczynnik resurce	N/A	rozcieńczony 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 klon FN50	BD Biosciences	564364	rozcieńczony 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 klon G46-6	BD Nauki biologiczne	561358	rozcieńczone 1:20
mysz Anty-ludzki klon ICOS Alexa Fluor 700 C398.4A	Biolegend	313528	rozcieńczony 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences <
p>ProtoFlex Podwójny 96-dołkowy system PCR	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
kontroler IFC HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD