Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Podsumowanie

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.

Streszczenie

Zmiany objętości powietrza wywołane przez świadomy podmiot oddychający spontanicznie w pudełku ciała są podstawą pletyzmografii, techniki używanej do nieinwazyjnej oceny niektórych cech funkcji oddechowych u ludzi, jak również u zwierząt laboratoryjnych. Niniejszy artykuł koncentruje się na zastosowaniu dwukomorowej pletyzmografii (DCP) u małych zwierząt. Zawiera on podstawowe informacje na temat metodologii, a także szczegółową procedurę krok po kroku, która pozwala skutecznie ocenić funkcję oddechową u przytomnych, spontanicznie oddychających zwierząt w sposób nieinwazyjny. DCP może być używany do monitorowania funkcji oddechowych wielu zwierząt równolegle, a także do identyfikacji zmian wywołanych przez substancje aerozolowe w wybranym okresie czasu i w powtarzający się sposób. Eksperymenty na myszach kontrolnych i alergicznych są wykorzystywane w niniejszym dokumencie w celu wykazania użyteczności techniki, wyjaśnienia powiązanych parametrów wynikowych, a także omówienia powiązanych zalet i wad. Ogólnie rzecz biorąc, DCP zapewnia ważne i teoretycznie rzetelne odczyty, którym można zaufać w ocenie funkcji oddechowych przytomnych małych zwierząt zarówno na początku badania, jak i po wyzwaniach z substancjami w aerozolu.

Wprowadzenie

Coraz częstsze wykorzystywanie małych zwierząt do modelowania chorób układu oddechowego u ludzi skłoniło do opracowania technik ilościowej oceny funkcji układu oddechowego u tych zwierząt. Obecnie technika wymuszonej oscylacji (FOT) jest uznawana za najbardziej precyzyjne podejście do oceny mechaniki oddechowej u małych zwierząt^1,2. Jednak, jak stwierdzono zgodnie z zasadą niepewności fenotypowania, to, co zyskuje się na precyzji pomiaru za pomocą FONT, jest równoważone utratą nieinwazyjności³. Rzeczywiście, pomiary FOT są uzyskiwane w ściśle kontrolowanych warunkach eksperymentalnych, które wymagają znieczulenia, tracheotomii lub intubacji doustnej, a także wentylacji mechanicznej; Scenariusz daleki od rzeczywistości.

W sytuacjach, w których wymagania eksperymentalne zabraniają stosowania środków znieczulających lub wymagają niewielkiego lub żadnego odchylenia od naturalnego stanu fizjologicznego zwierzęcia, można rozważyć dwukomorową pletyzmografię (DCP). Jak sama nazwa wskazuje, układ DCP składa się z dwóch połączonych sztywnych komór zbudowanych tak, aby jak najbardziej hermetycznie odizolować głowę (lub nos) zwierzęcia w przedniej komorze, od klatki piersiowej, w tylnej komorze. W obrębie zestawu zwierzę jest przytomne i oddycha spontanicznie, będąc skrępowanym. Ponieważ ścianki komór nie mogą się rozszerzać ani chować, ruch powietrza do wewnątrz i na zewnątrz zwierzęcia generuje odpowiedni, ale przeciwny kształt fali wewnątrz tylnej komory, w wyniku sprężania/dekompresji otaczającego powietrza. W ten sposób można jednocześnie rozdzielić i uchwycić przebieg spowodowany przepływem przez nos w komorze przedniej i ten związany z ruchem klatki piersiowej w komorze tylnej. W zależności od konstrukcji konfiguracji DCP, przebiegi te mogą być uzyskiwane za pomocą zestawu przetworników ciśnienia lub pneumatachografów, aby odpowiednio rejestrować zmiany ciśnienia w komorze lub przepływu powietrza do i z komór w funkcji czasu. To drugie podejście jest obecnie bardziej powszechne.

Podczas gdy częstotliwość oddychania zwierzęcia może być dokładnie określona za pomocą dowolnego rodzaju technik pletyzmografii, sytuacja nie jest taka sama w przypadku określania objętości oddechowej i związanych z nią parametrów wentylacji (np. wentylacja minutowa, objętość wydechowa, itp.). W przeciwieństwie do techniki pletyzmografu całego ciała (WBP), w której objętość oddechowa zwierzęcia jest szacowana na podstawie sygnału pudełkowego^4,5, technika DCP zapewnia dokładną ocenę objętości oddechowej. Jest to związane z bezpośrednim nabywaniem ruchów klatki piersiowej zwierzęcia w tylnej komorze, które są proporcjonalne do zmian objętości płuc podczas oddychania.

Oprócz tych dokładnych parametrów wentylacji (np. objętość oddechowa, częstotliwość oddychania i minutowa wentylacja), niektóre zaburzenia w kształcie cyklu oddechowego mogą być również wykorzystane do zbadania aspektów neuronalnych, które regulują napęd oddechowy lub odruchy oddechowe. Konkretnym przykładem takiego zastosowania może być ocena potencjału drażniącego substancji wdychanych na neurony czuciowe górnych dróg oddechowych⁶. W tym przypadku czas trwania pauzy na początku wydechu jest określany za pomocą parametru zwanego pauzą końcowo-wdechową (EIP), określanego również jako czas trwania hamowania⁶. Przedłużenie tej przerwy przez substancję drażniącą wiąże się z zamknięciem głośni zwierzęcia, powodując mierzalny okres hamowania w pierwszej części wydechu ^6,7.

Kolejną ważną zaletą DCP jest to, że dostarcza dwóch sprawdzonych i niekwestionowanych parametrów, które są wrażliwe na przeszkody w przepływie powietrza. Jeden z nich nazywa się przepływem w objętości wydechowej w połowie pływu i jest w skrócie EF50^8,9,10. Jest to przepływ powietrza w połowie objętości każdego oddechu oddechowego podczas wydechu. EF50 jest ekstrahowany ze śladu przepływu w klatce piersiowej i dzięki temu może być mierzony bez komory przedniej (tj. w konfiguracji typu head-out). Drugi nazywa się specyficznym oporem dróg oddechowych i jest w skrócie sRaw^11,12,13. Oznaczenie sRaw wymaga jednoczesnego rejestrowania przepływów przez nos i klatkę piersiową zwierzęcia, ponieważ są one obliczane na podstawie opóźnienia czasowego między tymi oddzielnymi śladami oddechowymi w punkcie zerowego przepływu na końcu wdechu. Uzasadnienie opisujące podstawę, na której to opóźnienie odnosi się do sRaw, zostało wcześniej wyjaśnione¹¹. Mówiąc prościej, zmiany objętości płuc poprzedzają ruch powietrza, ponieważ musi rozwinąć się gradient ciśnienia, aby napędzać przepływ powietrza. U zdrowego zwierzęcia oddychającego spokojnie opóźnienie to jest zazwyczaj bardzo małe. Jednak na gradient ciśnienia, który jest wymagany do dostosowania się do danego przepływu (np. przepływu wystarczającego do zapewnienia odpowiedniej wentylacji), ma wpływ stopień oporu dróg oddechowych. Na przykład podczas zwężenia oskrzeli gradient ciśnienia potrzebny do dostosowania się do danego przepływu jest większy, co oznacza, że zwierzę musi ciężej pracować, aby oddychać. Większy gradient ciśnienia w klatce piersiowej zwierzęcia oznacza również, że większa część przepływu do i z tylnej komory jest spowodowana dekompresją/kompresją powietrza w klatce piersiowej, co jest częścią całkowitego rozszerzania/cofania klatki piersiowej, która jest niezgodna z przepływem przez nos. Zwiększony opór spowodowany zwężeniem oskrzeli zwiększy zatem opóźnienie między tylną a przednią komorą, a tym samym zwiększy sRaw. Na gradient ciśnienia, który napędza przepływ powietrza do i na zewnątrz płuc, wpływa również początkowa objętość gazu w klatce piersiowej (TGV). Na przykład przy większej TGV rozszerzanie/cofanie klatki piersiowej potrzebne do wytworzenia danego gradientu ciśnienia jest większe (po prostu dlatego, że przemieszczenie objętościowe, które jest wymagane do wytworzenia danego gradientu ciśnienia, jest większe), co oznacza również, że zwierzę musi ciężej pracować, aby oddychać. Ponownie, te dodatkowe przemieszczenia klatki piersiowej są wymagane do dekompresji/sprężania powietrza w klatce piersiowej, a zatem są niezgodne z przepływem przez nos. Tak więc zwiększony TGV zwiększy również opóźnienie między komorami, a tym samym zwiększy sRaw. Jak widać, zarówno zwężenie oskrzeli, jak i zwiększony TGV powodują ważniejszy wysiłek związany z wciąganiem i wyprowadzaniem powietrza z płuc. Takie jest w istocie fizjologiczne znaczenie sRaw. Reprezentuje pracę wymaganą do oddychania^5,14.

Dlatego ważne jest, aby zrozumieć, że na sRaw wpływają dwa różne czynniki: opór dróg oddechowych i TGV. W rzeczywistości sRaw może być wyrażony jako iloczyn oporu dróg oddechowych i TGV¹¹. Świadome zwierzęta mogą dowolnie modyfikować swoje TGV, tak aby dostosować swoją wentylację do danego środowiska. W takich warunkach, gdy naturalny stan fizjologiczny zwierzęcia pozostaje niezmieniony, niemożliwe jest rozróżnienie, czy zmiana sRaw wynika ze zmiany oporu dróg oddechowych, ze zmiany TGV, czy też z mieszanki tych dwóch. W związku z tym zaleca się uzupełnienie oceny DCP o bardziej inwazyjne pomiary mechaniki oddechowej i/lub objętości płuc, takie jak te dostarczane przez FOT^1,15.

Do tej pory DCP był używany w różnych aplikacjach badawczych. Technika ta może być stosowana z komorą głowy lub bez niej w celu ilościowej i dokładnej oceny wpływu różnych substancji, takich jak środki farmaceutyczne, alergeny, substancje drażniące lub inne mediatory, na funkcje oddechowe u przytomnych małych zwierząt^16,17,18. Przednia komora może być również używana jako komora naświetlająca substancje aerozolowe lub zmienne stężenia gazów (hipoksja, hiperkapnia itp.)¹⁹. Dogodnie pozwala na jednoczesny pomiar ostrych skutków tych ekspozycji. W rzeczywistości jednym z powszechnych zastosowań DCP jest ocena stopnia reakcji na metacholinę w aerozolu w różnych modelach chorób układu oddechowego^{20,21,22,23,24,25}.

Chociaż technika DCP wydaje się prosta, niektóre praktyczne wyzwania mogą potencjalnie zniechęcić niedoświadczonych użytkowników lub pogorszyć dokładność i powtarzalność wyników. Niniejsza praca zawiera szczegółowy opis zalecanych procedur w celu skutecznego rejestrowania funkcji oddechowych przez DCP u przytomnych, skrępowanych, spontanicznie oddychających myszy. Opis jest specyficzny dla podanego sprzętu (patrz Tabela materiałów). Użyteczność i wartość DCP wykazano również we wspólnym modelu alergicznego zapalenia płuc w dwóch szczepach myszy testowanych na początku badania i w odpowiedzi na metacholinę w aerozolu.

Protokół

Następujące procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Instytutu Serca i Płuc w Quebecu zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (CCAC).

1. Przygotowanie

1. studiować
   1. (Krytyczne) Przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek eksperymentu należy uzyskać odpowiednie zgody (np. IACUC) i szkolenia (np. w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami).
   2. Zapoznaj się ze sprzętem i oprogramowaniem operacyjnym. Przeczytaj instrukcje obsługi i, jeśli to konieczne, utwórz plik konfiguracyjny, aby zdefiniować liczbę lokalizacji, sygnałów wejściowych, analizatorów i parametrów.
      nuta: Upewnij się, że wybrałeś wysoką częstotliwość próbkowania (2 KHz).
   3. Skonfiguruj ustawienia analizatorów dla interesujących Cię parametrów.
      1. Wybierz pozycję Dostrajanie na pasku narzędzi, a następnie pozycję Analizatory.
      2. Dostosuj próg przepływu do wartości, która prawidłowo rozdziela oddechy (mysz: 0,5 ml/s) i wybierz Ti + Te, aby obliczyć częstość oddechów.
      3. Ustaw wartość ciśnienia atmosferycznego (760 mm Hg) i określ maksymalne odchylenie objętości wdechowej/wydechowej, aby oddech został uznany za prawidłowy (mysz: 20%).
      4. Kliknij Ustawienie w polu Obliczone parametry, aby dostosować limity akceptacji.
         nuta: W opisanych eksperymentach na myszach zastosowano następujące ustawienia: czas wdechu, od 50 do 170 ms; czas wygaśnięcia, od 40 do 180 ms; częstotliwość oddychania, od 30 do 450 uderzeń na minutę; opór właściwy dróg oddechowych, od 0 do 15 cmH₂O·s; przepływ śródwydechowy z dokładnością co najmniej 3 miejsc po przecinku.
      5. Po zakończeniu wybierz pozycję Zastosuj i zamknij, aby zamknąć okno dialogowe.
   4. Z menu paska narzędzi ponownie przejdź do opcji Strojenie, a następnie Pamięć masowa, aby ustawić żądaną szybkość przechowywania danych. Kliknij Zastosuj i zamknij, aby wyjść z okna.
      nuta: Zazwyczaj stosuje się średnią co 10 s.
   5. Utwórz protokół w oprogramowaniu operacyjnym, aby zdefiniować sekwencję poleceń i żądany czas dla każdego z nich. Przykład jest wyświetlany w Rysunek 1.
   6. Jeżeli doświadczenie obejmuje podawanie substancji w aerozolu, należy przygotować odpowiednie roztwory i rozcieńczenia zgodnie ze stężeniami, które mają być badane.
2. zwierzę
   1. Pracuj w cichym miejscu oddalonym od pomieszczenia mieszkalnego. Pozwól zwierzętom dostosować się do zmiany środowiska.
   2. Zważ zwierzęta i wybierz odpowiedni rozmiar pasa.
   3. (Krytyczne) Przyzwyczaj zwierzęta do unieruchomienia i procedur przed rozpoczęciem doświadczenia. W zależności od projektu eksperymentu może być konieczne wielokrotne sesje aklimatyzacyjne o wydłużającym się czasie trwania (np. 5-30 min).
      Uwaga: Zwierzęta, które się nie aklimatyzują, powinny zostać usunięte z badania.
      1. Podczas każdej sesji aklimatyzacyjnej należy umieścić zwierzę w unieruchomieniu, zaczynając od tylnego otworu; pomocne może być trzymanie urządzenia w pozycji pionowej.
      2. Gdy zwierzę znajdzie się na miejscu, włóż tylny tłok i delikatnie zablokuj go na miejscu, nie stosując nadmiernej siły.
      3. (Krytyczne) Sprawdź wzrokowo, czy zwierzę oddycha normalnie. W razie potrzeby dostosuj jego położenie, przesuwając mechanizm blokujący. Upewnij się, że nozdrza zwierzęcia wystają poza stożek nosa, a pysk opiera się o wewnętrzne ścianki ogranicznika.
      4. Odczepić tylny panel komory piersiowej, włożyć ogranicznik z zwierzęciem przez gumowy otwór w komorze piersiowej i zamknąć komorę.
      5. Zamocuj komorę głowicy i zapewnij przepływ odchylenia. Użyj przepływu 0,5 l/min dla myszy.
      6. Pozwól zwierzęciu zrelaksować się przez 5 minut.
      7. Gdy zwierzę się uspokoi, rozpocznij rejestrowanie sygnałów przepływu przez nos i klatkę piersiową. Sprawdź na ekranie komputera, czy ślady są gładkie i czy wykazują regularny wzorzec oddychania; zobacz przykład w Rysunek 2.
         nuta: Jeżeli protokół obejmuje podawanie substancji w aerozolu, do procedury aklimatyzacji można włączyć prowokację solą fizjologiczną.
      8. Pod koniec każdej sesji należy wyjąć zwierzę z komory piersiowej i krępowania, a następnie umieścić je z powrotem w klatce i pomieszczeniu
      .
3. sprzęt
   1. W dniu eksperymentu rozpocznij sesję eksperymentalną i załaduj odpowiedni plik konfiguracyjny.
      nuta: Sprawdź, czy zawiera żądany protokół eksperymentu.
   2. Przejdź do opcji Uruchom w menu paska narzędzi. Wprowadź informacje o eksperymencie i zwierzęciu. Po zakończeniu kliknij przycisk Uruchom u dołu okna.
   3. Kontynuuj kalibrację systemu. Skalibruj każde miejsce i sygnał wejściowy osobno.
      1. Włącz generator przepływu polaryzacyjnego, podłącz go do komory głowicy za pomocą kawałka rurki i wyreguluj natężenie przepływu.
      2. Zamknij górny otwór komory głowicy zaślepką.
      3. Odłącz tylny panel komory piersiowej, mocno włóż narzędzie kalibracyjne do gumowego otworu między głową a komorą ciała, aby utworzyć hermetyczne uszczelnienie. Następnie zamknij i ponownie zamocuj tylny panel komory piersiowej.
      4. Sprawdź, czy boczny port komory piersiowej jest zaślepiony.
      5. Z menu paska narzędzi oprogramowania przejdź do Strojenie, a następnie Kalibruj.
      6. Przejdź do Wejście 1 (klatka piersiowa) i wybierz opcję Kalibruj, aby uruchomić okno dialogowe kalibracji sygnału przepływu w klatce piersiowej.
      7. (Krytyczny) Sprawdź, czy parametry wymienione w oknie dialogowym kalibracji wyświetlają odpowiednie ustawienia, tj. Niskie naprężenie fizyczne: 0; Obciążenie fizyczne zastosowane wysoką wartością: -20 mL/s; Próbki: Integracja. Po zakończeniu kliknij Niski w oknie Próbki.
      8. Sprawdź, czy generowany sygnał jest stały w oknie wyświetlacza, a następnie kliknij Zamknij.
      9. Podłącz strzykawkę o pojemności 20 ml przez boczny port komory piersiowej za pomocą plastikowego łącznika i kawałka rurki.
      10. (Krytyczne) Wybierz Wysoki w oknie Próbki i natychmiast wstrzyknij 20 ml powietrza do komory w ciągu 2 sekund przy jak najbardziej stałym natężeniu przepływu.
      11. Sprawdź, czy wygenerowany sygnał pojawia się w całości w oknie wyświetlacza. Użyj ikony strzałki, aby sprawdzić, czy sygnał jest wyśrodkowany i symetryczny wokół linii zerowej. Następnie kliknij Zamknij. Usuń wszelkie przesunięcia od zera, klikając Usuń przesunięcie AC w oknie Samples
          nuta: W razie potrzeby kalibrację wysokiej wartości można powtórzyć.
      12. Sprawdź, czy wynikowy skalowany zakres wejściowy mieści się w zalecanym zakresie (mysz: od ±280 do ±420 ml/s). (Krytyczny) Powtórz kroki kalibracji, jeśli wartości wykraczają poza dopuszczalny zakres.
      13. Skalibrować komorę głowy w podobny sposób jak komorę piersiową (krok 1.3.3.6). Tym razem wybierz Wejście 2 (nosowe).
          Uwaga: (Ważne) Wartość wysokiej wartości zastosowanego obciążenia fizycznego musi być ustawiona na +20 ml/s. Spowoduje to zmianę biegunowości przepływu w komorze przedniej w stosunku do komory tylnej. W związku z tym, gdy zwierzę oddycha, dwa sygnały przepływu będą prawie w fazie, z wyjątkiem opóźnienia użytego do obliczenia sRaw.

2. Pomiary funkcji płuc

1. Zważ zwierzęta i zanotuj ich masę ciała.
2. Umieścić zwierzę w unieruchomieniu i umieścić je w komorze pletyzmografu piersiowego (kroki od 1.2.3.1 do 1.2.3.5).
3. Pozwól zwierzęciu zrelaksować się przez co najmniej 5 minut.
4. Uruchom protokół poleceń, wybierając pierwszy krok, a następnie kliknij Wykonaj.
5. Sprawdź na ekranie komputera, czy sygnały oddechowe zwierzęcia są regularne i płynne (Rysunek 2). Oprogramowanie automatycznie wyświetla obliczone parametry na zasadzie oddech po oddechu. Sprawdź, czy parametry zwierzęcia są stabilne.
6. Rejestruj wzorzec oddychania w warunkach wyjściowych przez maksymalnie 10 minut.
7. Dla protokołów obejmujących podawanie substancji badanej za pomocą aerozolu, należy postępować, co następuje:
   1. Dostosuj czas włączenia nebulizatora i cykl pracy zgodnie z wymaganiami.
      nuta: W przykładach przedstawionych w tym artykule nebulizator pracował w 5% cyklu pracy przez 10 s.
   2. Wykonaj wyzwanie dla pojazdu (np. sól fizjologiczna) i nagraj odpowiedź.
   3. W razie potrzeby należy wystawić zwierzę na działanie rosnących stężeń substancji badanej poprzez zmianę stężenia w nebulizatorze w stopniach eskalacji (np. podwajanie stężeń). Zapisuj odpowiedź po każdym podaniu.
   4. Pod koniec sesji doświadczalnej, jeśli nie zostanie to wykonane automatycznie, zatrzymaj nagrywanie i wróć do klatki i pomieszczenia dla zwierząt.
8. W razie potrzeby wybierz pozycję Uruchom z menu paska narzędzi, aby uruchomić inną sesję eksperymentalną.
   1. Pomiędzy sesjami wyczyść komory pletyzmografu i przepłucz nebulizator wodą.
      nuta: Użycie alkoholu może spowodować nieodwracalne uszkodzenie pletyzmografu.
9. Jeśli badanie obejmuje wielokrotne oceny w czasie, powtórz całą sekwencję pomiarową w każdym wybranym punkcie czasowym.
   nuta: Rozsądnie zaleca się uzupełnienie badania o kilka precyzyjnych pomiarów mechaniki oddechu i/lub objętości płuc^1,15.

3. Analiza danych

Uwaga: Oprogramowanie automatycznie zapisuje plik eksperymentalny i eksportuje zarejestrowane parametry po zamknięciu sesji eksperymentalnej.

1. Obliczyć średnią wyjściową dla parametrów będących przedmiotem zainteresowania dla każdego zwierzęcia i grupy doświadczalnej.
   Uwaga: W tabeli 1 wymieniono szereg typowych parametrów, podzielonych na kategorie w zależności od rodzaju dostarczanych przez nie informacji.
2. W stosownych przypadkach należy ocenić wpływ badanej substancji w aerozolu na parametry będące przedmiotem zainteresowania przy każdym stężeniu, przyjmując określony punkt (np. wartość maksymalną lub minimalną), średnią lub pełny przebieg czasowy; można również rozważyć normalizację do wartości wyjściowej.
3. Raportowanie wyników za pomocą grupowania średnich i błędów w formie tabelarycznej lub graficznej. Przeanalizuj wyniki statystycznie.
   Uwaga: W niniejszym badaniu zastosowano dwukierunkowe ANOVA z powtarzanymi pomiarami do oceny wpływu metakoliny, alergenu – roztoczy kurzu domowego (HDM) – i ich interakcji na różne odczyty DCP (sRaw i EF50), a także na różne odczyty FOT (R,_N, G i H), w obu szczepach myszy. Wielokrotne testy porównawcze Sidaka zostały następnie wykorzystane do określenia stężeń metacholiny, przy których myszy alergiczne różnią się od myszy kontrolnych. Te same testy zastosowano do oceny wpływu dni, HDM i ich interakcji na początku badania (tj. przed metacholiną) na odczyty niedrożności dróg oddechowych (sRaw i EF50) oraz wzorca wentylacji (BF, TV, MV i EIP). Korelacje Pearsona wykorzystano do oceny korelacji między sRaw uzyskanym za pomocą DCP a R_N uzyskanym za pomocą FOT. Wszystkie analizy statystyczne i wykresy zostały wykonane przy użyciu alternatywnego standardowego oprogramowania statystycznego (np. GraphPad Prism). P ≤ 0,05 uznano za wystarczające do odrzucenia hipotezy zerowej.

Wyniki

Wyniki wielokrotnych ocen funkcji oddechowych przez DCP, przeprowadzonych w warunkach wyjściowych przez trzy kolejne dni (dni 12, 13 i 14 protokołu zilustrowanego w Rysunek 1) u myszy kontrolnych i alergicznych BALB/c, są pokazane w Rysunek 3. Parametry, które zostały wybrane do oceny wzorca oddychania, obejmowały częstotliwość oddychania (Rysunek 3A), objętość oddechową (Rysunek 3B), minutową wentylację (Rysunek 3C) i przerwę końcowo-wdechową (Rysunek 3D). Parametrami stosowanymi do oceny niedrożności dróg oddechowych były EF50 (Ryc. 3E) i sRaw (Ryc. 3F). Wyniki każdego wybranego parametru były stabilne przez te trzy kolejne dni w obu grupach, bez widocznego efektu spowodowanego zapaleniem alergicznym.

Stopień reakcji na metacholinę był oceniany przez DCP w kolejnych dniach (dni 12, 13 i 14 protokołu zilustrowanego w Rysunek 1) zarówno u myszy kontrolnych, jak i alergicznych BALB/c. Wyniki, pokazane w Rysunek 4, pokazują zmiany w dwóch parametrach, które są wrażliwe na niedrożność dróg oddechowych, a mianowicie sRaw (Rysunek 4A, B i C) oraz EF50 (Rysunek 4D, E i F). Zgodnie z oczekiwaniami, przyrostowe stężenia metacholiny stopniowo zwiększały sRaw i stopniowo zmniejszały EF50. Reakcje te były nasilane przez alergiczne zapalenie zapalne, zwłaszcza przy końcowym badanym stężeniu, co świadczyło o obecności nadreaktywności. Wyniki pokazują również, że przesadny stopień reakcji był ograniczony do pierwszego dnia (dzień 12), ponieważ nie zaobserwowano go podczas dwóch kolejnych ocen (tj. w dniach 13 i 14).

Wyniki oceny mechaniki oddechowej przez FOT, przeprowadzone w ostatnim dniu protokołu eksperymentalnego (dzień 15; Rysunek 1) zarówno u myszy kontrolnych, jak i alergicznych BALB/c, są pokazane na Rysunek 5. Eksperymenty te zostały włączone do badania w celu uzupełnienia ocen DCP. FOT jest uznawany za bardziej precyzyjne podejście do oceny funkcji układu oddechowego². Jedną z jego mocnych stron jest to, że dostarcza informacji topograficznych na temat tego, które miejsca płuc (przewodzące drogi oddechowe kontra obwodowe drogi oddechowe i tkanka płucna) są dotknięte badanymi interwencjami (np. alergen i metacholina). Zalecana metodologia oceny mechaniki oddechowej za pomocą FOT została wcześniej opisana¹. W tym artykule wykorzystano trzy parametry FOT do opisania zmian w mechanice oddychania wywołanych zapaleniem alergicznym i metacholiną. Parametry te obejmowały: opór 1-newtonowski (R_N; Rysunek 5A), parametr, dla którego zmiany wartości głównie odzwierciedlają zmiany w rezystancji dużych przewodzących dróg oddechowych; Tłumienie 2-tkankowe (G; Rysunek 5B), parametr, dla którego zmiany wartości głównie odzwierciedlają zmiany w odporności tkanki; i elastancji 3-tkankowej (H; Rysunek 5C), parametr, dla którego zmiany wartości głównie odzwierciedlają zmiany sztywności tkanki². Zgodnie z oczekiwaniami nastąpił wzrost każdego z tych parametrów w odpowiedzi na przyrostowe stężenia metacholiny. Zgodne z wynikami sRaw i EF50 uzyskanymi za pomocą DCP z poprzedniego dnia (dzień 14; Rysunek 1), zmiany w R_N indukowane przez metacholinę (Rysunek 5A) były porównywalne między kontrolnymi i alergicznymi myszami. W rzeczywistości wartości sRaw w dniu 14 korelowały z wartościami R_N w dniu 15 (Rysunek 5D). Wzrost H indukowany przez metacholinę był również podobny u myszy kontrolnych i alergicznych (Ryc. 5B). Jednak wzrost G wywołany metacholiną był znacznie większy u myszy alergicznych (Ryc. 5C). Wynik ten wskazuje na obecność utrzymującego się fenotypu nadreaktywności u myszy alergicznych w dniu 15, który nie został wykryty w ocenach DCP przeprowadzonych w dwóch poprzednich dniach.

Całe badanie zostało powtórzone na myszach C57BL/6. Wyniki kolejnych ocen DCP sRaw w dniach 12, 13 i 14 protokołu (Rysunek 1) oraz oceny FOT R_N w dniu 15 są pokazane w Rysunek 6. W tym konkretnym szczepie myszy przesadna odpowiedź metacholiny obserwowana u alergicznych myszy utrzymywała się przez trzy kolejne dni (Figura 6A, B i C). Ten nadreaktywny fenotyp został również zobrazowany w FOT w dniu 15 przez wzrost R_N indukowany przez metacholinę, który był bardziej wyraźny u myszy alergicznych (Figura 6E). Były one w wyraźnym kontraście z wynikami uzyskanymi na myszach BALB / c, gdzie postępujący zanik nadwrażliwości nastąpił od 12 do 14 dni (Figura 4), a brak różnicy w indukowanym metacholiną wzroście R_N zaobserwowano w dniu 15 (Figura 5A). Łącznie wyniki te wskazały na zmienny w czasie wpływ alergenu na odpowiedź wywołaną metacholiną między dwoma szczepami myszy. Co ważne, ta różnica w odkształceniu została zobrazowana zarówno przez DCP, jak i FOT. Zgodnie z tym, wartości sRaw zmierzone przez DCP w dniu 14 korelowały z wartościami R_N zmierzonymi przez FOT w dniu 15 (Rysunek 6F), jak zaobserwowano w przypadku myszy BALB/c (Rysunek 5D).

Rysunek 1. Protokoły stosowane w celu wywołania alergicznego zapalenia płuc i oceny stopnia odpowiedzi na metacholinę. Badanie to przeprowadzono na samicach myszy BALB/c i C57BL/6 w wieku od 7 do 9 tygodni. Sekwencja interwencji przeprowadzonych w całym badaniu jest przedstawiona w panelu (A). Połowa myszy została wystawiona na działanie 50 μg ekstraktu z roztoczy kurzu domowego (HDM) donosowo przez 14 kolejnych dni w celu wywołania alergicznego zapalenia płuc. Druga połowa została wystawiona na działanie soli fizjologicznej i wykorzystana jako kontrola. Czynność oddechową oceniano za pomocą dwukomorowej pletyzmografii (DCP) przy trzech różnych okazjach (dni 12, 13 i 14; czarne kółka) po sesji aklimatyzacyjnej (dzień 11; szare kółko), która obejmowała wyzwanie z aerozolowym roztworem soli fizjologicznej. Podczas każdej sesji oceniano wyjściową czynność oddechową i odpowiedź na metacholinę przy użyciu automatycznego protokołu pokazanego w panelu (B). W dniu 15 przeprowadzono inwazyjną ocenę mechaniki oddechowej za pomocą techniki wymuszonej oscylacji (FOT), jak opisano wcześniej¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Reprezentatywne sygnały przepływu ze zdrowej myszy BALB/c. Panele pokazują typowe ślady zapisu uzyskane za pomocą dwukomorowej pletysmografii u myszy kontrolnej w warunkach wyjściowych. Przepływ w klatce piersiowej jest pokazany w górnym panelu, a przepływ przez nos jest pokazany w dolnym panelu. Wartości ujemne występują podczas wdechu, a wartości dodatnie podczas wygaśnięcia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Wielokrotne oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy BALB/c. Wyjściową funkcję oddechową oceniano za pomocą dwukomorowej pletyzmografii (DCP) u myszy kontrolnych (symbole otwarte) i alergicznych (symbole stałe) w dniach 12, 13 i 14 protokołu zilustrowanego na Rysunek 1. Parametry DCP stosowane do oceny funkcji oddechowej obejmowały częstotliwość oddychania w (A), objętość oddechową (TV) w (B), minutową wentylację (MV) w (C), końcową przerwę wdechową (EIP) w (D), przepływ w środkowej objętości wydechowej (EF50) w (E) i opór właściwy dróg oddechowych (sRaw) w (F). Wartości częstotliwości oddychania, TV, MV, sRaw i EIP dla każdej myszy były średnimi wartościami zarejestrowanymi w ciągu 1,5 minuty. Wartość EF50 była minimalną wartością uzyskaną w tym okresie rejestracji. Wyniki przedstawiono jako średnie grupowe ± odchylenie standardowe (n=5/grupę). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Test bronchoprowokacji metacholiny u świadomych myszy BALB/c. Reakcję na metacholinę oceniano za pomocą dwukomorowej pletysmografii (DCP) u myszy kontrolnych (symbole otwarte) i alergicznych (symbole stałe) w dniach 12, 13 i 14 protokołu zilustrowanego na Rysunek 1. Parametry DCP użyte do oceny odpowiedzi obejmowały swoisty opór dróg oddechowych (sRaw) w (A) do (C) i przepływ w śródoddechowej objętości wydechowej (EF50) w (D) do (F). Bronchoprowokację przeprowadzono poprzez aerozolowanie metacholiny w komorze głowicy DCP przez 10 s w stężeniach przyrostowych. Odpowiedź była monitorowana przez 1,5 minuty po każdym stężeniu. Wartość sRaw dla każdej myszy przy każdym stężeniu była średnią wartością zarejestrowaną w ciągu 1,5 minuty. Wartość EF50 była minimalną wartością uzyskaną w tym okresie rejestracji. Wyniki przedstawiono jako średnie grupowe ± odchylenie standardowe (n=5/grupę). Symbol gwiazdki * oznacza statystycznie istotną różnicę (p 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Inwazyjna ocena mechaniki oddechowej u myszy BALB/c. Mechanikę oddechową na początku badania i w odpowiedzi na metacholinę oceniano za pomocą techniki wymuszonej oscylacji (FOT) w dniu 15 protokołu zilustrowanego na Rycina 1. Myszy kontrolne (symbole otwarte) i alergiczne (symbole stałe) były takie same, jak te testowane za pomocą dwukomorowej pletyzmografii (DCP) w dniach 12, 13 i 14. Parametrami stosowanymi do oceny mechaniki oddechowej były: opór newtonowski (R_N) w (A), elastyczność tkanek (H) w (B) i tłumienie tkanek (G) w (C). Bronchoprowokację przeprowadzono poprzez nebulizację przyrostowych stężeń metacholiny bezpośrednio do rurki dotchawiczej znieczulonych, tracheotomizowanych, sparaliżowanych i mechanicznie wentylowanych myszy w pozycji leżącej. Odpowiedź była monitorowana przez 5 minut po każdym stężeniu. Wartość każdego parametru dla każdej myszy przy każdym stężeniu była wartością szczytową uzyskaną w tym okresie rejestrowania. Wyniki przedstawiono jako średnie grupowe ± odchylenie standardowe (n=5/grupę). Panel (D) pokazuje korelację między specyficznym oporem dróg oddechowych (sRaw) mierzonym przez DCP w 14. dniu a R_N mierzonym przez FOT w 15. dniu. Otwarte symbole reprezentują wartości na linii bazowej, a symbole ciągłe reprezentują maksymalne wartości przy najwyższym stężeniu metacholiny testowanym dla myszy kontrolnych (kółka) lub alergicznych (kwadraty). Wstawka pokazuje współczynnik determinacji (r²). Symbol gwiazdki * oznacza różnicę istotną statystycznie (p ≤ 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Funkcja oddechowa i inwazyjna mechanika oddechowa u myszy C57BL/6. Specyficzny opór dróg oddechowych (sRaw) oceniano za pomocą dwukomorowej pletyzmografii (DCP) na początku badania oraz w odpowiedzi na metacholinę u myszy kontrolnych (symbole otwarte) i alergicznych (symbole stałe) w dniach 12 (A), 13 (B) i 14 (C) protokołu zilustrowanego na Rysunek 1. Oporność newtonowską (R_N) na początku badania i w odpowiedzi na metacholinę oceniano za pomocą techniki wymuszonej oscylacji (FOT) w dniu 15 (D). Bronchoprowokacje zostały przeprowadzone zgodnie z opisem w Rysunek 4 i Rysunek 5 odpowiednio dla DCP i FOT. Wyniki przedstawiono jako średnie grupowe ± odchylenie standardowe (n=5/grupę). Panel (E) pokazuje korelację między sRaw mierzonym przez DCP w dniu 14 a R_N mierzonym przez FOT w dniu 15. Otwarte symbole reprezentują wartości na linii bazowej, a symbole ciągłe reprezentują maksymalne wartości przy najwyższym stężeniu metacholiny testowanym dla myszy kontrolnych (kółka) lub alergicznych (kwadraty). Wstawka pokazuje współczynnik determinacji (r²). Symbol gwiazdki * oznacza różnicę istotną statystycznie (p ≤ 0,05). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

T powiedział:

parametr	jednostka	opis	informacja
Z	Uderzenia na minutę	Częstotliwość oddychania	Wzór wentylacji
telewizja	Ml	Objętość oddechowa
Mv	Ml	Wentylacja minutowa
Ti	Ms	Czas wdechu
Te	Ms	Czas wydechu
Pif	ml/s	Szczytowy przepływ wdechowy
Ślad środowiskowy	ml/s	Szczytowy przepływ wydechowy
Ev	Ml	Objętość wydechowa
NTV (Biblioteka NTV	Ml	Objętość oddechowa nosa
Nev	Ml	Objętość wydechowa nosa
EIP (Europejskie Partnerstwo	Ms	Zakończ pauzę wdechową
EEP (Partia Lud	Ms	Zakończ pauzę wydechową
Dt	Ms	Opóźnienie czasowe	Przeszkoda w przepływie powietrza
sSurowy	cmH2O·s	Opór właściwy dróg oddechowych
sGaw powiedział:	1/cmH2O·s	Właściwe przewodnictwo dróg oddechowych
EF50	ml/s	Przepływ w połowie objętości wydechowej
Sr	%	Wskaźnik sukcesu	Kontrola jakości
N		Liczba ważnych oddechów

Tabela 1. Lista typowych parametrów uzyskanych z dwukomorowej pletyzmografii. Parametry zostały pogrupowane ze względu na charakter informacji, które dostarczają podczas oceny funkcji oddechowej.

Zalety	Ograniczenia
· Świadome zwierzęta	· Konieczność kontroli otaczającego środowiska
· Dokładne parametry wentylacji	· Wcześniejsza aklimatyzacja zwierząt
· Niekwestionowane wskaźniki niedrożności przepływu powietrza (sRaw, EF50)	· Wymóg hermetycznego oddzielenia przepływu przez nos i klatkę piersiową
· Możliwość dostosowania do różnych gatunków i rozmiarów zwierząt	· Zmienność wartości bezwzględnej dla niektórych parametrów wynikowych
· Używany w wielu zastosowaniach badawczych	sRaw nie jest prawdziwym pomiarem rezystancji
· Prosta technika	· Obecność górnych dróg oddechowych
· Wrażliwy na zmiany	· Uzupełnienie pomiarów o ocenę inwazyjną

Tabela 2. Lista zalet i ograniczeń związanych z pletyzmografią dwukomorową.

	Pletyzmografia dwukomorowa	Technika wymuszonej oscylacji
Stan świadomości zwierzęcia	Niezmieniony	Znieczulony (i zwykle sparaliżowany)
Pozycja zwierzęcia	uczciwy	Pozycji leżącej
Dostępność dla zwierząt	Zamknięty w komorze	dostępny
Integracja zwierząt z urządzeniem pomiarowym	Uszczelka nosa lub szyi	Tracheotomia lub intubacja doustna
Drzewo dróg oddechowych zwierzęcia	nienaruszony	Częściowe – z wyłączeniem górnego odcinka dróg oddechowych (tj. przewodów nosowych, gardła i krtani)
Objętość płuc, przy której uzyskuje się parametry końcowe	Zmienna - spontaniczna objętość przyjęta przez zwierzę	Standaryzacja - za pomocą kontrolowanych manewrów rekrutacyjnych i dodatniego ciśnienia końcowo-wydechowego.
Częstotliwość, z jaką oceniane są parametry wyniku	Zmienna - spontaniczna częstotliwość oddychania przyjmowana przez zwierzę	Sterowany - za pomocą predefiniowanych przebiegów na określonych częstotliwościach
Udział górnego odcinka dróg oddechowych w parametrach końcowych	Do nawidzenia	Obchodzone
Miejsce podania aerozolu	Wnętrze komory głowicy	Bezpośrednio w tchawicy
Wpływ górnego odcinka dróg oddechowych na wziewny wzorzec osadzania się dawki	Do nawidzenia	Zapobiec
Zdolność do wykrywania zmian - na podstawie wyników niniejszego badania	Obserwowane	Obserwowane
Nieodłączna zmienność techniki - na podstawie wyników niniejszego badania	Wahania współczynnika zmienności dla sRaw na początku badania: 7,5 - 20,6%	Wahania współczynnika zmienności dla RN na początku badania: 3,6 - 13,4%

Tabela 3. Porównanie dwukomorowej pletyzmografii z technikami wymuszonej oscylacji.

Dyskusja

Możliwość pomiaru czynności płuc u przytomnych zwierząt jest wyraźnie uzasadniona w badaniach nad układem oddechowym. Ogólnie rzecz biorąc, DCP jest interesującym podejściem do oceny funkcji wentylacji układu oddechowego u zwierząt przytomnych i oddychających^{spontanicznie 26}. Dokładniej rzecz ujmując, DCP lub jego wariant head-out często zapewnia właściwą równowagę między jakością dostarczanych informacji a pożądanym poziomem inwazyjności³ (Tabela 2). Technika ta może być dostosowana do różnych gatunków (np. myszy, szczura, świnki morskiej) lub wielkości zwierząt i może być wykorzystywana w wielu zastosowaniach badawczych. Jest to szczególnie przydatne do oceny wielu zwierząt jednocześnie w ramach równoległego badania, do monitorowania funkcji oddechowych w powtarzalny sposób oraz do uchwycenia kinetyki reakcji w czasie. Ponadto technika jest prosta i można się jej nauczyć w stosunkowo krótkim czasie. W niniejszym artykule jako przykład wykorzystano protokół wykorzystujący pomiary DCP u myszy w celu opisania praktycznych aspektów tej powściągliwej techniki pletyzmografii, a także w celu omówienia krytycznych kroków i związanych z nimi wyników.

Podczas pracy ze zwierzętami przytomnymi konieczne jest kontrolowanie warunków otoczenia (np. ciche pomieszczenie z ograniczoną liczbą osób lub aktywnością) w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Ponieważ krępujące są dostępne w różnych wymiarach, ważne jest, aby zacząć od odpowiedniego rozmiaru, aby ruchy oddechowe były niezakłócone. Jest to również pomocne i często wymagane w celu przyzwyczajenia zwierząt do warunków i procedur doświadczalnych, ponieważ u myszy dobrze wiadomo, że krępowanie wpływa na częstotliwość oddychania¹². W zależności od projektu eksperymentu lub warunków może być potrzebnych wiele sesji o przyrostowym czasie trwania. Wreszcie, danie zwierzętom czasu na rozpoczęcie eksperymentu na dostosowanie się do zmiany pomieszczenia i niezbędnego obchodzenia się z nim jest prostym czynnikiem, który okazał się skuteczny w zapewnieniu, że wzorzec oddychania jest konsekwentnie regularny i zrelaksowany na początku badania. Praca w warunkach, w których zwierzęta czują się komfortowo, są dobrze przystosowane i spokojne, będzie również korzystna pod względem zmienności wyników i jakości. Ogranicza również wywołane stresem uwalnianie katecholaminy, która może zwiększać kaliber dróg oddechowych i łagodzić wywołane zwężenie oskrzeli.

Ważne jest, aby zrozumieć, że istnieje potrzeba jak najbardziej hermetycznego oddzielenia przepływów przez nos i klatkę piersiową. W zależności od badanego systemu lub gatunku, mechanizm uszczelniający może różnić się kształtem, a także skutecznością. W DCP, który opisaliśmy w niniejszym dokumencie, pieczęć powstaje między pyskiem zwierzęcia a urządzeniem krępującym. Podczas oceny funkcji oddechowej za pomocą DCP konieczne jest również zapewnienie wystarczającego i ciągłego przepływu odchylenia, ponieważ spadek poziomu tlenu dostępnego dla zwierzęcia spowoduje znaczące efekty. Uwzględnienie dobrostanu zwierzęcia w unieruchomieniu ogranicza skłonność do wycieków powietrza powstałych w wyniku pobudzenia, a tym samym maksymalizuje jakość danych. Z drugiej strony, złamanie pieczęci spowoduje albo odrzucenie zestawów danych, albo niedoszacowanie niektórych parametrów.

Oprócz umożliwienia oddzielnego rejestrowania sygnału przepływu przez nos, komora głowy jest zwykle używana do wystawiania zwierzęcia na działanie substancji w aerozolu. Jak pokazano w tym artykule, można to wykorzystać do przeprowadzenia testu bronchoprowokacji, aby wykazać różne stopnie reakcji. W takich eksperymentach może być konieczne dostosowanie zakresu badanych stężeń w zależności od gatunku, szczepu lub płci badanych zwierząt. Jak wykazano wcześniej 8,9,10,27, obecne wyniki pokazują, że zmiany w sRaw wywołane metacholiną dobrze korelowały z inwazyjnymi pomiarami FOT oporu dróg oddechowych. Wyniki pokazują również, że technika DCP nie jest tak czuła jak FOT ze względu na jej zdolność do wykrywania dysfunkcji oddechowej i identyfikowania zmienionej odpowiedzi zlokalizowanej w dolnych przedziałach płuc (tkance płucnej i/lub małych obwodowych drogach oddechowych). Ponieważ drogi oddechowe zwierzęcia są nienaruszone, obecność górnych dróg oddechowych, które odpowiadają za największą część całkowitego oporu oddechowego wobec przepływu powietrza²⁸, może wpływać na rozprowadzanie i osadzanie aerozolu, a także tłumić wkład dolnych dróg oddechowych w pomiar. Tabela 3 podsumowuje inne różnice między techniką DCP a FOT. Wreszcie, chociaż teoretycznie możliwe byłoby oszacowanie całkowitego oporu dróg oddechowych zwierzęcia (w tym górnych dróg oddechowych) na podstawie pomiaru sRaw, ogólnie zaleca się uzupełnienie oceny DCP inwazyjną techniką pomiaru, taką jak FOT²⁹, w celu uzyskania bezpośrednich pomiarów szczegółowej mechaniki układu oddechowego. W zależności od celów badania można również rozważyć pomiary oporu górnych dróg oddechowych 30,31,32.

Konkluzja
Ze względu na ograniczony stopień inwazyjności, DCP jest techniką, która może zaspokoić ważną potrzebę w badaniach nad układem oddechowym. Jest w stanie zapewnić dokładne odczyty wzorca wentylacji u przytomnych zwierząt przy jednoczesnym niekwestionowanym wskaźniku niedrożności przepływu powietrza. Uzyskane informacje uzupełniają również informacje uzyskane w przypadku bardziej inwazyjnych podejść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek acetylo-β-metylocholiny	Sigma-Aldrich	A-2251	fosforanem metacholiny
	Multicell	311-506-CL	PBS 10X
Ekstrakt z roztoczy kurzu domowego	GREER	290902	HDM
Kompletny system DCP	SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES
oprogramowanie iox	SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES
Aerogen Aeroneb nebulizator	SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES
kompletny system flexiVent FX	SCIREQ Inc. /emka TECHNOLOGIES