Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez macierze przeciwciał

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57779

⸱

19 września 2018

 ,  ,  ,  , 
1Lawrence J. Ellison Institute for Transformative Medicine, Center for Applied Molecular Medicine, University of Southern California

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dla macierzy przeciwciał do identyfikacji zmian w szlakach sygnałowych w różnych modelach komórkowych. Zmiany te, spowodowane przez leki/niedotlenienie/światło ultrafioletowe/promieniowanie lub przez nadekspresję/regulację w dół/nokauty, są ważne dla różnych modeli choroby i mogą wskazywać, czy terapia będzie skuteczna lub czy mogą zidentyfikować mechanizmy oporności na leki.

Streszczenie

Pacjenci z rakiem z nieprawidłową regulacją sieci fosforylacji białek są często leczeni inhibitorami kinazy tyrozynowej. Częste są wskaźniki odpowiedzi zbliżające się do 85%. Niestety, pacjenci często stają się oporni na leczenie poprzez zmianę szlaków transdukcji sygnału. Implementacja profilowania ekspresji za pomocą mikromacierzy może zidentyfikować ogólne zmiany na poziomie mRNA, a proteomika może zidentyfikować ogólne zmiany poziomów białek lub może zidentyfikować zaangażowane białka, ale aktywność szlaków transdukcji sygnału można ustalić tylko poprzez badanie potranslacyjnych modyfikacji białek. W rezultacie, zdolność do określenia, czy leczenie farmakologiczne jest skuteczne, czy też powstała oporność, lub zdolność do scharakteryzowania wszelkich zmian w szlakach sygnałowych, jest ważnym wyzwaniem klinicznym. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe wyjaśnienie macierzy przeciwciał jako narzędzia, które może identyfikować ogólnosystemowe zmiany w różnych modyfikacjach potranslacyjnych (np. fosforylacji). Jedną z zalet stosowania macierzy przeciwciał jest ich dostępność (macierz nie wymaga ani eksperta w dziedzinie proteomiki, ani kosztownego sprzętu) oraz szybkość. Podstawowym ograniczeniem jest dostępność macierzy ukierunkowanych na kombinację modyfikacji potranslacyjnych. Ponadto bezstronne podejścia (fosfoproteomika) mogą być bardziej odpowiednie dla nowego odkrycia, podczas gdy macierze przeciwciał są idealne dla najszerzej scharakteryzowanych celów.

Wprowadzenie

Kliniczna implementacja docelowych inhibitorów kinazy tyrozynowej (TKI) zmieniła leczenie raka, dostarczając lekarzom skutecznych narzędzi do celowania w specyficzne białka, które napędzają transformację nowotworową. Związki te hamują lub blokują fosforylację białek docelowych przez kinazy tyrozynowe1,2. TKI zostały opracowane częściowo dlatego, że zmiany genetyczne w różnych kluczowych genach sygnalizacyjnych są wystarczające do napędzania inicjacji i progresji raka [np. receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), protoonkogenu kinaza tyrozynowo-białkowa Src (SRC), BCR-ABL i receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2)]3,4. Wpływ TKI na cykl komórkowy 5 i molekularne szlaki sygnałowe6 reprezentuje transformację od leczenia raka nieukierunkowanego do molekularnie sterowanego. Kluczową zaletą TKI w porównaniu z chemioterapią jest zwiększony odsetek odpowiedzi i mniejsze ryzyko toksyczności dla zdrowych komórek7. W związku z tym coraz więcej uwagi poświęca się badaniom i rozwojowi nowatorskich TKI.

Dostęp do wyników sekwencjonowania genomu rozpoczął się od Human Genome Project8,9,10 i trwa do dziś z różnymi próbami sekwencjonowania raka nowej generacji (NextGen) [np. The Cancer Genome Atlas (TCGA)11,12]. Zainspirowało to wiele metodologii eksperymentalnych, które dostarczają jednoczesnych informacji o tysiącach genów i/lub dostarczają bezstronnych migawek genów lub białek modulowanych przez perturbacje biologiczne13. Ponieważ regulacja funkcji komórkowej zachodzi na wielu poziomach, od transkrypcji genów po potranslacyjną modyfikację białek i ich aktywności, pełne zrozumienie zdarzeń kontrolujących funkcję komórkową będzie ostatecznie wymagało integracji danych z różnych odczytów biologicznych. Możliwość monitorowania poziomów informacyjnego RNA (mRNA) tysięcy genów z rozdzielczością genów pojedynczej komórki zwiększyła zdolność do wnioskowania o funkcji genu i interakcjach w skali całego genomu. Jednak interpretacja macierzy ekspresji genów zawsze będzie z natury niekompletna bez integracji innych poziomów regulacji, a mianowicie poziomów ekspresji białek, stanów modyfikacji białek i modyfikacji potranslacyjnych białek (fosforylacja, ubikwitylacja, metylacja itp.). W tym miejscu opisujemy użyteczność macierzy przeciwciał jako środków do badania potranslacyjnych modyfikacji ważnych składników sygnalizacyjnych w funkcji różnych warunków w jednym eksperymencie14,15,16.

Matryce przeciwciał fosfologicznych mogą być używane do rozróżniania i analizowania zmian w szlakach transdukcji sygnału16. Mogą one wynikać z modyfikacji genetycznej lub leczenia linii komórkowych inhibitorami kinaz, chemioterapeutykami, stresem spowodowanym niedoborem glukozy, niedotlenieniem lub głodem surowicy. Warto zauważyć, że oporność na leki lub specyficzna regulacja w górę lub w dół genu może również powodować zmiany w szlakach transdukcji sygnału17.

Oporność na leki, na przykład, może wynikać z mutacji docelowego leku, aby uniknąć wrażliwości. W raku płuc znane mutacje EGFR sprawiają, że rak jest niewrażliwy na niektóre TKI, ale bardziej podatny na inne. Alternatywne szlaki sygnałowe mogą być aktywowane po mutacji17. Jako szersze zastosowanie do identyfikacji szlaków transdukcji sygnału zaangażowanych w oporność, niedotlenienie itp., macierze przeciwciał fosfologicznych zapewniają lepszy wgląd w zaangażowane mechanizmy, a co za tym idzie, zrozumienie ich.

Technologie, które pozwalają na ocenę modyfikacji białek, stanowią ważny składnik biologii systemów, ponieważ często pełnią funkcję regulacyjną, taką jak modulowanie aktywności enzymu lub fizycznych interakcji między białkami. Znaczenie modyfikacji potranslacyjnych ilustruje rola fosforylacji białek w prawie wszystkich szlakach transdukcji sygnału wyzwalanych przez zewnątrzkomórkowe18. Tradycyjnie, identyfikacja kinaz lub statusu fosforylacji białek może być również określona za pomocą analizy Western blot, zwłaszcza jeśli badacz jest zainteresowany tylko 1-5 celami. Jednak Western blot jest bardzo selektywny i może być stronniczy w stosunku do wcześniejszej wiedzy, w wyniku czego może przegapić ważne cele. Matryce przeciwciał zapewniają średnioprzepustowy odczyt wielu celów poprzez osadzenie różnych przeciwciał wychwytujących [swoiste dla pan-specyficznej fosforylowanej tyrozyny (tyrozyny), anty-ubikwityna itp.] na stałej matrycy (np. szkle lub nitrocelulozie). Przeciwciała drugorzędowe dostarczają informacji o specyficznych białkach w formacie ELISA opartym na kanapce ( Rysunek 1). Ten test staje się bardziej zaawansowany i trafny, im więcej celów jest przedmiotem zainteresowania lub wcześniejsza wiedza jest ograniczona15. Matryce fosfologiczne mają szersze zastosowanie, ponieważ mogą porównywać fosforylację, a także ogólne ilości białka z szerszej gamy celów w jednym eksperymencie i zapewniają znacznie lepszą kwantyfikację w porównaniu ze spektrometrią mas. Technika ta nie ma zastosowania do identyfikacji nowych lub wcześniej nieznanych miejsc fosforylacji.

Proteomika oparta na spektrometrii mas na dużą skalę może być wykorzystana do identyfikacji specyficznych miejsc fosforylacji białek19. Chociaż technika ta może wyliczyć tysiące zdarzeń potranslacyjnych, wymaga drogiego oprzyrządowania, dedykowanych potoków eksperymentalnych i wiedzy obliczeniowej, które są poza zasięgiem większości badaczy.

Matryce przeciwciał zapewniają jednoczesny odczyt na różnych odczytach białek16. Mogą to być zmiany w ubikwitylacji białek (układ ubikwityny) lub fosforylacji. Kluczową zaletą tej technologii macierzy jest to, że dostarcza ona ważnych informacji zwrotnych na temat stanu biologicznego różnych szlaków biologicznych związanych z ważnymi parametrami komórki (białko 53 kDa, p53, receptorowe kinazy tyrozynowe i szlaki wewnątrzkomórkowe) jednocześnie. Ponadto możliwe jest łączenie różnych typów macierzy w celu zwiększenia penetracji testu (np. apoptoza i ubikwityna oraz fosforylacja). Ta zdolność do łączenia wielu macierzy w celu jednoczesnej oceny różnych zmian potranslacyjnych w kilku próbkach w sposób efektywny czasowo i kosztowo, który nie wymaga specjalnego oprzyrządowania ani specjalistycznej wiedzy, ma istotną zaletę w przypadku macierzy przeciwciał.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekstrakcja białka

  1. Płytka 5 x 106 komórek na 10 mm płytce (lub kolbie) do hodowli tkankowej w kapturze do hodowli tkankowej. Policz komórki w czasie posiewu za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Alternatywnie oszacuj liczbę komórek.
  2. Komórki wyhodowane na płytce (lub kolbie) o średnicy 10 mm dokładnie przepłukać 3x 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (pH = 7,4). Upewnij się, że usunąłeś cały PBS przed dodaniem buforu do lizy.
    UWAGA: Bufor do lizy jest zwykle dostarczany z zestawem. Jeśli nie, należy użyć buforu do oznaczania radioimmunoprecypitacji (RIPA) lub innego buforu do lizy komórek zawierającego koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy.
  3. Lizować 1 x 107 komórek/ml komórek w buforze do lizy, dodając odpowiednią ilość buforu do komórek i zeskrobując komórki za pomocą skrobaka komórkowego do buforu do lizy. (np. w przypadku komórek HeLa i MiaPaCa-2 należy użyć 600 μL na płytkę o średnicy 10 cm).
  4. Pipetować lizat w górę i w dół (około 10x) i przenieść go do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Inkubować lizaty przez 30 minut w temperaturze 4 °C, najlepiej na kołysce/wytrząsarce. Przeciśnij lizat przez strzykawkę z igłą 27 G 10x, aby zapewnić prawidłowe przerwanie błony komórkowej. Alternatywnie, sonikować lizat. Przechowywać lizaty w temperaturze -20 °C lub natychmiast je zużyć.
  6. Odwirować lizat w temperaturze 14 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut i przenieść supernatant do czystej probówki o pojemności 1,5 ml.
  7. Określ ilościowo ilość białka całkowitego za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA)20 lub równoważnego, takiego jak Lowry lub Bradford, i kontynuuj od co najmniej 50–400 μg. Użyj białek natychmiast lub podwielokrotnie i zamroź/przechowuj je w temperaturze -70 °C (unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania).

2. Ludzka matryca fosfokinaz

  1. Przed rozpoczęciem doprowadzić wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej (przez około 1 godzinę).
    UWAGA: Wszystkie odczynniki i plastikowe środki do ścierania znajdują się w zestawie.
  2. Przygotuj wszystkie odczynniki na świeżo (macierzy) przed rozpoczęciem procedury zgodnie z instrukcjami producenta (w zależności od wyboru celów/macierzy instrukcje mogą się nieznacznie różnić).
  3. Rozpuść koktajle przeciwciał wykrywających w 100 μl wody dejonizowanej lub postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, jeśli różnią się one dla dostarczonej probówki o pojemności 1,5 ml.
  4. Przygotuj 1x bufor do płukania, rozcieńczając 40 ml 25x buforu do płukania w 960 ml wody dejonizowanej i wymieszaj je przez odwrócenie.
    UWAGA: Kryształy rozpuszczają się w temperaturze pokojowej. Bufor może z czasem zmienić kolor na żółty, ale nadal będzie działać.
  5. Odpipetować 1 ml buforu macierzowego 1 do każdej studzienki 8-dołkowej tacki wielomiskowej (lub 2 ml w 4-dołkowej tacce wielomiskowej).
  6. Za pomocą pęsety z płaską końcówką usuń membrany tablicy między arkuszami ochronnymi i umieść je w studzienkach. Upewnij się, że cyfry na membranie są skierowane do góry.
    UWAGA: Po zanurzeniu barwnik na membranie zniknie.
  7. Przykryj tacę pokrywką i inkubuj ją na wytrząsarce z platformą kołyszącą przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: To jest etap blokowania membrany.
  8. W okresie inkubacji należy przygotować próbki białka. Dodać 50–100 μg białka ogółem. Rozcieńczyć lizat o maksymalnej objętości 334 μl buforem do lizy do końcowej objętości 1 ml.
    UWAGA: Zwykle wystarcza 50–100 μg białka ogółem.
  9. Ostrożnie zassać bufor matrycowy 1 i inkubować błony z 1 ml próbek przez noc w temperaturze 2–8 °C na wytrząsarce z platformą kołyszącą.
    UWAGA: Nie dotykaj/nie rysuj membran.
  10. Następnego dnia umyj matrycę, ostrożnie wyjmując każdą matrycę i umieszczając ją w oddzielnych plastikowych pojemnikach (około 8 x 11 cm2) z 20 ml 1x buforu do płukania. Umyj membrany 3 x 10 min na bujanej platformie w 1x buforze myjącym w temperaturze pokojowej.
  11. Odpipetować 20 μl odtworzonego koktajlu przeciwciał z kroku 2.3 do 1 ml 1x buforu matrycowego 2. Dodaj 1 ml tego roztworu do każdego 8-dołka, który ma być użyty.
  12. Ostrożnie usuń membrany z tac myjących. Osusz dolną krawędź na ręcznikach papierowych, aby usunąć nadmiar buforu do mycia i przenieś je z powrotem do tacki zawierającej koktajle przeciwciał. Przykryj tacę pokrywką i inkubuj ją przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na bujanej platformie. Zużyte tace należy dokładnie opłukać środkiem dH2O i wysuszyć do późniejszego użycia.
  13. Ostrożnie wyjmij każdą matrycę i umieść ją z powrotem w czystych, pojedynczych plastikowych pojemnikach (około 8 x 11 cm2) z 20 ml 1x buforu do mycia. Myj je 3 x 10 min z buforem myjącym na bujanej platformie w temperaturze pokojowej.
  14. Rozcieńczyć streptawidynę-HRP (dostarczoną z zestawem) lub barwnik fluorescencyjny streptawidyny (dla bardziej ilościowego wykrywania) 1:1,000 w 1x bufor tablicowy 2 w probówce o pojemności 15 ml.
  15. Włóż membrany z powrotem do 8-dołkowych naczyń zawierających roztwór HP i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej na platformie bujanej (jeśli używasz fluorescencji, zawiń tacę w folię aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na światło).
  16. Usuń nadmiar buforu, umieszczając membranę między 2 kawałkami papieru o grubości 5 mm i grubości 3 M. W przypadku obrazowania za pomocą kliszy rentgenowskiej/termoluminescencyjnego należy inkubować wysuszone membrany z roztworem do wykrywania HRP (wymieszać dwa roztwory chemiluminescencyjne 1:1) przez 3 minuty i umieścić membranę w przezroczystym plastikowym ochraniaczu.
    UWAGA: Wysuszone membrany można również umieścić w kamerze fluorescencyjnej w celu wykrycia sygnału fluorescencyjnego; Zminimalizuj ekspozycję światła na membranę przed obrazowaniem. W celu ilościowego określenia kliszy rentgenowskiej lub plików imagera należy unikać prześwietlenia. Większość termoluminescencyjnych/fluorescencyjnych kamer ma funkcję unikania nasycenia sygnału.

3. Analiza danych

  1. Pobierz ImageJ, program do przetwarzania obrazów21 i zainstaluj oprogramowanie.
  2. Otwórz ImageJ, klikając dwukrotnie "Ikonę ImageJ". Wybierz obraz do analizy, klikając "Plik" na pasku menu, a następnie wybierz "Otwórz" z menu rozwijanego i przeglądaj pliki komputerowe w poszukiwaniu interesującego obrazu. Kliknij plik, aby go otworzyć.
  3. Odwróć obraz do analizy (czarne plamy na białym tle do białych plam na czarnym tle), klikając "Edytuj" na pasku menu i wybierając "Odwróć" z menu rozwijanego.
  4. Wybierz "owalną ikonę" z paska narzędzi (druga opcja na pasku narzędzi ImageJ). Narysuj okrąg/owal, klikając na obrazek (krzyżyk) i poruszając myszką. Dostosuj rozmiar/kształt koła/owalu, aby otoczyć kropki na plamie kropkowej.
  5. Kliknij "Analizuj" na pasku menu, a następnie wybierz "Zmierz" z menu rozwijanego, aby automatycznie otworzyć nowe okno z wartościami wybranego obszaru (obszar, średnia, minimum i maksimum).
  6. Przesuń okrągły obszar, przeciągając okrąg od środka (umieść punkt strzałki w prawo pośrodku) i umieść go wokół następnego obszaru pomiaru (kropki). Zmierz wszystkie interesujące miejsca, kontrolę dodatnią, kontrolę ujemną i tło do analizy.
    UWAGA: Kontrola ujemna to PBS, tło to część membrany bez żadnej plamki (każda część się nada), a kontrola pozytywna to kontrola zapewniona przez producenta.
  7. Wybierz punkty kontroli ujemnej PBS i odejmij wartość od każdego miejsca. Uśrednić intensywność dla każdej pary zduplikowanych plamek reprezentujących każdą receptorową kinazę tyrozynową (RTK). Każda średnia intensywność może być powiązana z kontrolą w celu obliczenia zmiany zagięcia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby zbadać wpływ oporności na TKI na szlaki transdukcji sygnału w liniach komórkowych, przeanalizowano cztery próbki. Jedna próbka kontrolna (H3255r1) oraz 3 linie komórkowe oporne na TKI (H3255r2-4) (Rysunek 2) zostały odniesione do szablonu przeciwciał w układzie kropkowym (Rysunek 3). Wszystkie 4 próbki przygotowano zgodnie z niniejszym protokołem. Do demonstracji analizy macierzy przeciwciał wybrano sześć fosfoprotein o zróżn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podejścia, które łączą wiele odczytów biologicznych, są z natury dokładniejszymi reprezentacjami maszynerii komórkowej w przeprowadzonym eksperymencie. Pojawienie się macierzy przeciwciał fosfologicznych umożliwia szybkie scharakteryzowanie wzorca modyfikacji, które może być bardziej pouczające niż status modyfikacji jakiegokolwiek pojedynczego białka. Ogólny przebieg pracy przy stosowaniu macierzy przeciwciał fosfologicznych opiera się na modyfikacji seryny, treoniny lub tyrozyny. W przykładzie tym skupiono się na schar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy wdzięczni za hojne wsparcie finansowe Instytutu Medycyny Transformacyjnej Lawrence'a J. Ellisona z USC (dar dla Davida Agusa). Doceniamy wsparcie Autumn Beemer i Lisy Flashner, które doprowadziły do powstania i publikacji tego manuskryptu. Dziękujemy Laurze Ng za wsparcie administracyjne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odysee SA ImagerLi-Cor BiosciencesFluorescencyjny
1,5 mlEppendorf22363212
Skrobak do komórekFalkon (Corning)353085
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbeco (PBS)Bufor21-031-CVdo ekstrakcji białek
Naczynie do hodowli tkankowej 100 mmTRP93100
ICC Strzykawka insulinowa U100Becton Dickinson32941227 G5/8,  1 ml do igłowego leczenia próbek białek
Białko Profiler TABLICA R& DARY003BLudzka matryca fosfo MAPK
Matryca profilera białek R& DARY002BWirówka z macierzą ludzkiej kinazy fosfonowej
Eppendorf 5430REppendorfWirówka stołowa
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fisher23225
SpectraMAX M2Czytnikabsorbancji do oznaczania ilościowego białek
IRDye 800CW StreptawidynaLi-Cor Biosciences925-32230Konsumat streptawidyny do wykrywania fluorescencyjnego
LabGard ES klasa II, typ A2 komora bezpieczeństwa biologicznegoNuAireNU-425-400Kaptur do hodowli tkanek
TC20 Automatyczny licznik komórekBio-Rad1450102Licznik komórek
Halt Proteaza i Koktajl inhibitorów fosfatazy (100x)Bufor RIPA Thermo Fisher78446
SigmaR0278
Dysmembrator sonicznySonikatorFisher ScientificF60
Wytrząsarka z platformą kołyszącąVWR10860-780
ImageJNIH open sourcehttps://imagej.net/Welcome
SAS Institutie JMP® 12.1.0 (wersja 64-bitowa)Firmy Microsoft
obrazownik płuczący Corning Urządzenia molekularne

Bibliografia

  1. Knauer, D. J., Smith, G. L. Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).
  2. Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src. Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).
  3. Di Fiore, P. P., et al. Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells. Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).
  4. Maguire, H. C., Greene, M. I. The neu (c-erbB-2) oncogene. Seminars in Oncology. 16 (2), 148-155 (1989).
  5. Busse, D., et al. Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity. Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).
  6. Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer. Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).
  7. Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. [Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis]. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).
  8. Dulbecco, R. A turning point in cancer research: sequencing the human genome. Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).
  9. Barinaga, M. DoE provides funds for human genome sequencing. Nature. 331 (6152), 103(1988).
  10. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  11. McCain, J. The cancer genome atlas: new weapon in old war? Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).
  12. Weinstein, J. N., et al. The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project. Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).
  13. Carlson, B. Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials. Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).
  14. Huang, R. P. Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).
  15. Kopf, E., Zharhary, D. Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).
  16. Rani, S., O'Driscoll, L. Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays. Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).
  17. Kani, K., et al. JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).
  18. Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr Signal transduction and the control of gene expression. Science. 295 (5556), 813-818 (2002).
  19. Rikova, K., et al. Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer. Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).
  20. Chen, V. W., et al. Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system. Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).
  21. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  22. Ward, J. H. Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function. Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).
  23. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  24. Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).
  25. Zhou, T., et al. Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays. Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).
  26. McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. Hypoxia, oxidative stress and inflammation. Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Analiza fosforylacjimodyfikacje potranslacyjneoporność na leczenie nowotworówprzygotowanie lizatu białkowegoinkubacja błonyprotokół buforu płuczącegoanaliza przetwarzania obrazu
Ocena oporności na inhibitory kinazy tyrozynowej poprzez badanie szlaków transdukcji sygnału przez macierze przeciwciał
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.