Artykuł metodologiczny

Optogenetyka Identyfikacja typu neuronalnego za pomocą szklanej optrody u obudzonych myszy

DOI:

10.3791/57781

⸱

28 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Kanazawa Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca wprowadza metodę niezawodnego wykonywania optogenetycznego zapisu pojedynczej jednostki z obudzonej myszy za pomocą specjalnie wykonanej szklanej optrody.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To jest główny problem w neurobiologii, jak różne typy neuronów działają w obwodach neuronowych. Ostatnie postępy w optogenetyce umożliwiły identyfikację typu neuronalnego w eksperymentach elektrofizjologicznych in vivo w szerokich obszarach mózgu. W eksperymentach optogenetycznych kluczowe znaczenie ma dostarczenie światła do miejsca rejestracji. Jednak często trudno jest dostarczyć światło stymulujące do głębokich obszarów mózgu z powierzchni mózgu. Szczególnie trudno jest światłu stymulującemu dotrzeć do głębokich obszarów mózgu, gdy przezroczystość optyczna powierzchni mózgu jest niska, jak to często ma miejsce w przypadku nagrań z obudzonych zwierząt. W tym miejscu opisujemy metodę rejestrowania reakcji skoków na światło od obudzonej myszy za pomocą niestandardowej szklanej optrody. W tej metodzie światło jest dostarczane przez szklaną elektrodę rejestrującą, dzięki czemu możliwe jest niezawodne stymulowanie zarejestrowanego neuronu światłem w głębokich obszarach mózgu. Ten wykonany na zamówienie system optrodowy składa się z dostępnych i niedrogich materiałów i jest łatwy w montażu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ośrodkowy układ nerwowy składa się z różnych typów neuronów, które pełnią różne funkcje. To, jak te różne typy neuronów działają w obwodzie neuronalnym, jest jednym z głównych problemów neurobiologii. Jednak w wielu obszarach mózgu niemożliwe było rozróżnienie typów neuronów w nagraniach aktywności elektrycznej in vivo, ponieważ nie ma wyraźnej różnicy w samym sygnale impulsu elektrycznego, z pewnymi wyjątkami. Ostatnie postępy w optogenetyce dokonały przełomu1,2. Wykorzystując transgeniczne zwierzęta, u których światłoczuła opsyna (np. rodopsyna kanałowa-2) ulega ekspresji w określonych typach neuronów, możliwe stało się skuteczne rozróżnienie typów neuronów w nagraniach in vivo3,4,5,6. U tych zwierząt neurony z światłoczułą opsyną są pobudzane przez dostarczanie bodźców świetlnych podczas nagrań elektrycznych, ale inne neurony nie. Neurony opsynowo-dodatnie można zatem łatwo odróżnić od innych typów neuronów na podstawie ich reakcji na światło.

W eksperymentach optogenetycznych kluczowe jest dostarczenie światła do miejsca rejestracji. Jako metoda nieinwazyjna, światło jest często kierowane z powierzchni mózgu. Ponieważ jednak siła światła zmniejsza się, gdy przechodzi przez tkankę mózgową, trudno jest stymulować głębokie obszary mózgu z powierzchni mózgu. Szczególnie trudno jest światłu stymulującemu dotrzeć do głębokich obszarów mózgu, gdy przezroczystość optyczna powierzchni mózgu jest niska, jak to często ma miejsce w przypadku nagrań z obudzonych zwierząt. Eksperymenty elektrofizjologiczne często przeprowadzano na znieczulonych zwierzętach, ponieważ ruch ciała powoduje hałas w nagraniach. Jednak, jak jest dobrze udokumentowane, znieczulenie jest znane z tego, że zmienia reakcje neuronalne7,8,9,10. Dlatego konieczne jest wykorzystanie obudzonych zwierząt w celu zbadania reakcji neuronalnych bez sztucznych efektów znieczulenia. W przeciwieństwie do eksperymentów na zwierzętach znieczulonych, zapisy elektrofizjologiczne są wykonywane po powrocie do zdrowia po operacji w eksperymentach na przytomnych zwierzętach. W przerwie między operacją a nagraniami wysięk tkankowy często gromadzi się na powierzchni mózgu i sprawia, że przezroczystość optyczna powierzchni mózgu jest niska.

Tutaj opisujemy metodę nagrywania pojedynczych nagrań z przebudzonej myszy za pomocą specjalnie wykonanej szklanej optrody. W tej metodzie światło jest dostarczane przez szklaną elektrodę rejestrującą, dzięki czemu możliwe jest niezawodne stymulowanie zarejestrowanego neuronu światłem w głębokich obszarach mózgu. Ten wykonany na zamówienie system optrodowy składa się z dostępnych i niedrogich materiałów i jest łatwy w montażu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z wytycznymi Japońskiego Towarzystwa Fizjologicznego i za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Medycznego Kanazawa.

1. Budowa uchwytu szklanego optrode

UWAGA: Do budowy szklanego uchwytu na optrodę używany jest komercyjny uchwyt elektrody (Rysunek 1A).

  1. Delikatnie wyciągnij stalową rurkę do kontroli ciśnienia z lufy uchwytu.
  2. Wiercąc, poszerz otwór po stronie gniazda sworznia w lufie uchwytu. Wykonaj otwór o średnicy 3 mm i głębokości 12 mm.
  3. Umieść rurę ze stali nierdzewnej (3 mm średnicy, 0,5 mm grubości i 8 mm długości; Rysunek 1A2) w otworze.
  4. Włóż ceramiczną dzieloną tuleję współpracującą do tulejek ⌀2,5 mm (Rysunek 1A1) do otworu.
  5. Przymocuj lufę uchwytu elektrody do wręgu w kształcie litery L za pomocą kleju epoksydowego.
  6. Wykonaj otwory (o średnicy 3 mm) w wrębie i przymocuj go do manipulatora za pomocą.

2. Instalacja słupka czołowego

  1. Przygotuj specjalnie zbudowaną sztycę głowicy wykonaną z przekładki na płytce drukowanej. Za pomocą frezu uformuj kolumnową przekładkę płytki drukowanej w kształt prostopadłościanu i pokrój ją na 2 słupki głowicy za pomocą piły (Rysunek 1B). Spłaszcz dolną część słupka głowicy za pomocą frezu.
  2. Do badania należy przygotować transgeniczne zwierzę, u którego światłoczuła opsyna ulega ekspresji w określonym typie neuronu. W tej pracy wykorzystano transgeniczną mysz (myszy VGAT-ChR2), u której neurony hamujące wyrażają rodopsynę kanałową-2 (ChR2)11.
  3. Znieczulić zwierzę mieszaniną 0,3 mg/kg medetomidyny, 4,0 mg/kg midazolamu i 5,0 mg/kg butorfanolu po podaniu dootrzewnowym. Aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone, przetestuj jego reakcje na szczypanie ogona.
  4. Umieść mysz w stereotaktycznej ramce na poduszce grzewczej. Wcześniej wyczyść ramkę stereotaktyczną i poduszkę grzewczą 70% alkoholem. Umieść zęby w otworze pręta zgryzowego i lekko dokręć zacisk nosowy. Zamocuj obie strony głowy za pomocą nauszników. Gdy głowa jest prawidłowo zamocowana przez nauszniki, dokręć nos clamp. Nałóż maść okulistyczną na oczy.
  5. Ogol skórę głowy małymi nożyczkami i oczyść skórę głowy bawełnianym wacikiem z glukonianu chlorheksydyny. Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne oraz słupek głowy za pomocą autoklawu (121 °C, 15 min).
  6. Przetnij skórę głowy wzdłuż linii środkowej nożyczkami i odsuń ją na bok. Wykonaj nacięcie od tyłu głowy do oczu (około 20 mm). Usuń okostną bawełnianym wacikiem zamoczonym w 70% alkoholu i osusz czaszkę.
  7. Przymocuj słupek głowicy do manipulatora. Umieść słupek głowy płasko na czaszce wokół bregmy za pomocą manipulatora.
  8. Wymieszaj monomer (4 krople), katalizator (1 kropla) i polimer (1 mała łyżka) cementu dentystycznego na małym naczyniu, które jest wcześniej schłodzone w lodówce. Umieść cement dentystyczny (poniżej 1 g) na kości czołowej i ciemieniowej czaszki, aby przymocować słupek głowy do czaszki.
  9. Gdy cement dentystyczny stanie się twardy, wyjmij mysz z ramki stereotaktycznej. Nałóż maść z antybiotykiem na odsłoniętą skórę. Wstrzyknąć antagonistę medetomidyny (0,3 mg/kg) i antybiotyki (oksytetracyklinę; 20 mg/kg). Umieść i monitoruj mysz na poduszce grzewczej w klatce, aż się obudzi, a następnie umieść ją z powrotem w klatce w obudowie.
  10. Zwierzę należy umieścić w indywidualnej klatce z urządzeniem urozmaicającym warunki bytu. Codziennie zmieniaj papierową ściółkę dla zwierząt, aby utrzymać klatkę w czystości i zapobiec infekcji. Uważnie monitoruj, czy zwierzę nie wykazuje żadnych oznak dyskomfortu. Nałóż lidokainę na ranę, jeśli podejrzewasz ból. Podawaj meloksykam lub karprofen raz na 24 godziny przez 48 godzin zarówno po założeniu głowy, jak i operacji kraniotomii. Miejscowa lidokaina może być podawana dodatkowo, jeśli NLPZ nie jest odpowiednia.

3. Aklimatyzacja

  1. Dwa dni (minimum) po wyzdrowieniu ze znieczulenia należy zaaklimatyzować zwierzęta do stanu unieruchomienia głowy w komorze rejestracyjnej. Wykonuj sesje aklimatyzacyjne przez co najmniej 5 dni.
  2. Podczas sesji aklimatyzacyjnych umieść zwierzę w komorze rejestracyjnej z głowicą przymocowaną do specjalnie skonstruowanego zacisku. Podczas sesji, w celu ograniczenia ruchów, przykryj ciało wykonaną na zamówienie połówką rurką z żywicy (Rysunek 1C), wykonaną przy użyciu drukarki 3D.
    UWAGA: W dniu 1 sesja aklimatyzacyjna powinna trwać 5 minut. Następnie zwiększa się go codziennie do 10, 20, 40 i 60 minut odpowiednio przez dni 2, 3, 4 i 5.
  3. Na koniec każdej sesji daj zwierzęciu nagrodę w postaci jedzenia. Jeśli zwierzę ma ciągłe problemy podczas aklimatyzacji, przerwij sesję.

4. Kraniotomia

UWAGA: Po aklimatyzacji, kraniotomia jest wykonywana nad obszarem mózgu w celu nagrania. Kraniotomia wykonywana jest w ramie stereotaktycznej w znieczuleniu, podobnie jak w przypadku montażu słupka głowy. Procedura pooperacyjna jest taka sama, jak w przypadku montażu słupka głównego.

  1. Przed kraniotomią należy oczyścić czaszkę bawełnianym wacikiem z glukonianem chlorheksydyny i 70% alkoholem.
  2. Ostrożnie zeskrob czaszkę nad miejscem nagrania wiertłem dentystycznym. Gdy kość stanie się wystarczająco cienka, przetnij ją czubkiem skalpela i usuń.
  3. Umieść cement dentystyczny wokół odsłoniętego obszaru, aby wzmocnić czaszkę.
  4. Przykryj odsłonięty obszar mózgu klejem silikonowym po tym, jak cement dentystyczny stanie się twardy. Postępowanie pooperacyjne jest zgodne z opisem w kroku 2.8.

5. Zapis elektrofizjologiczny

  1. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez co najmniej 1 dzień po kraniotomii przed wykonaniem zapisu elektrofizjologicznego. Umieść zwierzę w komorze rejestracyjnej w taki sam sposób, w jaki robiono to podczas sesji aklimatyzacyjnych, gdy rozpoczyna się nagrywanie.
  2. Wykonać szklane pipety z kapilar ze szkła borokrzemianowego (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, 90,0 mm długości) ciągniętych na ściągaczu elektrod. Ich średnica końcówki wynosi 2–3 μm, a rezystancja 4–6 MΩ przy napełnieniu 10 mM PBS. Długość elektrody wynosi 40–50 mm. W niektórych nagraniach do 10 mM PBS dodaje się 2% neurobiotyny.
  3. Przymocuj napełnioną szklaną pipetę do specjalnie wykonanego uchwytu optrode.
  4. Włóż srebrny drut z powłoką Ag-Cl (o średnicy 0,2 mm) do szklanej pipety. Podłącz srebrny drut do szpilki za pomocą cienkiego powlekanego przewodu elektrycznego. Podłącz pin do headstage wzmacniacza nagrywającego.
  5. Podłącz patchcord światłowodowy (rdzeń = 960 μm, okładzina = 1 000 μm, NA = 0,63) za pomocą tulejki z tlenku cyrkonu (OD = 2,5 mm) do dzielonej tulei współpracującej na uchwycie optrody. Wsuń krosowy do tulei, aż końcówka tulejki zetknie się z tylną częścią szklanej pipety. krosowy dostarcza światło (długość fali = 465 nm) z diody LED. Światło LED jest sterowane przez jednokanałowy sterownik LED.
  6. Usuń klej silikonowy z kraniotomii. Od czasu do czasu umieszczaj podgrzaną sól fizjologiczną (38 °C) na powierzchni mózgu, aby zapobiec wysuszeniu powierzchni mózgu podczas sesji nagraniowej. W razie potrzeby usuń oponę twardą za pomocą ostrej pęsety.
  7. Włóż szklaną elektrodę do tkanki mózgowej za pomocą manipulatora. Monitoruj rezystancję elektrody po jej włożeniu. Wymień elektrodę, gdy rezystancja jest niższa niż oczekiwano, ponieważ końcówka elektrody może być uszkodzona. Na interesującej nas głębokości przeszukaj i wyizoluj pojedyncze kolce, dostosowując głębokość w krokach co 2 do 5 μm.
  8. Po odizolowaniu pojedynczej jednostki dostarcz światło LED i obserwuj reakcję na bodźce świetlne.
  9. Rejestruj aktywność neuronalną po identyfikacji typów komórek. Wykonuj nagrania przez 2–3 godziny. Jeśli zapis jest wykonywany w kolejnych dniach (maksymalnie 2 dni), kraniotomię należy pokryć klejem silikonowym. Po zakończeniu nagrywania i złożeniu zwierzęcia w ofierze wyjmij sztyft głowy i umieść go w acetonie, aby go umyć i ponownie wykorzystać.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Rysunek 2, zbadaliśmy wpływ rozmiaru końcówki i długości szklanych pipet na moc światła na końcówce pipet (Rysunek 2A-B). Moc światła mierzono za pomocą miernika mocy optycznej umieszczonego w odległości 1 mm od końcówki. Pełna długość była ustawiona na 50 ± 2 mm, gdy zmieniał się rozmiar końcówki, podczas gdy rozmiar końcówki był ustawiony na 2,5 μm, gdy zmieniała się pełna długość. Trzpień szklanej pipety zos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem w neurobiologii. Jest on wykorzystywany do identyfikacji określonych typów neuronów in vivo , a także do manipulowania aktywnością określonych ścieżek neuronalnych. Wyjaśnienie aktywności neuronalnej różnych typów neuronów sprzyja zrozumieniu mechanizmu obwodów neuronalnych. Tutaj zademonstrowaliśmy metodę dostarczania światła do miejsca rejestracji przez szklaną elektrodę w układzie scalonym obudzonych myszy VGAT-ChR2.

Opisana metoda składa ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy byli wspierani przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI Grant JP16K11200 i 17H02223 oraz Grant na Badania z Uniwersytetu Medycznego Kanazawa S2016-8 i C2017-3. Dziękujemy Yuhichi Kudzie za wsparcie w wykonaniu zdjęć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Uchwyt elektrodyUrządzenie molekularne1-HL-Udo wzmacniacza mikroelektrod
Ceramiczna dzielona tuleja współpracującaTuleja ThorlabsADAF1f2,5 mm
Podkładka dystansowa płytki drukowanejTeishin DenkiSPA-320f8,0 mm, długość 20,0 mm
Ramka stereotaktyczna dla myszyNarishigeSR-6M-HTPrzyrządy stereotaktyczne dla myszy
ManipulatorNarishigeNAManipulator ręczny
SuperbondSun MedicalM: 204610557Cement adhezyjny dentystyczny
Drukarka 3DForm2FormlabsNA
Kwik-SilWPIKWIK-SILKlej silikonowy o niskiej toksyczności
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoNarishigeGD-1,5OD 1,5 mm, ID 0,9 mm, długość 90,0 mm
Patchcord światłowodowyDoric LensesMFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5Patchcord monofiberoptic, OD, 2.5 mm, rdzeń = 960 mm, okładzina = 1000 mm, NA = 0.63
Połączonesoczewki LED DoricLEDC-1B_FCDługość fali centralnej = 465 nm, moc wyjściowa = 45 mW (rdzeń 960 mm 0,63 NA)
Sterownik LEDSoczewki DoricLEDRV_1CH_10001-kanałowy sterownik LED, maksymalna moc = 1000 mA
Ściągacz elektrodNarishigePB-7Dwustopniowy ściągacz do mikropipet szklanych
Kapilara ze szkła borokrzemianowegoNarishigeGD-1.5Kapilara ze szkła bolokrzemianowego, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm długości
GENTACINMSD CO., Ltd185711173Maść antybiotykowa
Terramycin®-LAZoetisG 333Oksytetracyklina
Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/JJackson Labs#14548Myszy VGAT-ChR2
Multiclamp 700BUrządzenia molekularne2500-0157Wzmacniacz mikroelektrod
Uchwyt na pipetę

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. Targeting neural circuits. Cell. 165 (3), 524-534 (2016).
  2. Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).
  3. Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties. Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).
  4. Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain. Scientific Reports. 6, 20757(2016).
  5. Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain. Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).
  6. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4 (7), e6099(2009).
  7. Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital. Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).
  8. Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).
  9. Duque, D., Malmierca, M. S. Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects. Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).
  10. Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia. Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).
  11. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  12. Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).
  13. Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).
  14. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  15. Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo. Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).
  16. LeChasseur, Y., et al. A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo. Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).
  17. Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. A 3D glass optrode array for optical neural stimulation. Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).
  18. Bittner, K. C., et al. Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons. Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Identyfikacja neuron wrejestracja elektrofizjologicznawiat owodowy patchcordmocowanie trzpienia g owowegoprocedura kraniotomiikana orodopsyna II VGATrejestracja odpowiedzi impulsowej

Powiązane artykuły