Indukcja i walidacja starzenia się komórek w pierwotnych komórkach ludzkich

Alejandra Hernandez-Segura; Simone Brandenburg; Marco Demaria

doi:10.3791/57782

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indukcja i walidacja starzenia się komórek w pierwotnych komórkach ludzkich

18K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57782

⸱

20 czerwca 2018

Alejandra Hernandez-Segura¹ , Simone Brandenburg¹ , Marco Demaria¹

¹European Research Institute for the Biology of Aging, University of Groningen, University Medical Center Groningen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj omawiamy szereg protokołów do indukcji i walidacji starzenia się komórek w hodowanych komórkach. Skupiamy się na różnych bodźcach wywołujących starzenie i opisujemy kwantyfikację powszechnych markerów związanych ze starzeniem się. Przedstawiamy szczegóły techniczne na przykładzie fibroblastów, ale protokoły można dostosować do różnych modeli komórkowych.

Streszczenie

Starzenie się komórek to stan permanentnego zatrzymania cyklu komórkowego aktywowany w odpowiedzi na różne szkodliwe bodźce. Aktywacja starzenia się komórek jest cechą charakterystyczną różnych stanów patofizjologicznych, w tym supresji guza, przebudowy tkanek i starzenia się. Induktory starzenia się komórek in vivo są nadal słabo scharakteryzowane. Jednak szereg bodźców może być wykorzystywanych do promowania starzenia się komórek ex vivo. Wśród nich najczęstszymi induktorami starzenia się są wyczerpanie replikacyjne, promieniowanie jonizujące i niejonizujące, leki genotoksyczne, stres oksydacyjny oraz środki demetylujące i acetylujące. W tym miejscu przedstawimy szczegółowe instrukcje, jak wykorzystać te bodźce do wywołania starzenia się fibroblastów. Protokół ten można łatwo dostosować do różnych typów komórek pierwotnych i linii komórkowych, w tym komórek rakowych. Opisano również różne metody walidacji indukcji starzenia. W szczególności koncentrujemy się na pomiarze aktywności enzymu lizosomalnego β-galaktozydazy związanej ze starzeniem się (SA-β-gal), szybkości syntezy DNA za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), poziomach ekspresji inhibitorów cyklu komórkowego p16 i p21 oraz ekspresji i wydzielaniu członków fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się (SASP). Na koniec podajemy przykładowe wyniki i omawiamy dalsze zastosowania tych protokołów.

Wprowadzenie

W 1961 roku Hayflick i Moorhead stwierdzili, że pierwotne fibroblasty w kulturze tracą swój potencjał proliferacyjny po kolejnych przejściach¹. Proces ten jest spowodowany sekwencyjnym skracaniem telomerów po każdym podziale komórki. Kiedy telomery osiągają krytycznie krótką długość, są rozpoznawane przez odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR), która aktywuje nieodwracalne zatrzymanie proliferacji - definiowane również jako starzenie replikacyjne. Starzenie replikacyjne jest obecnie jednym z wielu bodźców, o których wiadomo, że wywołują stan trwałego zatrzymania cyklu komórkowego, który sprawia, że komórki stają się niewrażliwe zarówno na mitogeny,....