Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indukcja i walidacja starzenia się komórek w pierwotnych komórkach ludzkich

17.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57782

⸱

20 czerwca 2018

 ,  , 
1European Research Institute for the Biology of Aging, University of Groningen, University Medical Center Groningen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj omawiamy szereg protokołów do indukcji i walidacji starzenia się komórek w hodowanych komórkach. Skupiamy się na różnych bodźcach wywołujących starzenie i opisujemy kwantyfikację powszechnych markerów związanych ze starzeniem się. Przedstawiamy szczegóły techniczne na przykładzie fibroblastów, ale protokoły można dostosować do różnych modeli komórkowych.

Streszczenie

Starzenie się komórek to stan permanentnego zatrzymania cyklu komórkowego aktywowany w odpowiedzi na różne szkodliwe bodźce. Aktywacja starzenia się komórek jest cechą charakterystyczną różnych stanów patofizjologicznych, w tym supresji guza, przebudowy tkanek i starzenia się. Induktory starzenia się komórek in vivo są nadal słabo scharakteryzowane. Jednak szereg bodźców może być wykorzystywanych do promowania starzenia się komórek ex vivo. Wśród nich najczęstszymi induktorami starzenia się są wyczerpanie replikacyjne, promieniowanie jonizujące i niejonizujące, leki genotoksyczne, stres oksydacyjny oraz środki demetylujące i acetylujące. W tym miejscu przedstawimy szczegółowe instrukcje, jak wykorzystać te bodźce do wywołania starzenia się fibroblastów. Protokół ten można łatwo dostosować do różnych typów komórek pierwotnych i linii komórkowych, w tym komórek rakowych. Opisano również różne metody walidacji indukcji starzenia. W szczególności koncentrujemy się na pomiarze aktywności enzymu lizosomalnego β-galaktozydazy związanej ze starzeniem się (SA-β-gal), szybkości syntezy DNA za pomocą testu inkorporacji 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), poziomach ekspresji inhibitorów cyklu komórkowego p16 i p21 oraz ekspresji i wydzielaniu członków fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się (SASP). Na koniec podajemy przykładowe wyniki i omawiamy dalsze zastosowania tych protokołów.

Wprowadzenie

W 1961 roku Hayflick i Moorhead stwierdzili, że pierwotne fibroblasty w kulturze tracą swój potencjał proliferacyjny po kolejnych przejściach1. Proces ten jest spowodowany sekwencyjnym skracaniem telomerów po każdym podziale komórki. Kiedy telomery osiągają krytycznie krótką długość, są rozpoznawane przez odpowiedź na uszkodzenie DNA (DDR), która aktywuje nieodwracalne zatrzymanie proliferacji - definiowane również jako starzenie replikacyjne. Starzenie replikacyjne jest obecnie jednym z wielu bodźców, o których wiadomo, że wywołują stan trwałego zatrzymania cyklu komórkowego, który sprawia, że komórki stają się niewrażliwe zarówno na mitogeny, jak i na sygnały apoptotyczne2,3. Program starzenia się zwykle charakteryzuje się dodatkowymi cechami, w tym wysoką aktywnością lizosomalną, dysfunkcją mitochondriów, zmianami jądrowymi, rearanżacjami chromatyny, stresem retikulum endoplazmatycznego, uszkodzeniem DNA i fenotypem wydzielniczym związanym ze starzeniem się (SASP)3,4. Komórki starcze pełnią w organizmie wiele funkcji: rozwój, gojenie się ran i tłumienie nowotworów2. Wiadomo również, że odgrywają ważną rolę w starzeniu się i, paradoksalnie, w progresji nowotworu5. Negatywne i częściowo sprzeczne skutki starzenia są często przypisywane klasie SASP6.

Ostatnio wykazano, że eliminacja komórek starczych u myszy prowadzi do wydłużenia życia i wyeliminowania wielu cech starzenia7,8,9,10,11,12. W ten sam sposób opracowano wiele leków, które albo eliminują komórki starcze (senolityki), albo celują w SASP13,14. Potencjał terapeutyczny przeciwstarzeniowy przyciągnął ostatnio większą uwagę do tej dziedziny.

Badania mechanizmów związanych ze starzeniem się komórek oraz badania przesiewowe interwencji farmakologicznych w dużym stopniu opierają się na modelach ex vivo, szczególnie na ludzkich pierwotnych fibroblastach. Chociaż istnieją pewne wspólne cechy aktywowane przez różne induktory starzenia, obserwuje się dużą zmienność fenotypu starzenia, która zależy od różnych czynników, w tym typu komórki, bodźca i punktu czasowego3,15,16,17. Konieczne jest uwzględnienie niejednorodności w badaniu i celowaniu w komórki starcze. Dlatego protokół ten ma na celu zapewnienie szeregu metod stosowanych do wywoływania starzenia się pierwotnych fibroblastów poprzez stosowanie różnych metod leczenia. Jak zostanie wyjaśnione, metody te można łatwo dostosować do innych typów komórek.

Oprócz starzenia replikacyjnego, opisujemy pięć innych metod leczenia wywołującego starzenie: promieniowanie jonizujące, promieniowanie ultrafioletowe (UV), doksorubicyna, stres oksydacyjny i zmiany epigenetyczne (mianowicie promowanie acetylacji histonów lub demetylacji DNA). Zarówno promieniowanie jonizujące, jak i promieniowanie UV powodują bezpośrednie uszkodzenie DNA i w odpowiedniej dawce wywołują starzenie się18,19. Doksorubicyna powoduje również starzenie się, głównie poprzez uszkodzenie DNA poprzez interkalację do DNA i zakłócenie funkcji topoizomerazy II, a tym samym zatrzymanie mechanizmów naprawy DNA20. Ekspresja genów niezbędnych do starzenia się jest zwykle kontrolowana przez acetylację histonów i metylację DNA. W konsekwencji inhibitory deacetylazy histonowej (np. maślan sodu i SAHA) oraz środki demetylujące DNA (np. 5-aza) wywołują starzenie się w normalnych komórkach21,22.

Na koniec, cztery najczęstsze markery związane z komórkami starczymi zostaną wyjaśnione: aktywność β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-gal), szybkość syntezy DNA przez test inkorporacji EdU, nadekspresja regulatorów cyklu komórkowego i zależnych od cyklin inhibitorów kinaz p16 i p21 oraz nadekspresja i wydzielanie członków SASP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ogólne przygotowanie

  1. Przygotować podłoże D10. Suplement DMEM medium-Glutamax z 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny (Końcowe stężenie: 100 U/mL).
  2. Przygotuj sterylny PBS. Tabletki należy rozpuścić w wodzie zgodnie z instrukcjami producenta. Sterylizuj w autoklawie.
  3. Przygotuj 1x trypsynę. Rozcieńczyć 5 ml Trypsyny-Versene EDTA/10x 1:10 w 45 ml sterylnego PBS.
    Uwaga: W całym protokole stosujemy warunki hodowli komórek, które są bliższe warunkom fizjologicznym dla pierwotnych fibroblastów. Oznacza to, że inkubujemy komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 , jak to się zwykle robi, ale przy użyciu 5% O2 zamiast "standardowych" 20%O2
    4. .
  4. Ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się w sterylnych warunkach, używając kaptura z przepływem laminarnym, fartucha laboratoryjnego i rękawic. Utrzymuj komórki na poziomie 20%O2 (warunki pokojowe) tylko podczas obsługi.

2. Indukcja starzenia

się
  1. Starzenie replikatywne
    1. Podczas pracy z komórkami lub jakimkolwiek materiałem, który będzie miał z nimi kontakt (pipety, kolby, pożywki itp.) pracuj w sterylnych warunkach, używając kaptura z przepływem laminarnym, fartucha laboratoryjnego i rękawic. Utrzymuj komórki na poziomie 20%O2 (warunki pokojowe) tylko podczas obsługi.
    2. Nasiona 7 x 105 żywotnych fibroblastów pierwotnych w niskiej populacji podwajającej się (PD) w kolbie T75 (~9,3 x 103 komórki/cm2) zawierającej 10 ml D10.
    3. Hoduj komórki w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2 , aż osiągną 70–80% konfluencji (3–4 dni w przypadku rozmnażających się kultur przy niskiej PD).
    4. Odłącz komórki za pomocą 3 ml 1x trypsyny i inkubuj przez ~ 5-7 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2 . Regularnie monitoruj komórki za pomocą mikroskopu do hodowli komórkowych, aby sprawdzić proces odłączania.
    5. Gdy komórki są kuliste, zatrzymaj reakcję trypsyny, dodając 9 ml D10. Nie inkubować dłużej niż 10 minut.
    6. Wiruj komórki w masie 300 x g przez 5 minut. Komórki utworzą osad na dnie probówki, podczas gdy zanieczyszczenia i mniejsze cząstki pozostaną w supernatancie.
    7. Usunąć supernatant i rozpuścić osad komórkowy w 1 ml D10 i przeprowadzić liczenie komórek za pomocą automatycznego licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta lub komory Neubauera do liczenia ręcznego. Podczas liczenia należy dołączyć test sprawdzający żywotność komórek (np. wykluczenie błękitu trypanowego23).
    8. Oblicz skumulowane PD za pomocą tego wzoru:
      PDnowy = 3.32*(LOG(numer komórki ogółem)-(LOG(numer komórki zaszczepiony)) + PDold
      Całkowita liczba komórek = wszystkie policzone komórki: żywe i martwe.
      Liczba obsianych komórek = liczba żywotnych komórek obsianych (8x105 komórek).
      PDstary = podwojenie populacji w momencie wysiewu.
      PDnew = podwojenie populacji w momencie liczenia (po inkubacji).
      UWAGA: Jeśli 7 x 105 pierwotnych fibroblastów (PD 35.2) zostanie wysianych w kolbie T-75 i po 4 dniach osiągną 80% zbieżności i zostaną ponownie podzielone, licząc teraz 1,3 x 106 całkowitych komórek (martwych + żywych).
      PDnowy = 3.32*(LOG(1,300,000 komórek)-LOG(700,000))+35,2
      PDnowy = 36,1
    9. Ponownie zasiej 8 x 105 komórek w nowym T75, powtarzając kroki 2.1.2–2.1.8.
      UWAGA: Po wielu kolejnych pasażach kultura będzie potrzebowała więcej czasu, aby się zlać, aż komórki w ogóle przestaną się dzielić. Gdy komórki przestaną się dzielić, przetestuj markery starzenia i/lub zbierz je do dalszych zastosowań.
    10. Weź pod uwagę, że większy rozmiar komórek starczych może spowodować, że kultura będzie wyglądać na pełną, a mimo to będzie miała niską liczbę komórek. Tak więc starzenie się można założyć, gdy PD jest stabilne, a w kulturze pojawiają się inne markery starzenia (patrz protokoły 3.1–3.5).
      Uwaga: Użyj proliferujących pierwotnych fibroblastów jako kontroli.
  2. Starzenie się wywołane promieniowaniem jonizującym
    1. Podczas pracy z komórkami lub jakimkolwiek materiałem, który będzie miał z nimi kontakt (pipety, kolby, pożywki itp.), należy pracować w sterylnych warunkach, używając kaptura z przepływem laminarnym, fartucha laboratoryjnego i rękawic. Utrzymuj komórki na poziomie 20%O2 (warunki pokojowe) tylko podczas obsługi.
    2. Nasiona: 7 x 105 żywotnych fibroblastów pierwotnych o niskim PD w kolbie T75 (~9,3 x 10,3 komórki/cm2) zawierające 10 ml D10.
    3. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 .
    4. Wystaw ogniwa na działanie 10 odcieni szarego promieniowania gamma zgodnie z instrukcjami używanej maszyny.
    5. Odessać pożywkę z komórek i zastąpić ją 10 ml D10.
    6. Inkubować komórki w 10 ml D10 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5%O2 przez kolejne 10 dni, regularnie wymieniając pożywkę, mniej więcej co 3 dni.
    7. Po 10 dniach przetestuj na obecność markerów starzenia i/lub użyj komórek do dalszych zastosowań.
      UWAGA: Jako kontrolę należy stosować proliferujące fibroblasty pierwotne tego samego PD (przed napromienianiem).
  3. Starzenie się wywołane promieniowaniem ultrafioletowym (UV)
    1. Podczas pracy z komórkami lub jakimkolwiek materiałem, który będzie miał z nimi kontakt (pipety, kolby, pożywki itp.), należy pracować w sterylnych warunkach, używając kaptura z przepływem laminarnym, fartucha laboratoryjnego i rękawic. Utrzymuj komórki na poziomie 20%O2 (warunki pokojowe) tylko podczas obsługi.
    2. Zasiew 1,5–2 x 105 żywotnych fibroblastów pierwotnych w niskiej liczbie PD w jednym dołku płytki 6-dołkowej (1,5–2,0 x 104 komórki/cm2), dodaj 2 ml pożywki D10.
    3. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 i pozostawić im przyleganie do tworzywa sztucznego przez co najmniej 5 godzin.
    4. Zdejmij pożywkę z komórek. Umieść 6-dołkową płytkę na środku komory promieniowania UV i zdejmij plastikową pokrywkę. Naświetlić promieniowaniem UVB, 20–30 mJ/cm2.
    5. Dodaj 2 ml pożywki na dołek.
    6. Inkubować komórki w 2 ml D10 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2 przez kolejne 7 dni, regularnie wymieniając pożywkę, mniej więcej co 3 dni.
      UWAGA: Po 7 dniach komórki można przetestować pod kątem markerów starzenia i wykorzystać do dalszych zastosowań. Użyj proliferujących pierwotnych fibroblastów tego samego PD (przed napromienianiem) jako kontroli.
  4. Starzenie się wywołane doksorubicyną
    1. Przygotować 1 000 x roztwór podstawowy doksorubicyny: Przygotować 250 μM zapasu doksorubicyny w 1x PBS, przefiltrować-wysterylizować roztwór i podaszkować w 500 μl na sterylną probówkę. Przechowywać zapas doksorubicyny w temperaturze -80 °C.
    2. Podczas pracy z komórkami lub jakimkolwiek materiałem, który będzie miał z nimi kontakt (pipety, kolby, pożywki itp.), należy pracować w sterylnych warunkach, używając kaptura z przepływem laminarnym, fartucha laboratoryjnego i rękawic. Utrzymuj komórki na poziomie 20%O2 (warunki pokojowe) tylko podczas obsługi.
    3. Nasiona: 7 x 105 żywotnych fibroblastów pierwotnych o niskim PD w kolbie T75 (~9,3 x 10,3 komórki/cm2) zawierające 10 ml D10.
    4. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 .
    5. Rozcieńczyć 11 μl 1000-krotnego roztworu podstawowego doksorubicyny w 11 ml D10 do końcowego stężenia 250 nM.
    6. Odessać pożywkę z komórek i zastąpić 10 ml D10 + doksorubicyny.
    7. Inkubować komórki dokładnie przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 .
    8. Odessać pożywkę z komórek i ostrożnie przemyć raz 10 ml D10.
    9. Inkubować komórki w 10 ml D10 przez kolejne 6 dni, regularnie wymieniając pożywkę, mniej więcej co 3 dni.
    10. W 7 dniu przetestuj markery starzenia i/lub użyj do dalszych zastosowań.
      UWAGA: Jako kontrolę należy użyć proliferujących pierwotnych fibroblastów tego samego PD leczonych przez 24 godziny nośnikiem (PBS) 1:1,000 w D10.
  5. Starzenie się wywołane stresem oksydacyjnym
    1. Podczas pracy z komórkami lub jakimkolwiek materiałem, który będzie miał z nimi kontakt (pipety, kolby, media itp.), pracuj w sterylnych warunkach, używając kaptura z przepływem laminarnym, fartucha laboratoryjnego i rękawic. Utrzymuj komórki na poziomie 20%O2 (warunki pokojowe) tylko podczas obsługi.
    2. Nasiona: 7 x 105 żywotnych fibroblastów pierwotnych o niskim PD w kolbie T75 (~9,3 x 10,3 komórki/cm2) zawierające 10 ml D10.
    3. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 .
    4. Przygotować roztwór ~200 μM nadtlenku wodoru w pożywce D10, dodając 22,6 μl 30% nadtlenku wodoru do 11 ml D10,
      UWAGA: Zoptymalizuj leczenie dla interesującego typu komórki, wykonując krzywą dawka-odpowiedź w celu oceny toksyczności.
    5. Odessać pożywkę z komórek i dodać 10 ml świeżo przygotowanej pożywki D10 + nadtlenek wodoru. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2
      6. .
    6. Odessać pożywkę z komórek i przemyć raz świeżym D10 bez nadtlenku wodoru.
    7. Dodaj 10 ml D10 bez nadtlenku wodoru.
    8. Inkubować przez 48 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 % O2 .
    9. Powtórz kroki 2.5.4–2.5.8 dwa razy więcej, co daje w sumie trzy zabiegi.
    10. Sprawdź, czy nie ma markerów starzenia lub zbiorów do dalszych zastosowań.
      Uwaga: Jako kontrolę użyj proliferujących komórek tego samego PD potraktowanych 22,6 μl sterylnej wody w D10 przez 2 godziny.
  6. Starzenie się wywołane epigenetycznie
    1. Przygotować roztwory podstawowe i robocze dla małych cząsteczek do użycia zgodnie z tabelą 1. Przefiltruj i wysterylizuj roztwory. Podwielokrotność w sterylnych probówkach. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Podczas pracy z komórkami lub jakimkolwiek materiałem, który będzie miał z nimi kontakt (pipety, kolby, pożywki itp.) pracuj w sterylnych warunkach, na przykład przy użyciu kaptura z przepływem laminarnym, fartucha laboratoryjnego i rękawic. Utrzymuj komórki na poziomie 20%O2 (warunki pokojowe) tylko podczas obsługi.
    3. Nasiona: 7 x 105 żywotnych fibroblastów pierwotnych o niskim PD w kolbie T75 (~9,3 x 10,3 komórki/cm2) zawierające 10 ml D10.
    4. Inkubować komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 .
    5. Przygotuj 11 ml pożywki D10 + roztwór roboczy do pożądanego zabiegu. Dokładne rozcieńczenie dla każdego zabiegu można zobaczyć w Tabeli 1.
      1. Przygotować 11 μl 1 mM roztworu roboczego SAHA w 11 ml D10.
      2. Przygotować 44 μl 1 M roztworu roboczego maślanu sodu w 11 ml D10.
      3. Przygotować 11 μl 10 mM roztworu roboczego 5-aza w 11 ml D10.
        Uwaga: Zoptymalizuj leczenie dla interesującego typu komórki, na przykład poprzez wykonanie krzywej dawka-odpowiedź w celu oceny toksyczności.
    6. Dodaj do kultury pożywkę D10 + roztwór roboczy do pożądanego zabiegu.
    7. Inkubować przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 .
    8. Powtórz kroki 2.6.4–2.6.6 dwa razy więcej, w sumie trzy zabiegi.
    9. Zmień podłoże na proste D10 bez leku.
    10. Po kolejnych 3 dniach komórki stają się starcze i gotowe do testowania markerów starzenia i dalszych zastosowań.
      UWAGA: Jako kontrolę, użyj proliferujących pierwotnych fibroblastów tego samego PD leczonych przez trzy dni pożywką D10 + nośnikiem. Pojazd D10 medium+ musi być odświeżany co 24 godziny w ciągu tych trzech dni. Podłoże zależy od zastosowanej obróbki: 1:1,000 DMSO dla SAHA i 5-aza oraz 1:250 sterylna woda dla maślanu sodu.

3. Markery starzenia

się
  1. preparat
    1. Przygotować 20 mg/ml X-gal: Rozpuścić 20 mg X-gal w 1 ml dimetyloformamidu lub DMSO. Przechowywać w temperaturze -20 °C z dala od światła.
    2. Przygotować 0,1 M roztwór kwasu cytrynowego: Rozpuścić 2,1 g monohydratu kwasu cytrynowego w 100 ml wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować 0,2 M roztwór fosforanu sodu: Rozpuścić 2,84 g dwuzasadowego fosforanu sodu lub 3,56 g odwodnionego fosforanu dwuzasadowego sodu w 100 ml wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    4. Przygotować 0,2 M kwasu cytrynowego/fosforanu sodu o pH 6,0: Rozpuść 36,85 ml 0,1 M roztworu kwasu cytrynowego i 63,15 ml 0,2 M fosforanu sodu. Dostosuj dokładnie do pH 6,0. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    5. Przygotuj 100 mM żelazocyjanku potasu: Rozpuść 2,1 g żelazocyjanku potasu w 50 ml wody. Przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.
    6. Przygotuj 100 mM żelazocyjanku potasu: Rozpuść 1,7 g żelazocyjanku potasu w 50 ml wody. Przechowywać w temperaturze 4 °C z dala od światła.
    7. Przygotować 5 M chlorku sodu: Rozpuścić 14,6 g chlorku sodu w 50 ml wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    8. Przygotuj 1 M chlorek magnezu: Rozpuść 4,8 g chlorku magnezu w 50 ml wody. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    9. Przygotować 2% formaldehydu + 0,2% aldehydu glutarowego w PBS: Rozpuść 800 μl 25% aldehydu glutarowego i 12,5 μl 16% formaldehydu w 100 μl PBS. Przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
    10. Przygotować świeży roztwór barwiący zgodnie z tabelą 2.
  2. Barwienie β-galaktozydazą związane ze starzeniem się
    1. Dla każdej próbki należy zasiać 1 x 104 komórki w co najmniej jednym dołku 24-dołkowej płytki (5,2 x 103 komórki/cm2) zawierającej 500 μl D10, tak aby komórki były rzadkie. Zabiegi (jeśli dotyczy) można wykonać bezpośrednio na tej płytce lub, alternatywnie, komórki już potraktowane mogą zostać ponownie wysiane na płytkę 24-dołkową.
    2. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 .
    3. Umyj komórki dwukrotnie 500 μl PBS.
    4. Utrwal 3-5 minut w temperaturze pokojowej, używając 500 μl/studzienkę 2% formaldehydu + 0,2% aldehydu glutarowego w PBS.
    5. Umyj komórki dwukrotnie 500 μl PBS.
    6. Przygotuj świeży roztwór barwiący, zgodnie z liczbą próbek do barwienia.
    7. Dodać roztwór barwiący (500 μl/studzienkę) i uszczelnić płytkę parafilmem, aby uniknąć parowania.
      UWAGA: Parowanie może powodować tworzenie się kryształów i utrudniać obserwację pod mikroskopem.
    8. Inkubować komórki w ciemności (np. pokryte folią aluminiową) w temperaturze 37 °C w suchym inkubatorze (bez CO2 ) przez 12–16 godz.
      Uwaga: CO2 może wpływać na pH, a tym samym modyfikować wyniki. Niektóre typy komórek mogą wymagać krótszego czasu inkubacji.
    9. Przemyć dwa razy 500 μl PBS.
    10. Oceń wyniki. Komórki dodatnie wykazują niebieskie (przeważnie) barwienie okołojądrowe pod normalnym mikroskopem świetlnym (ryc. 1A).
    11. W celu określenia ilościowego obserwuj co najmniej 100 komórek w próbce i policz liczbę komórek dodatnich. Ponieważ starzejące się komórki zmieniają kształt, często trudno jest określić granice komórek i policzyć komórki. Przeciwbarwienie za pomocą DAPI w celu ułatwienia wizualizacji i kwantyfikacji poszczególnych komórek (rysunek 1B). Określić ilościowo próbki (procent komórek dodatnich w stosunku do całkowitej liczby komórek) za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (ryc. 1C). Zrób wiele zdjęć tej samej próbki, aby na końcu policzyć co najmniej 100 pojedynczych komórek i ocenić procent komórek SA-β-gal-dodatnich w nich.
    12. Porównaj wyniki badań nad komórkami starczymi z ich odpowiednią kontrolą dla zastosowanego leczenia.
      UWAGA: Możliwe jest współbarwienie z EdU na tej samej próbce. Weź pod uwagę, że komórki powinny być następnie wysiewane na szkiełkach nakrywkowych.
  3. Test inkorporacji EdU
    1. Umieścić szkiełko nakrywkowe/studzienkę w płytce 24-dołkowej zgodnie z liczbą próbek do oceny.
    2. Zasiać 1 x 104 komórki w co najmniej jednym dołku 24-dołkowej płytki (5,2 x 103 komórki/cm2) w każdym warunku zawierającym 500 μl D10, tak aby komórki były rzadkie. Zabiegi (jeśli dotyczy) można wykonać bezpośrednio na tej płytce lub, alternatywnie, już poddane działaniu substancji komórki można ponownie zasiać na płytce 24-dołkowej.
    3. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5 %O2 .
    4. Przygotować roztwór EdU o stężeniu 20 μM w D10 (1:250) w zależności od liczby próbek do poddania działaniu substancji (250 μl na próbkę).
    5. Usuń połowę pożywki (250 μl) z każdej studzienki do leczenia i zastąp ją właśnie przygotowanym roztworem D10 + EdU. Końcowe stężenie EdU wynosi 10 μM.
    6. Inkubować 18–24 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 5% O2. Użyj tego samego czasu inkubacji w komórkach kontrolnych i starczych.
    7. Przemyć 2x 500 μL PBS.
    8. Utrwal komórki na 10 minut za pomocą 500 μl 4% formaldehydu w PBS.
    9. Inkubować przez 5 minut w 500 μl 100 mM Tris (pH 7,6).
    10. Przepuszczalność komórek przez 10 minut w 500 μl 0,1% Triton X-100 w PBS.
    11. Umyj 3x PBS.
    12. Przygotować 50 μl mieszanki etykiet dla każdego szkiełka nakrywkowego, dodając składniki w następującej kolejności: 44,45 μl PBS, 0,5 μL Cu(II)SO4, 0,05 μL sulfo-cy3-azydku, 5 μL askorbinianu sodu.
    13. Umieść 50 μL mieszanki etykiet na kawałku parafilmu. Podnieś szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety i igły i pozwól mu spocząć na wierzchu mieszanki etykiet, z powierzchnią zawierającą komórki skierowane w dół. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza i że cała powierzchnia szkiełka nakrywkowego dotyka mieszanki etykiet. Inkubować przez 30 minut w ciemności.
    14. Umieść komórki z powrotem w dołkach 24-dołkowej płytki i umyj je trzykrotnie PBS.
    15. Zamontuj za pomocą mediów montażowych (w tym DAPI do wizualizacji jąder) na szkiełkach podstawowych i pozostaw do wyschnięcia na noc.
    16. Wizualizacja wbudowania EdU za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Stosować filtr odpowiedni dla Cy3 (wzbudzenie/emisja: 552/570 nm).
    17. Wykonaj wiele zdjęć komórek w celu późniejszej kwantyfikacji co najmniej 100 komórek na stan (Cy3 i DAPI).
    18. Określ ilościowo procent komórek, które zawierają EdU, używając następującego wzoru:
      Komórki dodatnie EdU (%) = (liczba komórek dodatnich EdU (Cy3)/całkowita liczba komórek (DAPI)) * 100
    19. Porównaj wyniki badań nad komórkami starczymi z ich odpowiednią kontrolą dla zastosowanego leczenia.
      Uwaga: Możliwe jest współbarwienie SA-β-gal na tej samej próbce. Weź pod uwagę, że komórki powinny być nadal wysiewane na szkiełkach nakrywkowych.
  4. Ekspresja genów p16, p21 i SASP
    1. Przygotuj zestawy starterów genów zainteresowania (50 μM każdy starter).
      UWAGA: qPCR p16, p21 i niektóre istotne czynniki SASP informują o stanie starzenia. Opisany tutaj protokół wykorzystuje system Universal Probe Library (UPL) do względnej kwantyfikacji przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym. Tabela 3 przedstawia przegląd starterów stosowanych do wykrywania inhibitorów CDK p16 i p21 oraz najistotniejszych członków SASP, a także tubuliny i aktyny, które służą jako geny referencyjne w teście. Ostatnia kolumna tabeli 3 zawiera wykaz konkretnej sondy UPL, która ma być używana dla każdego testu.
    2. Przygotować oddzielną mieszaninę reakcyjną qPCR do pożądanych testów. Należy zawsze uwzględnić również gen referencyjny zgodnie z tabelą 4.
    3. Uruchom wszystkie próbki w dwóch lub trzech egzemplarzach.
    4. Załadować 7,5 μl/basenik mieszaniny reakcyjnej qPCR na płytkę 384-dołkową.
    5. Dodać ~5 ng cDNA rozpuszczonego w 2,5 μl wody wolnej od RNaz.
      UWAGA: Zaleca się posiadanie podobnych ilości cDNA dla wszystkich próbek, które mają być porównywane. Można to osiągnąć, używając równych ilości RNA do odwrotnej transkrypcji.
    6. Przykryj płytkę uszczelką i upewnij się, że przylega prawidłowo, równomiernie pokrywając wszystkie dołki na płycie.
    7. Obracaj płytkę o wymiarach 2 000 x g przez 1 min.
    8. Uruchom płytkę w Lightcyclerze na 40 cykli, korzystając z następującego protokołu:
      95 °C przez 7 min
      40 cykli po 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 30 s
      37 °C przez 1 min
    9. Do analizy wyników należy użyć metody zaproponowanej dla Livak i współpracowników do analizy danych qPCR24. Do obliczenia wartości ΔCt należy użyć tubuliny lub aktyny jako genów referencyjnych i użyć odpowiedniej kontroli do obliczenia wartości ΔΔCt dla określonego leczenia wywołującego starzenie.
  5. Ekspresja białek i wydzielanie IL6
    1. Wysiewaj 5–10 x10 4 komórek w co najmniej jednym dołku płytki 6-dołkowej (5,2–10,5 x 103 komórki/cm2) na warunek zawierający 2 ml D10. Zabiegi (jeśli dotyczy) można wykonać bezpośrednio na tej płytce lub, alternatywnie, komórki już potraktowane mogą zostać ponownie wysiane na płytkę 24-dołkową. Odstaw na noc po wysianiu.
    2. Usuń pożywkę i zastąp ją 2 ml pożywki DMEM bez FBS. Inkubować w normalnych warunkach przez 24 godziny.
    3. Zebrać pożywkę do probówki o pojemności 15 ml.
    4. Odwirować próbkę o masie 300 x g przez 5 minut. Pożywkę można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia.
    5. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby przeprowadzić test ELISA.
    6. Porównanie wyników komórek starczych z odpowiednią kontrolą dla konkretnego leczenia indukującego starzenie

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wzmocnienie barwienia SA-β-gal w starzejących się fibroblastach

Ββ-galaktozydaza (β-gal) jest enzymem lizosomalnym, który wykazuje ekspresję we wszystkich komórkach i posiada optimum pH wynoszące 4,025,26Jednakże podczas starzenia się lizosomy zwiększają swoją objętość, co w konsekwencji prowadzi do akumulacji komórek starzejących się β-gal. Zwiększone ilości...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem ludzkich pierwotnych fibroblastów, w szczególności komórek BJ i WI-38. Protokoły starzenia replikacyjnego, promieniowania jonizującego i doksorubicyny zostały z powodzeniem zastosowane do innych typów fibroblastów (HCA2 i IMR90) oraz do innych typów komórek (a mianowicie melanocytów i keratynocytów noworodków lub kardiomiocytów pochodzących z iPSC) w naszym laboratorium. Jednak adaptacje dla dodatkowych typów komórek można zoptymalizować, dostosowując niektóre szc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Demaria za owocne dyskusje, a Thijmenowi van Vlietowi za udostępnienie danych i protokołu na temat starzenia się wywołanego promieniowaniem UV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM Media - GlutaMAXGibco31966-047
Hyklon surowicy bydlęcej płoduSV30160.03
Penicylina-Streptomycyna (P/S; 10 000 U/ml)LonzaDE17-602E
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichSC-202581
Woda wolna od nukleaz (nie poddawana działaniu DEPC)AmbionAM9937
Kolba T75Sarstedt833911002
Roztwór trypsyny/EDTALonzaCC-5012
Tabletki PBSGibco18912-014
Probówki do mikrowirówek 1,5 mlSigma-AldrichT9661-1000EA
Corning  Probówki wirówkowe 15 mlSigma-AldrichCLS430791
6-dołkowa płytkaSarstedt83.3920
24-dołkowa płytkaSarstedt83.3922
Szkiełka nakrywkowe okrągłe 13 mmSarstedt83.1840.002
SteriflipMerck ChemicalsSCGP00525
Cez137-źródłoIBL 637 Cez-137γ-ray maszyna
KomoraOpsytec, Dr. Gö bel BS-02
Dichlorowodorek doksorubicyny BioAustralis Fine ChemicalsBIA-D1202-1
Roztwór nadtlenku wodoruSigma-Aldrich7722-84-1
5-aza-2'-deoksycytydynaSigma-AldrichA3656
SAHASigma-AldrichSML0061
Maślan sodu Sigma-AldrichB5887
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozyd)Fisher Scientific7240-90-6
Kwas cytrynowyjednowodny Sigma-Aldrich5949-29-1
Fosforan dwuzasadowy soduAcros organics7782-85-6
Żelazocyjanek potasu Fisher Scientific14459-95-1
Żelazocyjanek potasuFisher Scientific13746-66-2
Chlorek soduMerck Millipore7647-14-5
Chlorek magnezuFisher Chemicals7791-18-6
25% aldehydu glutarowegoFisher Scientific111-30-8,7732-18-5
16% formaldehydu (w/v)Thermo-Fisher Scientific28908
EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydyna)Lumiprobe10540
Azydek sulfo-cyjaniny3 (Sulfo-Cy3-azydek)LumiprobeD1330
Askorbinian soduSigma-AldrichA4034
Siarczan miedzi(II) pentahydrat (Cu(II)SO4,5H2O)Sigma-Aldrich209198
Triton X-100Acros organics215682500
bazie TRISRoche11814273001
LightCycler 480 Multiwell Plate 384, biały Folia
Lightcycler 480 Sonda Roche4729757001
Sensifast Lo-ROX kit BiolineBIO-84020
Biblioteka sond UPLSigma-AldrichRóżne
ludzkie IL-6 DuoSet ELISAR& DD6050
Bio-Rad TC20Bio-Rad
Szkiełka zliczająceBio-Rad145-0017
Suchy inkubatorThermo-Fisher ScientificHeratherm
DimethylformamideMerck Millipore1.10983
Parafilm 'M' folia laboratoryjnaBemis 
Igły
do pęsety
promieniowania UV uszczelniająca Roche 4729749001 #PM992

Bibliografia

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Muñoz-Espín, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).
  3. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  4. Correia-Melo, C., et al. Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype. The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).
  5. Loaiza, N., Demaria, M. Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key? Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).
  6. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  7. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  8. Xu, M., et al. Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age. Elife. 4, e12997(2015).
  9. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  10. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).
  11. Demaria, M., et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse. Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).
  12. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  13. Soto-Gamez, A., Demaria, M. Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence. Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).
  14. Childs, B. G., et al. Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).
  15. Marthandan, S., et al. Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence. Biological Research. 49, 34(2016).
  16. Marthandan, S., et al. Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq. PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).
  17. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells. Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  18. Le, O. N., et al. Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status. Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).
  19. Hall, J. R., et al. C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint. Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).
  20. Nitiss, J. L. Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy. Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).
  21. Pazolli, E., et al. Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression. Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).
  22. Venturelli, S., et al. Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).
  23. Tennant, J. R. Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability. Transplantation. 2, 685-694 (1964).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase. Aging Cell. 5, 187-195 (2006).
  26. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).
  27. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  28. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  29. Sherr, C. J., McCormick, F. The RB and p53 pathways in cancer. Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).
  30. Bunz, F., et al. Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).
  31. Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo. Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).
  32. Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells. Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).
  33. Blazer, S., et al. High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase. Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).
  34. Wiley, C. D., Campisi, J. From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence. Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).
  35. Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta. Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).
  36. Hypoxia Blagosklonny, M. V. MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence. Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).
  37. Meuter, A., et al. Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).
  38. Coppe, J. P., et al. A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen. PLoS One. 5 (2), e9188(2010).
  39. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  40. Kim, Y. M., et al. Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence. Aging Cell. 12, 622-634 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Indukcja starzeniabarwienie SA beta galtest wbudowywania EdUekspresja p16 i p21analiza SASPpierwotne fibroblastytraktowanie doksorubicynpodwojenie populacjimikroskopia fluorescencyjna
Indukcja i walidacja starzenia się komórek w pierwotnych komórkach ludzkich
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.