Method Article

Śledzenie ekspresji genów poprzez wykrywanie aktywności β-galaktozydazy w całych zarodkach myszy

DOI:

10.3791/57785

⸱

June 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy standardowy protokół wykrywania aktywności β-galaktozydazy we wczesnych zarodkach całych myszy oraz metodę sekcji parafiny i przeciwbarwienia. Jest to łatwa i szybka procedura monitorowania ekspresji genów podczas rozwoju, która może być również stosowana do skrawków tkanek, narządów lub hodowanych komórek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen LacZ Escherichia coli, kodujący β-galaktozydazę, jest głównie używany jako reporter ekspresji genów i jako znacznik w badaniach nad liniami komórkowymi. Klasyczna reakcja histochemiczna opiera się na hydrolizie substratu X-gal w połączeniu z jonami żelaza i żelaza, w wyniku czego powstaje nierozpuszczalny niebieski osad, który jest łatwy do wizualizacji. Dlatego aktywność β-galaktozydazy służy jako marker wzorca ekspresji genu będącego przedmiotem zainteresowania w miarę postępu rozwoju. W tym miejscu opisujemy standardowy protokół wykrywania aktywności β-galaktozydazy we wczesnych całych zarodkach myszy oraz późniejszą metodę cięcia parafiny i barwienia przeciwstawnego. Dodatkowo zapewniona jest procedura klarowania całych zarodków, aby lepiej uwidocznić barwienie X-gal w głębszych obszarach zarodka. Wykonując tę procedurę, uzyskuje się spójne wyniki, chociaż konieczna jest optymalizacja warunków reakcji w celu zminimalizowania aktywności tła. Należy również wziąć pod uwagę ograniczenia w teście, szczególnie w odniesieniu do wielkości zarodka w barwieniu całego wierzchowca. Nasz protokół zapewnia czułą i niezawodną metodę wykrywania β-galaktozydazy podczas rozwoju myszy, która może być dalej stosowana do sekcji kriostatu, a także całych narządów. W ten sposób dynamiczne wzorce ekspresji genów w trakcie rozwoju można łatwo analizować za pomocą tego protokołu w całych zarodkach, ale także szczegółową ekspresję na poziomie komórkowym można ocenić po przekroju parafiny.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby opisać specyficzne wzorce ekspresji genów, użycie genów reporterowych jako markerów było najważniejsze od Drosophila do ssaków. W eksperymentach z udziałem zwierząt transgenicznych i nokautujących, bakteryjny gen β-galaktozydazy (LacZ) Escherichia coli (E. coli) jest jednym z najczęściej stosowanych1,2,3,4. β-galaktozydaza (β-gal) katalizuje hydrolizę β-galaktozydów (takich jak laktoza) do swoich cukrów prostych (glukozy i galaktozy)5. Jego najczęściej stosowanym substratem jest X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozyd), glikozyd, który jest hydrolizowany przez β-galaktozydazę, dając początek 5-bromo-4-chloro-3-hydroksyindolowi i galaktozie. Pierwszy jest utleniany do dimeru, który w połączeniu z żelazocyjankiem potasu i żelazocyjankiem wytwarza charakterystyczny nierozpuszczalny, niebieski osad (Rysunek 1) 6.

Gen LacZ zaczął być używany jako gen reporterowy ponad trzydzieści lat temu7,8. Zazwyczaj LacZ jest wprowadzany za endogennym promotorem w miejsce otwartej ramki odczytu, dzięki czemu może być stosowany w hodowlach bakteryjnych i komórkowych do wizualizacji komórek zawierających określoną insercję, a także u zwierząt transgenicznych jako znacznik endogennych wzorców ekspresji genów podczas rozwoju9. W związku z tym wizualizacja aktywności β-galaktozydazy była szeroko stosowana u Drosophila w celu zrozumienia procesów rozwojowych i komórkowych od pojedynczych komórek do całych tkanek. Genetyka Drosophila sprzyja generowaniu stabilnych linii, w których zmodyfikowany konstrukt elementu P zawierający gen reporterowy LacZ jest wstawiany w losowych miejscach w genomie. Tak więc, gdy jest umieszczony pod wpływem elementów wzmacniających, może napędzać swoją ekspresję w sposób specyficzny dla tkanki, co pozwoliło na systematyczną analizę wzorców ekspresji wielu genów w ciągu ostatnich dwóch dekad10. Ponadto wykorzystanie myszy transgenicznych do monitorowania ekspresji genu LacZ umożliwia również wykrywanie zdarzeń rekombinacji genów za pośrednictwem rekombinacji za pośrednictwem Cre-loxP oraz lokalizację zmutowanych pochodnych embrionalnych komórek macierzystych w analizach chimerycznych11, co ułatwia kontrolę ekspresji LacZ w określonych tkankach, a także czasowo. Ponadto, w całych zarodkach, wykrycie aktywności β-galaktozydazy może powodować zróżnicowane wzorce barwienia o różnej intensywności, które można wygodnie obserwować na różnych etapach rozwoju w celu analizy czasowych zmian w ekspresji genów8,12.

W tym artykule prezentujemy protokół do wizualizacji ekspresji genów poprzez barwienie X-gal w całej tkance wierzchowca we wczesnych stadiach rozwojowych embrionów myszy. Przedstawiamy tę metodę histochemiczną jako bardzo czułą i niedrogą technikę, która sprzyja dokładnemu wykrywaniu znakowanych komórek zarówno w całych próbkach wierzchowców, jak i na poziomie komórkowym po tkankach lub zarodkach zatopionych w parafinie. Metoda pozwala na bezpośrednią wizualizację barwienia w tkance myszy z minimalnym tłem w porównaniu z innymi metodami13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) i Comunidad Autónoma de Madrid, aby zapewnić minimalne cierpienie zwierząt.

1. Pobieranie zarodków od ciężarnych myszy (od E8.5 do E12.5)

  1. Uśmiercać ciężarne myszy przez zwichnięcie szyjki macicy lub wdychanie CO2 . Dzień pierwszego zaobserwowanego czopu pochwowego uznano za dzień embrionalny 0,5 (E0,5).
  2. Połóż zwierzę w pozycji leżącej na podkładce chłonnej i oczyść skórę brzucha myszy 70% etanolem.
    UWAGA: Sterylność nie jest wymagana w kolejnych krokach.
  3. Uszczypnij i unieś skórę brzucha za pomocą kleszczy mysich.
  4. Wykonaj nacięcie przez skórę i ścianę brzucha, 2 do 4 cm pionowo w poprzek linii środkowej brzucha za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  5. Odsłoń brzuch i usuń rogi macicy od matki za pomocą kleszczy, przecinając naczynia krwionośne wzdłuż wewnętrznej krzywizny macicy nożyczkami chirurgicznymi.
  6. Usunąć sznur zarodków i przenieść go na szalkę Petriego na lodzie zawierającą 10 ml lodowatego 0,01 M buforu fosforanowego soli fizjologicznej o pH 7,4 (PBS).
  7. Ostrożnie wypreparuj zarodki z macicy pod mikroskopem stereoskopowym na szalce Petriego z 10 ml świeżego, lodowatego PBS. Chwyć ścianę mięśniową kleszczami zegarmistrzowskimi, aby odsłonić worek owodniowy, a następnie rozerwij błonę owodniową, aby usunąć zamknięty zarodek i woreczek żółtkowy za pomocą końcówek kleszczy.
  8. Zbierz zarodki rodzeństwa z miotu od ciężarnych myszy we wczesnych stadiach (od E8.5 do E12.5) (Rysunek 2).
  9. Przenieś zarodki do świeżego naczynia z 10 ml zimnego 1x PBS za pomocą zakrzywionych kleszczy lub, w przypadku bardzo małych zarodków (E8,5-E9,5), użyj plastikowych pipet transferowych w celu pobrania próbek bez uszkodzenia zarodków.
  10. Przed rozpoczęciem utrwalania należy pobrać próbkę zarodka do probówki mikrowirówkowej w celu genotypowania poprzez wycięcie małego kawałka zarodka lub pobranie błony owodniowej w najmniejszych zarodkach (od E8,5 do E9,5) za pomocą kleszczyków zegarmistrzowskich.
    UWAGA: Genotypowanie LacZ określa się za pomocą starterów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR): do przodu, 5'-ATCGTGGGTGGTTGAACTG-3'; rewers, 5'-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA -3'.

2. Utrwalanie zarodków myszy

  1. Przenieść każdy zarodek do probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml z zaokrągloną podstawą, zawierającej 1 ml 1x PBS.
    UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki opisane w protokole w tych probówkach z mieszaniem za pomocą wytrząsarki na kółkach.
  2. Myj zarodki w 1x PBS przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby wyeliminować pozostałą krew. Użyj plastikowych pipet transferowych, aby zmienić płyny w probówkach.
  3. Utrwal zarodek w 1 ml 0,125% aldehydu glutarowego na lodzie.
    UWAGA: Czas utrwalenia zależy od wielkości zarodka: 20 min dla zarodków E8,5-E9,5, 30 min dla zarodków E10,5 i 1 h dla zarodków E12,5.
  4. Usuń utrwalacz i umyj zarodki w 1x PBS dwa razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej przed przetworzeniem próbki do barwienia X-gal.

3. Cała góra β-galaktozydaza Histochemia zarodków myszy

  1. Przed rozpoczęciem procedury należy przygotować bufor X-Gal Rinse i roztwór do barwienia X-Gal (patrz Tabela 1 i Tabela Materiałów). Użyć zarodków rodzeństwa z miotu typu dzikiego (WT) jako kontroli negatywnej reakcji enzymatycznej.
  2. Inkubować zarodki w buforze X-Gal Rinse przez 10 minut w temperaturze pokojowej (Rysunek 2).
  3. Inkubować zarodki w roztworze barwiącym X-Gal przez 2 godziny do nocy w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem. Okresowo monitoruj reakcję barwną za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aż do momentu zaobserwowania wystarczającej intensywności niebieskiego zabarwienia bez tła w zarodku. Utrzymuj pH roztworu między 8 a 9, aby zmniejszyć tło podczas całego barwienia. Jeśli roztwór barwiący zacznie zmieniać kolor na jasny, zastąp go świeżym roztworem substratu, aby przedłużyć reakcję enzymatyczną.
  4. Zatrzymaj reakcję, gdy pożądany sygnał zostanie uzyskany przez mycie zarodków w probówce mikrowirówkowej z 1 ml 1x PBS dwa razy przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieś barwione zarodki do 1 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w celu ich ponownego utrwalenia, przez 1 godzinę do nocy w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zarodki mogą być przechowywane w 4% PFA/PBS przez dłuższy czas w temperaturze 4 °C lub mogą być natychmiast przetworzone w celu sekcji. Ten ostatni etap utrwalania ma kluczowe znaczenie dla długotrwałej konserwacji wzoru barwienia.
  6. Umyj zarodki w 1 ml 1x PBS dwa razy przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Opcja 1: Usunąć zarodki przez zanurzenie w serii roztworów o rosnącym stężeniu glicerolu (20%, 40%, 60% i 80% glicerolu w 1x PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w każdym roztworze.
    UWAGA: Na tym etapie myj zarodki w 80% glicerolu przez dłuższy czas, nawet dni, aż zostaną usunięte, a następnie przechowuj je w 80% glicerolu w temperaturze 4 °C na tym etapie (Rysunek 2). Zaleca się dodanie bardzo małej ilości azydku sodu lub kryształu tymolu do zarodków przechowywanych w temperaturze 4 °C w glicerolu lub 1x PBS, aby zapobiec rozwojowi pleśni. Po oczyszczeniu, całe zarodki wierzchowca mogą być użyte do fotografowania (krok 4).
  8. Opcja 2: Przetwarzanie zarodków w celu osadzenia parafiny i cięcia za pomocą mikrotomu (Rysunek 2). Udokumentuj wzorzec ekspresji w całych barwionych zarodkach przed sekcją (kroki 4 i 5).

4. Fotografia całych embrionów górskich

  1. Aby sfotografować całe zarodki barwione przed sekcją, przenieś je na szalkę Petriego przygotowaną na podstawie zestalonej 1-2% agarozy w 1x PBS.
  2. Przykryj zarodek całkowicie 10 ml 1x PBS w naczyniach pokrytych agarozą, aby zapobiec odwodnieniu i odbiciu podczas fotografowania przez płyn.
  3. Zorientuj zarodek zanurzony w 1x PBS za pomocą kleszczy. W przypadku starszych zarodków (E10.5-E12.5) należy wykonać mały otwór w agarozie za pomocą kleszczyków, aby umieścić i ustawić w nim próbkę pod różnymi kątami i uniknąć swobodnego unoszenia się podczas fotografowania.
  4. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu stereoskopowego, używając światła przechodzącego (pod stolikiem). Przełączaj się między regulacją "ciemnego pola" i "jasnego pola", aby ustawić żądane oświetlenie podczas fotografowania i zoptymalizować przezroczystość próbki.
    UWAGA: Użyj oświetlenia światłowodowego w przypadku zarodków w późniejszym stadium, aby uniknąć odbicia na powierzchni zarodka. Podczas fotografowania oczyszczonych zarodków postępuj zgodnie z tą samą procedurą, ale przenieś je na szalkę Petriego zawierającą 100% glicerolu i całkowicie je zanurz.

5. Osadzanie parafiny i cięcie zarodków wybarwionych X-galem

  1. Osadzanie wosku parafinowego
    1. Usunąć zarodki barwione X-galem z 4 °C (krok 3.5) i umyć je 1 ml 1x PBS trzy razy, aby usunąć nadmiar utrwalacza.
    2. Przenieś każdy zarodek do kasety histologicznej za pomocą kleszczy.
    3. Umieść kasety zawierające zarodki w zlewce, a następnie odwodnij, przepuszczając je przez serię stopniowanych etanoli w temperaturze pokojowej: 70% etanolu, raz przez 30 minut; 96% etanolu, dwa razy przez 30 minut każda; 100% etanolu, dwa razy po 30 minut każdy.
      UWAGA: Zarodki mogą być przechowywane w 70% etanolu przez nieokreślony czas w temperaturze 4 °C, aż do rozpoczęcia procesu odwodnienia.
    4. Inkubować całą kasetę w izopropanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Za pomocą kleszczy przenieść kasety do szklanego koryta barwiącego zawierającego wstępnie podgrzany izopropanol i pozostawić w suszarce w temperaturze 60 °C na 30 minut.
    6. Umieścić kasety w nowym szklanym korycie barwiącym zawierającym mieszaninę 50% izopropanolu / 50% stopionego wosku parafinowego i pozostawić na 4 godziny w piecu o temperaturze 60 °C.
    7. Inkubować kasety z zarodkami z dwiema przemianami stopionego wosku parafinowego, każda przez 30 minut w temperaturze 60 °C.
    8. Pod koniec końcowego płukania parafiną otwórz kasetę i przenieś każdy zarodek do oddzielnej formy do zatapiania tkanek, aby wyświetlić próbkę pod mikroskopem stereoskopowym.
    9. Napełnij studzienkę stopionym woskiem parafinowym w temperaturze 60 °C. Użyj podgrzewanych kleszczy, aby wosk był stopiony i ostrożnie ustaw zarodek w formie.
      UWAGA: Właściwa orientacja próbki jest krytycznym krokiem do przekroju zarodka w pożądanej płaszczyźnie.
    10. Zanim parafina zastygnie w formie, umieść kasetę bez pokrywki na wierzchu bloku i napełnij ją stopionym woskiem parafinowym. Pozostaw pozostały wosk do ostygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej, aż stężeje.
    11. Gdy parafina całkowicie zastygnie, wyjmij stały blok z formy i przechowuj bloki parafiny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C do momentu przekroju14.
  2. Cięcie parafiny
    1. Ustaw ostrze na mikrotomie i ustaw grubość 5-7 μm. 5.2.2. Schłodzić blok parafiny na lodzie i przyciąć go do sześcianu lub piramidy.
    2. Przymocuj blok do uchwytu mikrotomu, używając niewielkiej ilości stopionego wosku.
    3. Ustaw blok w odpowiedniej orientacji, aby uzyskać optymalne cięcie. Pokrój bloki parafiny na plastry o grubości 5-7 μm w temperaturze pokojowej za pomocą standardowego mikrotomu.
    4. Za pomocą cienkiego pędzla umieść sekcje w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej w celu manipulowania i wybierania plastrów.
    5. Pobrać skrawki z łaźni wodnej za pomocą szkiełka mikroskopowego i przenieść je do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C w celu rozciągnięcia.
    6. Wyjmij skrawki z kąpieli wodnej i delikatnie umieść je na szkiełkach mikroskopu adhezyjnego.
    7. Szkiełka należy dobrze wysuszyć w suszarce w temperaturze 37 °C przez noc, aby sekcje całkowicie przylegały, w przeciwnym razie mogą się zgubić podczas barwienia.
      UWAGA: Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu rozpoczęcia procedur barwienia.
  3. Deparafinowanie i barwienie przeciwstawne skrawków parafiny zabarwionych X-Galem
    1. Umieścić szkiełka podstawowe na tacy mikroskopowej w piekarniku w temperaturze 60 °C na co najmniej 45 minut, aby wosk parafinowy stał się bardziej płynny.
    2. Przenieś szkiełka na stojak i użyj szklanych naczyń do barwienia, aby wykonać następujące czynności: zanurzyć ruszt w słoikach do barwienia zawierających alkohole o malejących stężeniach w celu całkowitego usunięcia parafiny i nawodnienia tkanek: izopropanol na 5 minut w temperaturze 60 °C; izopropanol na 3 minuty; 100% etanol przez 2 minuty; 96% etanol przez 1 minutę; 70% etanol na 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    3. Dwukrotnie opłucz sekcje w wodzie destylowanej, aby upewnić się, że nie ma pozostałości alkoholu.
    4. Skrawki przeciw barwieniu za pomocą barwnika (np. roztworu Nuclear-Fast Red) przez 5 minut (zwykle między 3-8 minutami) w temperaturze pokojowej (Rysunek 2).
      UWAGA: To barwienie pomaga ujawnić ogólną strukturę tkanki w skrawkach.
    5. Po barwieniu umyj szkiełka w wodzie destylowanej przez 1 minutę i sprawdź barwienie przekrojów w mikroskopie.
      UWAGA: Jeśli pożądane zabarwienie jest zbyt słabe, ponownie przeciwbejcuj sekcje przez dłuższy czas.
    6. Sekcje odwadniania w następujących seriach ze wzrostem stężenia etanolu: dwa prania w 95% etanolu przez 2 minuty każde, dwa mycia w 100% etanolu przez 2 minuty każde i, aby uniknąć rozpuszczenia niebieskich osadów, tylko jedno szybkie mycie w ksylenie.
    7. Wyjmij szkiełka ze stojaka jeden po drugim i umieść je na kartce papieru. Następnie zamontuj i nakryj każde szkiełko za pomocą syntetycznego, trwałego podłoża montażowego.
      UWAGA: Ksylen jest produktem łatwopalnym, którego opary są drażniące i szkodliwe dla zdrowia ludzkiego i organizmów wodnych. Musi być manipulowany w kapturze i wymaga użycia odpowiedniego sprzętu ochronnego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy wyniki zastosowania standardowego protokołu dla reakcji histochemicznej β-galaktozydazy przy użyciu X-gal jako substratu w całych zarodkach myszy (Rysunek 1 i Rysunek 2). Korzystając z tego protokołu, badamy ekspresję metaloproteinazy błonowej typu 4-macierzowego (Mt4-mmp) na różnych etapach rozwoju embrionalnego (E9.5, E11.5 i E12.5) przy użyciu zmutowanych myszy Mt4-mmp, które wykazują ekspresję reportera LacZ pod kontro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gen LacZ E. coli jest szeroko stosowany jako reporter w badaniach nad wzorcami ekspresji genów ze względu na jego wysoką czułość i łatwość wykrywania. Niniejszy protokół opisuje klasyczną metodę wykrywania ekspresji β-gal w oparciu o reakcję enzymatyczną, która jest łatwa i szybka do przeprowadzenia, a także niedroga. Metoda ta może być również stosowana bez większych modyfikacji w przypadku całych zarodków, nienaruszonych narządów, skrawków tkanek kriostatu lub hodowanych komórek.

Do...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Służbie Histopatologicznej za pomoc techniczną w Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Dziękujemy również dr Motoharu Seiki za uprzejme dostarczenie myszy Mt4-mmpLacZ oraz dr Alicii G. Arroyo za wsparcie naszego projektu i za jej krytyczne odczytanie manuskryptu. Pragniemy podziękować Peterowi Bonneyowi za korektę tego artykułu. Prace te zostały wsparte przez Universidad Europea de Madrid w formie grantu (#2017UEM01) przyznanego C.S.C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ODCZYNNIKI
2-PropanolSIGMA-ALDRICH24137-1L-R
AgarozaSCHARLAU50004/ LE3Q2014
Wodne mediummontażowe VECTOR LABSH-5501
Syntetyczne media montażoweMERCK100579
96% EtanolPROLABO
99,9% Etanol absolutnySCHARLAUET00021000
50% Roztwór aldehydu glutarowegoSIGMA-ALDRICHG6403-100ml
85% GlicerolMERCK104094
99,9% GlicerolSIGMA-ALDRICHG5516
Sześciowodny chlorek magnezuSIGMA-ALDRICH63064
Niejonowy środek powierzchniowo czynny (Nonidet P-40)SIGMA-ALDRICH542334
Nuclear Fast Red PrzeciwbarwienieSIGMA-ALDRICHN3020
Pastylki parafinoweMERCK111609
ParaformaldehydSIGMA-ALDRICH158127-500g
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (tabletki)SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
Żelazocyjanian potasuMERCK1049840500
Żelazocyjanek potasuMERCK1049731000
Azydek soduSIGMA-ALDRICHS8032
Deoksycholan soduSIGMA-ALDRICH30970
Diwodorofosforan sodu jednowodnySIGMA-ALDRICH106346
Fosforan sodu dwuwodnySIGMA-ALDRICH71638
TymolSIGMA-ALDRICHT0501
Chlorowodorek Tris (Tris HCl)SIGMA-ALDRICH10812846001 (Roche)
X-GALVENN NOVAR-0004-1000
XyleneVWR CHEMICALSVWRC28973.363
EQUIPMENT
Jednorazowe plastikowe krioformy 15x15x5 mmSAKURA4566
Mikrotom rotacyjnyLeicaRM2235
KasetyOxford TradeOT-10-9046
Okulary nakrywkowe do mikroskopu 24x60 mmVWRECN631-1575
Szkiełka mikroskopoweThermo Scientific, MENZEL-GLÄ SERAGAA000001#12E
Szkiełka mikroskopowe adhezyjneThermo Scientific, MENZEL-GLÄ SERJ1820AMNZ
Flotacja Kąpiel wodnaLeicaHI1210
Jednorazowe niskoprofilowe ostrza mikrotomuFeatherUDM-R35
Piec parafinowyJ.R. SELECTA
J.R. SELECTA
StereoskopLeicaDM500
Probówki do mikrowirówek polipropylenowych 2,0 mLSIGMA-ALDRICHT2795
Probówki do mikrowirówek polipropylenowych 1,5 mLSIGMA-ALDRICHT9661
Wytrząsarka oscylacyjnaIKA LabortechnikHS250 BASIC
Mieszadło z płytą grzejnąBibbyHB502
Wytrząsarka wirowaIKA LabortechnikMS1
Waga laboratoryjnaGRAMFH-2000
Waga precyzyjnaSartoriusISO9001
pHhmeterCrisonBasic 20
ŚwiatłowódOptechPL2000
20824365 2000205 Dozownik parafiny do wosku 4000490

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182(1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767(2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797(2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937(2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Beta galactosidase DetectionX gal StainingMouse Embryo AnalysisParaffin SectioningHistochemical AssayGene Expression TracingWhole Mount StainingCell Lineage StudiesEmbryo ClarificationDevelopmental Biology

Related Articles