Method Article

Test pulldown na bazie biotyny do walidacji celów mRNA komórkowych miRNA

DOI:

10.3791/57786

⸱

June 12th, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biotechnology, Kalinga Institute of Industrial Technology University, 21. Center for AIDS Health Disparities Research Department of Biochemistry and Cancer Biology, Meharry Medical College, 3Kalinga Institute of Industrial Technology University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje szybką i niezawodną metodę walidacji celów mRNA komórkowych miRNA. Metoda wykorzystuje syntetyczne biotynylowane miRNA oparte na zablokowanych kwasach nukleinowych (LNA) do wychwytywania docelowego mRNA. Następnie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną są wykorzystywane do ściągania docelowego mRNA w celu ilościowego oznaczania w reakcji łańcuchowej polimerazy qPCR.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) to klasa małych niekodujących RNA, które po transkrypcji regulują ekspresję genów komórkowych. MiRNA wiążą się z nieulegającym translacji regionem 3' (UTR) docelowego mRNA, aby zahamować translację białek lub w niektórych przypadkach spowodować degradację mRNA. Wiązanie miRNA z 3' UTR docelowego mRNA odbywa się za pośrednictwem sekwencji nasiennej 2-8 nukleotydów na końcu 5' miRNA. Chociaż rola miRNA jako komórkowych cząsteczek regulatorowych jest dobrze znana, identyfikacja docelowych mRNA o znaczeniu funkcjonalnym pozostaje wyzwaniem. Narzędzia bioinformatyczne zostały wykorzystane do przewidywania sekwencji w obrębie 3' UTR mRNA jako potencjalnych celów wiązania miRNA. Narzędzia te zostały również wykorzystane do określenia ewolucyjnej ochrony takich sekwencji wśród spokrewnionych gatunków w próbie przewidzenia roli funkcjonalnej. Jednak te metody obliczeniowe często generują wyniki fałszywie dodatnie i ograniczają się do przewidywania kanonicznej interakcji między miRNA i mRNA. Dlatego procedury eksperymentalne, które mierzą bezpośrednie wiązanie miRNA z jego celem mRNA, są niezbędne do ustalenia interakcji funkcjonalnej. W tym raporcie opisujemy czułą metodę walidacji bezpośredniej interakcji między komórkowym miRNA miR-125b a 3' UTR mRNA PARP-1. Opracowujemy protokół, w którym syntetyczne mimiki biotynylowanego miRNA zostały przetransfekowane do komórek ssaków, a kompleks miRNA-mRNA w lizacie komórkowym został ściągnięty w dół za pomocą kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną. Na koniec docelowe mRNA w ściągniętym kompleksie kwasów nukleinowych określono ilościowo przy użyciu strategii opartej na qPCR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) to małe niekodujące RNA, które negatywnie regulują ekspresję białek1. Prekursory miRNA znajdują się w klastrach w wielu regionach genomu, najczęściej w regionach międzygenowych i intronach genów kodujących białka2,3. Biogeneza miRNA obejmuje transkrypcję pri-miRNA z genów kodujących miRNA4. Pri-miRNA przechodzą sekwencyjne przetwarzanie, najpierw w jądrze, a następnie w cytoplazmie w celu wytworzenia jednoniciowych dojrzałych miRNA4,5. Następnie dojrzałe miRNA są włączane do indukowanego RNA kompleksu wyciszającego (RISC): multimerycznego kompleksu białko-RNA, który zawiera członka rodziny białek Argonaute do rozpoznawania celu4,5,6,7. Dojrzałe miRNA w kompleksie RISC głównie wiążą się z 3' UTR docelowych mRNAs8,9,10, ale mogą również czasami wiązać się w kodowaniu i regionie 5'UTR mRNA10,11. Wiązanie miRNA z sekwencjami mRNA powoduje wyciszenie translacyjne12,13,14 i w niektórych przypadkach destabilizację mRNA15. Ponieważ pojedyncze miRNA może celować w wiele mRNA, te cząsteczki regulatorowe są zaangażowane w prawie każdy proces komórkowy i są zaangażowane w różne stany chorobowe16,17,18.

Szczegółowe zrozumienie tego, jak miRNA regulują szlaki komórkowe, wymaga identyfikacji docelowych mRNA. Dostępnych jest wiele platform bioinformatycznych do przewidywania przypuszczalnych interakcji miRNA:mRNA19,20. Przewidywania te opierają się na doskonałym parowaniu zasad Watsona-Cricka między 2-8 nukleotydową sekwencją zarodkową miRNA a komplementarną sekwencją w docelowej klasie mRNA 4,< sup class = "xref">21. Ponadto narzędzia te generują drugorzędową strukturę dupleksu miRNA:mRNA, obliczają parametry termodynamiczne tej interakcji molekularnej i pokazują zachowanie miejsc wiązania między gatunkami w celu zwiększenia funkcjonalnego znaczenia przewidywania celu. Niestety, narzędzia te mają również ograniczenie polegające na przewidywaniu wyników fałszywie dodatnich z bardzo dużą szybkością (~27–70%)15,22. Co najważniejsze, te platformy in silico nie rozpoznają niekanonicznych oddziaływań miRNA z ich celami23. W związku z tym takie analizy predykcyjne są często łączone z metodami eksperymentalnymi w celu walidacji funkcjonalnie istotnych celów.

Opracowano wiele podejść do eksperymentalnego walidacji interakcji miRNA:mRNA. Eksperymenty genetyczne z wykorzystaniem mimików miRNA, gąbek i inhibitorów, które zmieniają poziomy miRNA w komórce, dostarczają wskazówek dotyczących jego regulacyjnego wpływu na ekspresję docelowego genu24,25,26. Dodatkowo, testy oparte na reporterze poprzez kotransfekcję klonu zawierającego region 3' UTR docelowego mRNA i miRNA naśladują lub inhibitory do komórek, dostarczają dowodów na regulacyjną funkcję miRNAs26. Chociaż metody te mają kluczowe znaczenie dla badania potranskrypcyjnej regulacji ekspresji genów przez miRNA, skuteczność transfekcji i pleotropowe efekty zmian w poziomach komórkowych miRNA są głównymi ograniczeniami tych podejść genetycznych23,26. Dlatego uzupełniające się metody biochemiczne, które badają bezpośrednią interakcję między miRNA a jego celem, są stosowane w celu lepszego zrozumienia funkcji komórkowej miRNA.

Jedną z powszechnie stosowanych metod badania bezpośredniej interakcji między miRNA a jego celem jest immunoprecypitacja kompleksu RISC, a następnie wykrywanie celu mRNA w kompleksie27,28,29,30. Niedawno wykorzystano również ulepszoną metodę pułapki RISC do identyfikacji celów miRNA; sprzęga stabilizację celów w półproduktach RISC-miRNA-mRNA z oczyszczaniem celów mRNA. Jednak metody te stawiają czoła nieodłącznym wyzwaniom związanym z niespecyficznymi interakcjami między RNA a białkami wiążącymi RNA, które zwykle są segregowane przez przedziały komórkowe31,32. Ponadto testy te są zależne od obecności białka AGO2 do immunoprecypitacji kompleksu RISC33. Biorąc pod uwagę, że AGO2 nie jest jedynym argonautą, który pośredniczy w efektywnych oddziaływaniach miRNA:mRNA, wykluczenie innych argonautów może prowadzić do stronniczych wyników34. Dlatego potrzebne są alternatywne strategie badania bezpośredniego wiązania miRNA z mRNA.

W tym raporcie opracowujemy jednoetapowe podejście do badania bezpośredniej interakcji między miRNA a jego docelowym mRNA. Po pierwsze, miRNA 3' biotynylowane zablokowane kwasy nukleinowe (LNA) są transfekowane do komórek ssaków. Następnie kompleks miRNA:mRNA w lizacie komórkowym jest wychwytywany za pomocą kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną. Cel mRNA związany z komplementarnym miRNA jest oznaczany ilościowo za pomocą qPCR.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfekcja 3'-biotynylowanego miRNA

UWAGA: Wykonaj następujące kroki w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.

  1. Wysiew: 4 x 105–5 x 105 komórek HEK-293T na studzienkę w 2 ml kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) [DMEM uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1x antybiotykiem Pen-strep]. Hodować komórki w inkubatorze ustawionym w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  2. Następnego dnia sprawdź stan zdrowia i przyleganie posianych komórek pod mikroskopem świetlnym.
    UWAGA: Upewnij się, że komórki przylegają i osiągnęły odpowiednią morfologię przed przejściem do następnego kroku. Komórki HEK-293T są zwykle gotowe do transfekcji 18–24 godziny po posiewaniu.
  3. W sterylnej probówce do mikrofuge o pojemności 1,7 ml rozcieńczyć 75 pikomoli biotynylowanego miRNA w 200 μl minimalnej ilości niezbędnych pożywek. Przenieść tę mieszaninę do innej probówki do mikrofuge o pojemności 1,7 ml zawierającej odczynnik do transfekcji na bazie liposomów (8 μl / studzienkę) rozcieńczoną w 200 μl minimalnej ilości niezbędnych pożywek. Wymieszać dokładnie, ale delikatnie, pipetując i inkubować przez 20–25 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów transfekcyjnych.
  4. Usuń stare podłoża z 6-dołkowej płytki hodowlanej przez delikatne pipetowanie i uzupełnij każdą studzienkę 1,6 ml świeżo przygotowanego kompletnego DMEM (bez 1x antybiotyków Pen-strep).
  5. Dodawać kroplami kompleksy transfekcyjne (od 1.3) do komórek na płytce 6-dołkowej za pomocą dobrze skalibrowanej pipety. Delikatnie obracaj płytką, dodając kompleksy, aby zapewnić ich równomierne rozprowadzenie na płytce.
    UWAGA: Ten krok jest bardzo ważny dla osiągnięcia wysokiej wydajności transfekcji i musi być wykonywany z ostrożnością i cierpliwością.
  6. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 36 godzin.

2. Przygotowanie kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną — I

  1. Dokładnie zawieś kulki magnetyczne streptawidyny przez wirowanie. Przenieść 30 μl zawiesiny kulek (na próbkę) do probówki do mikrofugi o pojemności 2 ml bez nukleazy.
  2. Umieść rurkę zawierającą zawieszenie kulek na magnetycznym separatorze kulek ("magnes" dalej) na 2 minuty. Po upewnieniu się, że kulki są przyciągane do boku rurki stykającej się z magnesem, ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety.
  3. Dodać 100 μl buforu do płukania kulek (10 mM Tris-Cl pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl) do kulek. Wyjmij rurkę z magnesu. Wiruj przez 15 s w temperaturze pokojowej, aby umyć koraliki.
  4. Umieść probówkę zawierającą koraliki na magnesie na 2 minuty, a następnie ostrożnie wyjmij i wyrzuć supernatant.
  5. Powtórz kroki 2.3 i 2.4, co daje w sumie trzy prania. Po ostatnim etapie mycia wyjmij rurkę z magnesu.
  6. Dodać 100 μl roztworu uwalniającego RNazy (0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl) do kulek, dobrze wymieszać przez wirowanie przez 15 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Umieścić probówkę zawierającą kulki na magnesie na 2 minuty, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
  7. Powtórz krok 2.6 w sumie trzy razy.
  8. Dodać roztwór do ponownego zawieszania kulek (0,5 M NaCl) do kulek, wirować 15 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieścić zawieszone kulki na magnesie na 2 minuty i ostrożnie usunąć supernatant.
  9. Dodać 200 μl roztworu blokującego kulki (1 μg/μL BSA, 2 μg/μL tRNA drożdży) do kulek. Mieszaj przez delikatne wirowanie przez 15 s w temperaturze pokojowej. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 16 godzin (przez noc) na rotatorze wielorurowym.

3. Przygotowanie lizatów komórkowych

  1. Zbierz transfekowane komórki HEK-293T przez delikatne skrobanie za pomocą sterylnego skrobaka do komórek wewnątrz okapu laminarnego, a następnie przenieś każdą próbkę do sterylnej probówki do mikrofugi o pojemności 2 ml.
  2. Zeskrobane komórki osadzać przez odwirowanie przy 1 500 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić osad w 1x sterylnym PBS (sól fizjologiczna buforu fosforanowego), pH 7,2. Odwirować ponownie przy 1 500 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad wolny od resztek pożywki. Natychmiast zanurz rurkę zawierającą granulat w lodzie.
  3. Przygotuj świeży kompletny bufor do lizy komórek (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH-7,5, 5 mM DTT, 0,5% IGEPAL, 60 U/ml superazy, 1x inhibitor proteazy).
    UWAGA: Zapas buforu do lizy komórek bez IGEPAL, superazy i koktajlu inhibitorów proteazy może być przygotowany z wyprzedzeniem i przechowywany w temperaturze pokojowej. Przygotować nową partię kompletnego buforu do lizy komórek, dodając powyższe suplementy w zalecanych stężeniach końcowych do buforu do lizy komórek podstawowych i przechowując go na lodzie.
  4. Dodać 260 μl lodowatego buforu do całkowitej lizy komórek do każdej próbki w probówce do mikrofuge (tj. każda probówka do mikrofuge zawiera komórki zebrane z jednego dołka płytki 6-dołkowej) i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednorodnej zawiesinie przez pipetowanie.
  5. Lizować komórki metodą zamrażania i rozmrażania: inkubować probówki w temperaturze -80 °C przez 10–15 minut. Następnie pozwól komórkom rozmrozić się na lodzie.
  6. Powstały lizat komórkowy odwirować przy stężeniu 16 000 x g przez 5 minut w wirówce stołowej z chłodzeniem ustawionym na temperaturę 4 °C.
  7. Przenieś oczyszczony lizat komórkowy do sterylnej probówki do mikrofugi o pojemności 1,7 ml na lodzie. Wyrzuć granulkę.
    UWAGA: Ostateczna objętość oczyszczonego lizatu powinna wynosić ~240–250 μL.
  8. Dodać 5M NaCl do oczyszczonego lizatu do końcowego stężenia 1M i utrzymywać próbki na lodzie.

4. Przygotowanie kulek magnetycznych Streptawidyny — II

  1. Przygotuj świeży kompletny bufor do płukania (10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/ml Superaza i 1x koktajl inhibitorów proteazy)
    UWAGA: Zapas buforu do płukania typu pull-down bez koktajlu IGEPAL, Superase i inhibitorów proteazy można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować nową partię kompletnego buforu do lizy komórek, dodając powyższe suplementy w zalecanych stężeniach końcowych do buforu do lizy komórek podstawowych i przechowując go na lodzie.
  2. Umieść probówkę zawierającą przygotowane koraliki (z kroku 2.9) na magnesie na 2 minuty. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć supernatant.
  3. Dodaj 150 μl lodowatego kompletnego buforu do płukania typu pull-down do kulek. Wirować przez 15 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30–60 s. Umieść rurki na magnesie na 2 minuty. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
  4. Powtórz krok 4.3 w sumie 3 razy.
  5. Ponownie zawiesić kulki w 300 μl kompletnego buforu do płukania.

5. Ściąganie docelowych kompleksów mRNA-miRNA

  1. Przenieść 300 μl lizatu komórkowego (z kroku 3.8) do probówki do mikrofuge zawierającej 300 μl kulek (z kroku 4.5).
  2. Inkubować mieszaninę na mieszalniku nutującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Umieść probówkę na magnesie na 5 minut. Ostrożnie wyjmij i wyrzuć supernatant.
  4. Dodaj 300 μl lodowatego kompletnego buforu do płukania w dół do kulek. Wiruj przez 15 s w temperaturze pokojowej i umieść rurkę na magnesie na 5 minut. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
  5. Powtórz krok 5.4 jeszcze dwa razy.
  6. Zawiesić kulki w 100 μl wody wolnej od nukleaz i inkubować na lodzie.

6. Ekstrakcja całkowitego RNA, synteza cDNA i qPCR

  1. Ekstrahować całkowity RNA z zawieszonych kulek (z kroku 5.6) przy użyciu odpowiedniej metody (patrz Tabela materiałów). Ponownie zawiesić wyekstrahowany całkowity RNA w 25 μl wody wolnej od nukleaz. Oznaczyć stężenie i jakość RNA za pomocą spektrofotometru (absorbancja przy 260/280). Przygotować zapas roboczy RNA w stężeniu 50 ng/μl.
  2. Przeprowadzić syntezę cDNA, w trzech powtórzeniach, używając 50 ng całkowitego RNA (od kroku 6.1) przy użyciu odpowiedniego zestawu do syntezy cDNA (patrz tabela materiałów) przy użyciu starterów oligo dT w końcowej objętości 20 μl (tabela 1). Następnie załaduj probówki PCR do przyrządu qPCR, aby wykonać cykle termiczne zgodnie z warunkami opisanymi w tabeli 2.
  3. Wykonaj qPCR na CDNA (od kroku 6.2) przy użyciu SYBR Green chemistry (patrz Tabela Materiałów):
    1. Wszystkie reakcje qPCR należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach na 96-dołkowej przezroczystej płytce dolnej w sterylnych warunkach.
    2. Porcję 9 μl mieszaniny reakcyjnej z wzorcowej mieszanki qPCR (patrz tabela 3) do każdego dołka płytki. Następnie dodaj 1 μl cDNA do każdego dołka, aby uzyskać końcową objętość 10 μl. Uszczelnij płytkę PCR za pomocą żaroodpornego uszczelniacza płytkowego PCR i załaduj do instrumentu qPCR
    3. Wykonaj cykle termiczne zgodnie z warunkami opisanymi w tabeli 4.
    4. Znormalizuj poziomy wyrażeń (wartości Ct) każdej próbki do poziomów wyrażeń zaszyfrowanej kontrolki. Użyj tych wartości, aby obliczyć zmiany krotności w wyrażeniu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MiRNA regulują procesy komórkowe poprzez wiązanie się z docelowymi mRNA. Dlatego identyfikacja celów mRNA jest kluczem do zrozumienia funkcji miRNA. Tutaj opracowujemy metodę identyfikacji celu mRNA komórkowego miRNA. Protokół ten został zaadaptowany z Wani i wsp.35 z modyfikacją polegającą na wykorzystaniu biotynylowanych mimików opartych na LNA do ściągania docelowego mRNA. Zastosowanie naśladowców oligonukleotydów na bazie LNA zwiększa specyficzność wią...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja celów mRNA komórkowych miRNA jest ważna dla zrozumienia ich funkcji regulacyjnej. Do przewidywania celów w oparciu o komplementarność sekwencji zalążkowych i zachowanie sekwencji docelowych wykorzystuje się kilka narzędzi obliczeniowych19,20. Chociaż narzędzia te są cenne, mogą generować wysoki poziom zarówno wyników fałszywie dodatnich, jak i fałszywie ujemnych. Dlatego przewidywania te są sprzężone z metodami eksperymentalnymi, takimi jak immunopr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych i niefinansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez National Institutes of Health (NIH) Granty DA037779 (dla J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 i MD007586 (dla C.D.). Prace były również wspierane przez RCMI Grant G12MD007586, Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA grant (U54 RR026140 z NCRR/NIH, U54 Grant MD007593 z NIMHD/NIH oraz Tennessee Center for AIDS Research (P30 AI110527).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Linia komórkowa HEK293T komórekATCC CRL-3216
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca (Hi-FBS)GIBCO/Thermofisher10438-026
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)GIBCO/Thermofisher11995-065
Solanka buforowana fosforanami (PBS) (1x)GIBCO/Thermofisher20012-027
Trypsyna-EDTA (0,25%) GIBCO/Thermofisher25200-056
Roztwór penicyliny-streptomycyny (100x)Cellgro/Mediatech30-002-CI
DNaza AmbionAM2238
Opti-MEM Zredukowane podłoże surowicyGIBCO/Thermofisher3198-088
Liopfectamine 2000 Odczynnik do transfekcjiInvitrogen/ Thermofisher11668-019
Biotynylowany has-miR-125bExiqon339178/ID-27281622
Biotynylowana kontrola mieszanaExiqon479997-671/ID-714884
IGEPALSigma-Aldrich18896
Streptawidyna Koraliki magnetycznePierce88816
Drożdże tRNAInvitrogen/Thermofisher15401-011
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153
Roztwór chlorku potasu (KCl)Sigma-Aldrich60142
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM1028
Wodorotlenek sodu (NaOH)Sigma-Aldrich795429
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, roztwór soli disodowej (EDTA), 0,5 M, pH 8,0Sigma-AldrichE7889
Ditiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815
SuperaseAmbion/ThermofisherAM2694
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP8340
Woda wolna od RNAzy/DNAzyGIBCO/Thermofisher10977-015
Zestaw do ekstrakcji RNeasyQiagen74104
Zestaw do syntezy cDNA iScript-SelectBiorad170-8897
Startery qPCR Invitrogen/Thermofisher
iTaq-Universal SYBR zielony supermixBiorad172-5120
DynaMag-Spin MagnetInvitrogen/Thermofisher12320D

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Izaurralde, E. MicroRNAs silence gene expression by repressing protein expression and/or by promoting mRNA decay. Cold Spring Harborsymposia on quantitative biology. 71, 523-530 (2006).
  2. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome research. 14, 1902-1910 (2004).
  3. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Meyer, J., Borkhardt, A., Tuschl, T. New microRNAs from mouse and human. RNA. 9, 175-179 (2003).
  4. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  5. Lee, Y., Jeon, K., Lee, J. T., Kim, S., Kim, V. N. MicroRNA maturation: Stepwise processing and subcellular localization. The EMBO journal. 21, 4663-4670 (2002).
  6. Diederichs, S., Haber, D. A. Dual role for argonautes in microRNA processing and posttranscriptional regulation of microRNA expression. Cell. 131, 1097-1108 (2007).
  7. Perron, M. P., Provost, P. Protein interactions and complexes in human microRNA biogenesis and function. Frontiers in bioscience: A journal and virtual library. 13, 2537-2547 (2008).
  8. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, 843-854 (1993).
  10. Kloosterman, W. P., Wienholds, E., Ketting, R. F., Plasterk, R. H. Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo. Nucleic acids research. 32, 6284-6291 (2004).
  11. Lee, I., et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5'-UTR and 3'-UTR interaction sites. Genome research. 19, 1175-1183 (2009).
  12. Djuranovic, S., Nahvi, A., Green, R. miRNA-mediated gene silencing by translational repression followed by mRNA deadenylation and decay. Science. 336, 237-240 (2012).
  13. Iwakawa, H. O., Tomari, Y. The Functions of MicroRNAs: mRNA Decay and Translational Repression. Trends in cell biology. 25, 651-665 (2015).
  14. Wilczynska, A., Bushell, M. The complexity of miRNA-mediated repression. Cell deathand differentiation. 22, 22-33 (2015).
  15. Selbach, M., et al. Widespread changes in protein synthesis induced by microRNAs. Nature. 455, 58-63 (2008).
  16. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  17. Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
  18. Sayed, D., Abdellatif, M. MicroRNAs in development and disease. Physiologicalreviews. 91, 827-887 (2011).
  19. Steinkraus, B. R., Toegel, M., Fulga, T. A. Tiny giants of gene regulation: Experimental strategies for microRNA functional studies. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 5, 311-362 (2016).
  20. Watanabe, Y., Tomita, M., Kanai, A. Computational methods for microRNA target prediction. Methods in enzymology. , 65-86 (2007).
  21. Lewis, B. P., Shih, I. H., Jones-Rhoades, M. W., Bartel, D. P., Burge, C. B. Prediction of mammalian microRNA targets. Cell. 115, 787-798 (2003).
  22. Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455, 64-71 (2008).
  23. Thomson, D. W., Bracken, C. P., Goodall, G. J. Experimental strategies for microRNA target identification. Nucleic acids research. 39, 6845-6853 (2011).
  24. Ebert, M. S., Neilson, J. R., Sharp, P. A. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells. Nature. 4, 721-726 (2007).
  25. Elmen, J., et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic acids research. 36, 1153-1162 (2008).
  26. Jin, H. Y., et al. Transfection of microRNA mimics should be used with caution. Frontiersin genetics. 6, 340(2015).
  27. Beitzinger, M., Peters, L., Zhu, J. Y., Kremmer, E., Meister, G. Identification of human microRNA targets from isolated argonaute protein complexes. RNA biology. 4, 76-84 (2007).
  28. Chi, S. W., Zang, J. B., Mele, A., Darnell, R. B. Argonaute HITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps. Nature. 460, 479-486 (2009).
  29. Easow, G., Teleman, A. A., Cohen, S. M. Isolation of microRNA targets by miRNP immunopurification. RNA. 13, 1198-1204 (2007).
  30. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP. Cell. 141, 129-141 (2010).
  31. Cambronne, X. A., Shen, R., Auer, P. L., Goodman, R. H. Capturing microRNA targets using an RNA-induced silencing complex (RISC)-trap approach. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America. , 20473-20478 (2012).
  32. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  33. Meister, G., et al. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs. Molecular cell. 15, 185-197 (2004).
  34. Su, H., Trombly, M. I., Chen, J., Wang, X. Essential and overlapping functions for mammalian Argonautes in microRNA silencing. Genes & development. 23, 304-317 (2009).
  35. Wani, S., Cloonan, N. Profiling direct mRNA-microRNA interactions using synthetic biotinylated microRNA-duplexes. bioRxiv. , (2014).
  36. Grunweller, A., Hartmann, R. K. Locked nucleic acid oligonucleotides: The next generation of antisense agents? BioDrugs: clinical immunotherapeutics,biopharmaceuticals and gene therapy. 21, 235-243 (2007).
  37. Guerard, M., et al. Locked nucleic acid (LNA): Based single-stranded oligonucleotides are not genotoxic. Environmental and molecular mutagenesis. 58, 112-121 (2017).
  38. Song, R., Ro, S., Yan, W. In situ hybridization detection of microRNAs. Methods inmolecular biology. , 287-294 (2010).
  39. Edbauer, D., et al. Regulation of synaptic structure and function by FMRP-associated microRNAs miR-125b and miR-132. Neuron. 65, 373-384 (2010).
  40. Le, M. T., et al. MicroRNA-125b promotes neuronal differentiation in human cells by repressing multiple targets. Molecular and cellular biology. 29, 5290-5305 (2009).
  41. Dash, S., et al. Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 (PARP-1) induction by cocaine is post-transcriptionally regulated by miR-125b. eNeuro. 4, (2017).
  42. Micheli, F., et al. Regulation of proapoptotic proteins Bak1 and p53 by miR-125b in an experimental model of Alzheimer's disease: Protective role of 17beta-estradiol. Neuroscience letters. 629, 234-240 (2016).
  43. Orom, U. A., Lund, A. H. Isolation of microRNA targets using biotinylated synthetic microRNAs. Methods. 43, 162-165 (2007).
  44. Cloonan, N. Re-thinking miRNA-mRNA interactions: Intertwining issues confound target discovery. BioEssays: News and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 37, 379-388 (2015).
  45. Guo, Y. E., Steitz, J. A. 3'-Biotin-tagged microRNA-27 does not associate with Argonaute proteins in cells. RNA. 20, 985-988 (2014).
  46. Mook, O., et al. In vivo efficacy and off-target effects of locked nucleic acid (LNA) and unlocked nucleic acid (UNA) modified siRNA and small internally segmented interfering RNA (sisiRNA) in mice bearing human tumor xenografts. Artificial DNA, PNA & XNA. 1, 36-44 (2010).
  47. Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50, 9352-9367 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Biotin based Pulldown AssaymiRNA Target ValidationStreptavidin coated Magnetic BeadsBiotinylated miRNA MimicsLocked Nucleic Acid MimicsqPCR based QuantificationCellular Lysate PreparationmiR 125b PARP 1 InteractionNucleic Acid Pull downRNA Isolation Protocol

Related Articles