Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57795

⸱

6 września 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institut de la Vision, Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Produkcja wyspecjalizowanych komórek siatkówki z pluripotencjalnych komórek macierzystych jest punktem zwrotnym w rozwoju terapii chorób siatkówki opartej na komórkach macierzystych. W niniejszej pracy opisano prostą metodę wydajnego generowania organoidów siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki do badań podstawowych, translacyjnych i klinicznych.

Streszczenie

Produkcja wyspecjalizowanych komórek z pluripotencjalnych komórek macierzystych stanowi potężne narzędzie do opracowywania nowych podejść do medycyny regeneracyjnej. Wykorzystanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) jest szczególnie atrakcyjne w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym dystrofiami siatkówki, w których modele komórek siatkówki pochodzące z iPSC stanowią duży krok naprzód w kierunku zrozumienia i zwalczania ślepoty. W tym artykule opisujemy prosty i skalowalny protokół generowania, dojrzewania i kriokonserwacji organoidów siatkówki. Główną zaletą tej metody, opartej na zmianie pożywki, jest uniknięcie wielu i czasochłonnych etapów, które są powszechnie wymagane w przypadku kontrolowanego różnicowania iPSC. Naśladując wczesne fazy rozwoju siatkówki poprzez kolejne zmiany zdefiniowanych pożywek na przylegających ludzkich kulturach iPSC, protokół ten umożliwia jednoczesne generowanie samotworzących się struktur neuroretinalnych i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) w powtarzalny i wydajny sposób w ciągu 4 tygodni. Te struktury zawierające komórki progenitorowe siatkówki (RPC) można łatwo wyizolować w celu dalszego dojrzewania w warunkach pływającej hodowli, umożliwiając różnicowanie RPC w siedem typów komórek siatkówki obecnych w siatkówce dorosłego człowieka. Dodatkowo opisujemy szybkie metody kriokonserwacji organoidów siatkówki i komórek RPE do długotrwałego przechowywania. Opisane tu metody będą przydatne do produkcji i bankowania ludzkich komórek lub tkanek siatkówki pochodzących z iPSC zarówno do badań podstawowych, jak i klinicznych.

Wprowadzenie

Siatkówka jest integralną częścią ośrodkowego układu nerwowego (CNS) i ma ograniczoną zdolność do spontanicznej regeneracji po urazowym urazie lub chorobie. Dlatego patologie zwyrodnieniowe powodujące ostateczną utratę komórek siatkówki, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP), jaskra i retinopatia cukrzycowa, zwykle prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Ratowanie zdegenerowanej siatkówki jest dużym wyzwaniem, dla którego terapie oparte na komórkach macierzystych mające na celu zastąpienie uszkodzonych lub utraconych komórek są jednym z najbardziej obiecujących podejść1,2,3. Pluripotencjalne komórki macierzyste, takie jak ludzkie embrionalne komórki macierzyste (ESC) lub ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), mają zdolność do nieograniczonej ekspansji w hodowli i mają potencjał do wytwarzania dowolnych typów komórek. Postęp w naszej wiedzy na temat rozwoju siatkówki i ulepszenie protokołów in vitro do różnicowania iPSC u ludzi zaowocowały wygenerowaniem organoidów siatkówki7,8,9,10,11,12. Wszystkie główne komórki siatkówki, w tym komórki zwojowe siatkówki (RGC), fotoreceptory i komórki barwnikowego nabłonka siatkówki (RPE), zostały pomyślnie odróżnione od ludzkich ESC i iPSC4,5,6. Na podstawie metody SFEB (surowica bezsurowicowa zarodkowych agregatów przypominających ciało) opracowanej przez Eiraku i wsp.13, samotworzenie organoidów siatkówki można uzyskać z embrionalnych agregatów przypominających ciało pochodzących z ESC lub iPSC w zdefiniowanych komponentach macierzy zewnątrzkomórkowej7,10,14. Protokoły te są jednak skomplikowane i wymagają dużej liczby kroków, które nie zawsze są zgodne z dużą produkcją komórek do podejść terapeutycznych lub badań przesiewowych leków. Dlatego wybór metody produkcji ludzkich komórek siatkówki ma kluczowe znaczenie, a metoda musi być solidna, skalowalna i wydajna.

Tutaj, na podstawie naszej poprzedniej publikacji15, opisujemy każdy krok do prostego i efektywnego generowania komórek siatkówki poprzez samotworzenie organoidów siatkówki z przylegających ludzkich iPSC hodowanych w warunkach wolnych od karmów i kseno. Począwszy od rutynowych hodowli przylegających ludzkich iPSC, protokół ten wymaga jedynie prostej, sukcesywnej zmiany pożywki, aby umożliwić wytworzenie zarówno komórek RPE pochodzących z iPS (hiRPE), jak i struktur neurosiatkówkowych w ciągu 4 tygodni. Po ręcznej izolacji, hiRPE może zostać rozszerzony, a struktury siatkówki mogą być hodowane jako pływające organoidy, w których komórki progenitorowe siatkówki są w stanie różnicować się we wszystkie typy komórek siatkówki w kolejności sekwencyjnej zgodnej z retinogenezą ludzką in vivo. Wreszcie, w celu postępu badań lub przekształcenia klinicznego, opisujemy metodę kriokonserwacji pozwalającą na długotrwałe przechowywanie całych organoidów siatkówki i komórek hiRPE bez wpływu na ich cechy fenotypowe i funkcjonalność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół opisany w tym artykule jest zgodny z wytycznymi komisji etyki badań Institut de la Vision. Institut de la Vision otrzymał zezwolenie na manipulowanie próbkami ludzkimi zgodnie z obowiązującymi francuskimi przepisami. Postępowanie z próbkami odbywa się zgodnie z zasadami ochrony danych pacjenta zgodnie z zasadami Helsinek i przepisami krajowymi po uzyskaniu etycznego zatwierdzenia przez "Comité de Protection des Personnes (CPP) Ile-de-France V".

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych i potraw

  1. Pożywki hodowlane
    1. Użyj pożywki iPSC, chemicznie zdefiniowanej pożywki dedykowanej do hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach wolnych od karmowania16. Przygotować 500 ml pożywki zgodnie z protokołem producenta.
    2. Użyj pożywki Basal iPSC (Bi), chemicznie zdefiniowanej pożywki iPSC bez czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF2) lub transformującego czynnika wzrostu Beta (TGFß).
    3. Przygotuj 500 ml pożywki Bi uzupełnionej 1% suplementem N2 (pożywka BiN2), 10 jednostek/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny.
    4. Przygotuj 500 ml proneuronalnej pożywki na bazie N2 (pożywka ProN2) składającej się z DMEM: mieszaniny składników odżywczych F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamina), 1% aminokwasów endogennych MEM, 1% suplementu N2, 10 jednostek/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny.
    5. Przygotuj proneuronalną pożywkę na bazie witaminy B27 (pożywkę ProB27) składającą się z DMEM: mieszaniny składników odżywczych F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamina), 1% aminokwasów endogennych MEM, 2% suplementu B27, 10 jednostek/ml penicyliny i 10 mg/ml streptomycyny.
  2. Przygotowanie naczynia hodowlanego
    1. Do hodowli przeciwciał iPSC u ludzi
      1. Przygotować 10 ml roztworu witronektyny zawierającego 5 μg/ml witronektyny w 1x PBS. W 10 ml 1x PBS dodać 100 μl rozmrożonego roztworu podstawowego witronektyny (100x).
      2. Rozprowadzić 2 ml roztworu witronektyny na 6-centymetrowym naczyniu hodowlanym, co odpowiada 0,5 μg/cm2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Usunąć roztwór witronektyny przez aspirację za pomocą systemu do aspiracji próżniowej lub pipety o pojemności 5 ml.
      3. Dodaj 4 ml pożywki iPSC na 6-centymetrowe naczynie.
      4. Naczynia inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
    2. Do hodowli ludzkich komórek RPE pochodzących z iPSC (hiRPE)
    3. Użyj pluripotencjalnej matrycy lub podłoża kwalifikowanego do komórek macierzystych, aby pokryć studzienki zgodnie z protokołem producenta. Dodaj wystarczającą ilość matrycy lub substratu, aby pokryć całą powierzchnię wzrostu. Na przykład umieścić 300 μl matrycy na studzienkę na płytce 24-dołkowej i 3 ml matrycy w kolbie T-25 cm2.
    4. Inkubować powlekane naczynia hodowlane przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć matrycę za pomocą systemów aspiracji próżniowej lub pipety o pojemności 5 ml.
    5. Dodać 1 ml pożywki ProN2 na basenik na 24-dołkowe płytki i umieścić naczynie hodowlane z powrotem w inkubatorze na co najmniej 30 minut w celu ogrzania i zrównoważenia pożywki. Dla kolb T-25 cm2, patrz krok 5.2.

2. Utrzymanie i rozbudowa ludzkich iPSC

  1. Utrzymanie ludzkich komórek iPS
    1. Przygotuj 3 ml pożywki iPSC w probówce o pojemności 15 ml i trzymaj ją w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut przed użyciem. Przygotować powlekane naczynie o średnicy 6 cm, jak opisano w ppkt 1.2.1.
    2. Rozmrażać kriogeniczną próbkę ludzkich iPSC ze zbiornika z ciekłym azotem lub zamrażarki o temperaturze -150 °C przez inkubację w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 s.
    3. Ostrożnie zdezynfekować fiolkę kriogeniczną za pomocą roztworu dezynfekującego w sprayu. Przenieś rozmrożone ludzkie iPSC z krioprobówki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml pożywki iPSC wstępnie podgrzanej w temperaturze pokojowej.
    4. Odwirować probówkę o sile 110 x g przez 3 minuty. Usunąć supernatant przez aspirację za pomocą systemu do aspiracji próżniowej lub pipety o pojemności 5 ml.
    5. Zawiesić osad komórkowy z 1 ml pożywki iPSC z 6-centymetrowego naczynia hodowlanego pokrytego witronektyną za pomocą pipety o pojemności 2 ml i przenieść komórki z powrotem do naczynia. Włożyć naczynie do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na co najmniej 24 godziny przed wymianą pożywki.
      UWAGA: Inhibitor ROCK, taki jak Y-27632 w stężeniu 10 μM, można dodać do pożywki iPSC w 6-centymetrowych szalkach hodowlanych w celu zmniejszenia apoptozy.
    6. Zmieniaj pożywkę codziennie i co tydzień przechodź od ludzkich iPSC.
  2. Pasażowanie ludzkich komórek iPS
    1. Przekazać ludzki iPSC przy zbiegu 70 - 80%, klasycznie po 7 dniach w hodowli.
    2. Przygotuj 6-centymetrowe naczynia do pasażu, jak opisano w kroku 1.2.1. Usunąć pożywkę iPSC z naczyń ze zbiegającymi się iPSC i dodać 2 ml roztworu dysocjacyjnego przez 6 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Czas inkubacji zależy od klonów iPSC. Na początek wypróbuj 6-minutową inkubację.
    3. Usunąć roztwór dysocjacyjny za pomocą systemów do aspiracji próżniowej lub pipety o pojemności 5 ml i dodać 2 ml pożywki iPSC podgrzanej w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić kolonie iPSC, pipetując je w górę i w dół 5 - 10 razy za pomocą pipety 1 000 μl.
      UWAGA: Należy unikać dysocjacji pojedynczych komórek w wyniku nadmiernego pipetowania.
    4. Przenieś od 30 do 200 μl zawieszonych grudek komórek do nowego 6-centymetrowego naczynia hodowlanego. Włożyć szalki do inkubatora do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez co najmniej 24 godziny przed zmianą pożywki.
      UWAGA: Objętość zawieszonych grudek komórek potrzebnych do pasażowania zależy od klonów iPSC.
    5. Zmieniaj pożywkę codziennie i co tydzień przechodź od ludzkich iPSC.

3. Wytwarzanie organoidów siatkówki

  1. Rozpocznij różnicowanie iPSC zgodnie z protokołem schematyzowanym w Rysunek 1A, gdy kolonie osiągną zbieżność 60 - 70% (Rysunek 1B).
  2. Przygotuj 4 ml pożywki Bi na 6-centymetrowe naczynie. Podgrzej pożywkę Bi do 37 °C. Zmień pożywkę iPSC na pożywkę Bi. Zanotuj ten czas jako dzień 0 (D0).
  3. W temperaturze D2 zmienić kultury w pożywce Bi na pożywkę BiN2, uprzednio ogrzaną w temperaturze 37 °C. Pożywkę należy zmieniać co 2 - 3 dni.
  4. Zidentyfikuj pojawiające się samotworzące się organoidy siatkówki na podstawie pąków neuroepithelium, jak pokazano w Rysunek 1C - 1E.
    UWAGA: Te wczesne organoidy siatkówki, odpowiadające w swoim stadium rozwojowym miseczce wzrokowej, mogą być ręcznie izolowane w celu dalszych eksperymentów.

4. Dojrzewanie organoidów siatkówki

  1. W D28 przygotuj 6-dołkowe płytki zawierające 4 ml / dołek pożywki ProB27 początkowo uzupełnionej 10 ng / ml FGF2 (Rysunek 1A).
    UWAGA: Dodaj FGF2 bezpośrednio przed dodaniem podłoża do płyt.
    Uwaga: Nie filtruj FGF2.
  2. Ręcznie odzyskaj struktury siatkówki z 6-centymetrowych szalek. Aby to zrobić, wyizoluj struktury tworzące prostopadłe prążki za pomocą igły wokół pąka neuroepitelialnego, jak pokazano na Rysunek 1E, i odłącz organoidy, delikatnie drapiąc je igłą.
  3. Odessać 10 - 15 organoidów za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść je do jednego dołka na 6-dołkowej płytce zawierającej pożywkę ProB27.
  4. Organoidy siatkówki należy przechowywać w warunkach hodowli pływającej na pożywce ProB27 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj połowę podłoża co 2 - 3 dni.
    UWAGA: Traktować organoidy FGF2 do D35.
  5. W temperaturze D35 usunąć połowę pożywki i dodać świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę ProB27 w temperaturze 37 °C bez FGF2.
  6. Zmieniaj połowę pożywki co 2 - 3 dni w czasie wymaganym do uzyskania pożądanych typów komórek siatkówki zgodnie z pojawieniem się typów komórek siatkówki, jak pokazano w Rysunek 2.

5. Generowanie i amplifikacja ludzkich komórek RPE (hiRPE) pochodzących z iPSC

  1. Wytwarzanie ludzkich komórek hiRPE
    1. Zaangażuj iPSC w różnicowanie, gdy kolonie osiągną konfluencję 60 - 70%, postępując zgodnie z protokołem schematyzowanym w Rysunek 3A.
    2. Przygotować 4 ml na 6-centymetrowe naczynie pożywki Bi i ogrzać pożywkę Bi w temperaturze 37 °C. Zmień pożywkę iPSC na pożywkę Bi. Zanotuj ten czas jako dzień 0 (D0).
    3. W temperaturze D2 zmienić kultury w pożywce Bi na pożywkę BiN2 uprzednio ogrzaną w temperaturze 37 °C. Pożywkę należy zmieniać co 2-3 dni.
    4. W D28 zmień pożywkę na świeżą pożywkę ProN2 uprzednio ogrzaną w temperaturze 37 °C, jak pokazano na Rysunek 3A.
      UWAGA: Ten krok można wykonać po pobraniu organoidów opisanym w kroku 4.
    5. Zmieniaj podłoże ProN2 co 2-3 dni.
    6. W D42 zidentyfikuj pojawiające się komórki hiRPE, obserwując pigmentowane plamy, jak pokazano w Rysunek 3B.
      UWAGA: Pigmentacja komórek hiRPE pojawia się między D35 a D56 w zależności od klonów iPSC.
  2. Amplifikacja komórek hiRPE
    1. W D42 przygotować 24-dołkową płytkę uprzednio pokrytą matrycą, jak opisano w kroku 1.2.2 i zawierającą 1 ml pożywki ProN2 na basenik. Przed użyciem umieścić płytkę na 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    2. Ręcznie odzyskaj plastry hiRPE z 6-centymetrowej szalki. Aby wyizolować plamy, wykonaj prostopadłe prążki igłą wokół pigmentowanego nabłonka i oderwij arkusz, delikatnie drapiąc go igłą. Odessać 10 pigmentowanych plastrów za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść je do jednego dołka na płytce 24-dołkowej.
    3. Plastry hiRPE należy przechowywać w pożywce ProN2 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin przed zmianą pożywki. Zwróć uwagę na to przejście komórki hiRPE jako 0 (hiRPEp0). Zmieniaj pożywkę co 2 - 3 dni za pomocą pożywki ProN2.
    4. Przepuść komórki hiRPEp0, gdy komórki się zlewają.
      1. Usunąć pożywkę za pomocą systemów zasysania próżniowego i umyć każdą studzienkę 1x 1 ml PBS za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
      2. Odrzucić PBS za pomocą systemów aspiracji próżniowej, dodać 200 μl 0,25% trypsyny na studzienkę i inkubować przez co najmniej 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Dodać 800 μl pożywki ProB27, aby dezaktywować trypsynę.
        UWAGA: Nie zaleca się stosowania pożywki ProN2 w celu zatrzymania aktywności trypsyny.
      3. Oddziel arkusz komórek hiRPE, pipetując go w górę iw dół. Umieścić zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 5 minut przy 110 x g.
        UWAGA: Dodatkowe płukanie można wykonać za pomocą pożywki ProN2, aby usunąć nadmiar pożywki ProB27.
      4. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad komórek w 2 ml pożywki ProN2 podgrzanej w temperaturze 37 °C. Policz komórki za pomocą licznika komórek.
      5. Pobrać 1,25 miliona komórek i umieścić je w pokrytej matrycą kolbie T-25 cm2 (patrz krok 2.2.2) zawierającej 5 ml pożywki ProN2 wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C. Zwróć uwagę na ten pasaż komórek hiRPE jako 1 (hiRPEp1).
    5. Przechowywać komórki hiRPE w pożywce ProN2 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin przed zmianą pożywki.
    6. Zmieniaj nośnik co 2-3 dni. Gdy komórki hiRPEp1 osiągną konfluencję, wykonaj następne przejście lub krioprezerwację.

6. Kriokonserwacja organoidów siatkówki i komórek hiRPE

  1. Dla całych organoidów siatkówki
    1. Za pomocą pipety transferowej wybrać od 5 do 20 organoidów siatkówki i umieścić je w fiolce kriogenicznej. Usunąć nadmiar pożywki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl, nie dotykając organoidów znajdujących się na dnie probówki, i dodać 250 μl zimnego podłoża do kriokonserwacji (patrz tabela materiałów).
    2. Zamrozić fiolki w pojemniku do zamrażania na bazie izopropanolu w temperaturze -80 °C przez co najmniej 4 godziny. Zamrożone fiolki przenieść do zamrażarki o temperaturze -150 °C lub zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Do ogniw hiRPE
    1. W pasażu 1 rozdziel komórki hiRPE, gdy komórki się zlewają.
      UWAGA: Kriokonserwacja komórek hiRPEp0 nie jest zalecana.
    2. Odessać pożywkę z kolby T-25 cm2 za pomocą systemów do aspiracji próżniowej i przemyć ją 1x 3 ml PBS za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
    3. Usunąć PBS za pomocą systemów aspiracji próżniowej, dodać 1 ml 0,25% trypsyny i inkubować przez co najmniej 15 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Dodać 5 ml pożywki ProB27, aby zatrzymać aktywność trypsyny.
      UWAGA: Nie zaleca się stosowania pożywki ProN2 do inaktywacji trypsyny.
    4. Oddziel arkusz komórek hiRPE, pipetując go w górę iw dół za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Policz komórki za pomocą licznika komórek. Umieścić zawiesinę komórek w probówce o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 5 minut przy 110 x g.
      UWAGA: Można przeprowadzić dodatkowe płukanie za pomocą pożywki ProN2 w celu usunięcia nadmiaru pożywki ProB27.
    5. Odessać supernatant za pomocą aspiracji próżniowej i delikatnie ponownie zawiesić komórki, aby uzyskać 2 miliony komórek w 250 μl pożywki do kriokonserwacji.
    6. Przenieść 250 μl zawiesiny komórek na fiolkę kriogeniczną. Zamrozić fiolki w pojemniku do zamrażania na bazie izopropanolu w temperaturze -80 °C przez co najmniej 4 godziny.
    7. Przenieść zamrożone fiolki do zamrażarki o temperaturze -150 °C lub do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

7. Rozmrażanie organoidów siatkówki i komórek hiRPE

  1. Rozmrażanie całych organoidów siatkówki
    1. Ciepła pożywka ProB27 w temperaturze 37 °C (wymagane będą 2 ml na każdą fiolkę kriogeniczną).
    2. Ze zbiornika na ciekły azot lub zamrażarki o temperaturze -150 °C rozmrażać fiolkę kriogeniczną zawierającą organoidy siatkówki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 s. Ostrożnie zdezynfekować fiolkę kriogeniczną za pomocą roztworu dezynfekującego w sprayu.
    3. Otwórz fiolkę i dodaj 1 ml podgrzanej pożywki ProB27. Przenieść organoidy do probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety do przenoszenia.
    4. Delikatnie usunąć pożywkę, pipetując ją bez dotykania struktur siatkówki na dnie probówki. Umyj organoidy jeszcze 1 raz 1 ml podgrzanej pożywki ProB27.
    5. Odessać organoidy za pomocą pipety transferowej i umieścić je w 1 dołku na 6-dołkowej płytce zawierającej pożywkę ProB27, wstępnie podgrzaną i zrównoważoną w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      UWAGA: Umieść 10 - 15 organoidów siatkówki w dołku na płytce 6-dołkowej.
    6. Zmieniaj połowę pożywki co 2 - 3 dni w czasie wymaganym do uzyskania pożądanych typów komórek siatkówki zgodnie z ich pojawieniem się, jak opisano w Rysunek 2.
  2. Rozmrażanie komórek hiRPE
    1. Ciepła pożywka ProN2 w temperaturze 37 °C (8 ml będzie wymagane na każdą fiolkę kriogeniczną).
    2. Ze zbiornika ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze -150 °C rozmrozić próbkę kriogeniczną komórek hiRPEp1 przez inkubację w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 s. Ostrożnie zdezynfekować fiolkę kriogeniczną za pomocą roztworu dezynfekującego w sprayu.
    3. Otwórz probówkę i dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki ProN2 i przenieś zawiesinę komórek do 15 ml probówki zawierającej 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki ProN2. Wirować przez 5 minut przy 110 x g.
    4. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad komórek w 2 ml pożywki ProN2 ogrzanej w temperaturze 37 °C.
    5. Policz komórki za pomocą licznika komórek.
    6. Pobrać 1,25 miliona komórek i umieścić je w pokrytej matrycą kolbie T-25 cm2 (patrz krok 2.2.2) zawierającej 5 ml pożywki ProN2 wstępnie ogrzanej w temperaturze 37 °C. Na tym etapie zanotuj fragment jako 2 (hiRPEp2).
    7. Komórki hiRPEp2 należy przechowywać w pożywce ProN2 w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin przed zmianą pożywki.
    8. Zmieniaj nośnik co 2-3 dni. Gdy komórki hiRPE osiągną konfluencję, wykonaj następne przejście lub krioprezerwację.
      UWAGA: Po 2 tygodniach w hodowli można pobrać 8 - 10 milionów komórek hiRPE do dalszych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pierwszym krokiem w różnicowaniu ludzkich iPSC hodowanych w warunkach bez komórek pokarmowych (feeder-free)16 jest wyłączenie mechanizmów samoodnawiania przy użyciu pożywki Bi w celu stymulacji spontanicznego różnicowania (Rysunek 1A). Następnie, w 2. dniu (D2), pożywkę Bi uzupełnia się suplementem N2, aby skierować różnicujące się komórki iPSC w stronę linii neuronalnej i siatkówkowej. Proces ten prowadzi do pojawienia się pączków neu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje, w jaki sposób wytwarzać komórki RPE i organoidy siatkówki, zawierające RGC siatkówki i fotoreceptory, z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach wolnych od ksenotypów i żywicieli. Zgodna z procesem Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP), przedstawiona tutaj metoda upraw pozwala na dużą produkcję komórek siatkówki pochodzących z iPSC w postaci komórek RPE, RGC i fotoreceptorów w celu opracowania terapii opartych na komórkach macierzystych i podejść do odkrywania leków dla przyszłego l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Sacha Reichman, Olivier Goureau i José-Alain Sahel są wynalazcami oczekujących patentów związanych z generowaniem komórek siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować członkom zespołu Goureau za ich wkład podczas tworzenia opisanych tutaj metod, a G. Gagliardi i M. Garita za ich krytyczną lekturę. Prace te były wspierane przez granty ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), Stowarzyszenie Retina France oraz firma zajmująca się transferem technologii SATT Lutech. Został on również wykonany w ramach projektu LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) wspieranego przez ANR w ramach programu Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0004-02).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Vitronektyna (VTN-N) Rekombinowane białko ludzkie, skróconeThermoFisherScientific A14700
Powłoka CTS Vitronektyna (VTN-N) Rekombinowane białko ludzkie, skróconeThermoFisher ScientificA27940Powłoka
Essential 8 MediumThermoFisher ScientificA1517001
Medium Essential 6 MediumThermoFisher ScientificA1516401średni
suplement CTS (Cell Therapy Systems) N-2ThermoFisher ScientificA1370701suplement CTS
N-2 Suplement (100X)ThermoFisher Scientific17502048suplement
B-27 (50X), bez surowicydo 17504044ThermoFisher Scientific
Suplement CTS B-27, XenoFreeThermoFisher ScientificA1486701suplement CTS
DMEM/F-12ThermoFisher Scientific11320074pożywka
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)ThermoFisher Scientific11140035suplement
penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)ThermoFisher Scientific15140122antybiotyk
CellStartCTS ThermoFisher ScientificA1014201Matrix CTS
Geltrex hESC-Qualified, gotowy do użycia, o obniżonym czynniku wzrostu Matryca błony podstawnejThermoFisher ScientificA1569601Matrix
Odczynnik do delikatnej dysocjacji komórekStemcell Technologies7174roztwór dysocjacyjny
Cryostem Freezing Mediaclinisciences05-710-1DPożywka do kriokonserwacji
Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2)Preprotech100-18BFGF2
Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2) bez zwierzątPreprotechAF-100-18BFGF2 Igła AGANI bez ksenooz
23GTerumoAN*2332R1Kolba igłowa
25 cm² Sokół poddany hodowli tkankowej353109T-25 cm²
Płytka 24-dołkowa Costar3526Płytka 6-dołkowaCostar
Płytka 6-dołkowapoddana działaniu kultur tkankowychCostar3516
Suplement poddana działaniu kultur tkankowych 3526

Bibliografia

  1. Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
  2. Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -A. Let There Be Light: Gene and Cell Therapy for Blindness. Human Gene Therapy. 27, 134-147 (2016).
  3. Wright, L. S., Phillips, M. J., Pinilla, I., Hei, D., Gamm, D. M. Induced pluripotent stem cells as custom therapeutics for retinal repair: Progress and rationale. Experimental Eye Research. 123, 161-172 (2014).
  4. Leach, L. L., Clegg, D. O. Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients with Ocular Disease. Stem Cells. 33, 2363-2373 (2015).
  5. Gill, K. P., Hewitt, A. W., Davidson, K. C., Pébay, A., Wong, R. C. B. Methods of Retinal Ganglion Cell Differentiation From Pluripotent Stem Cells. Translational Vision Science and Technology. 3, 2(2014).
  6. Giacalone, J. C., Wiley, L. A., et al. Concise review: Patient-specific stem cells to interrogate inherited eye disease. STEM CELLS Translational Medicine. 5, 132-140 (2016).
  7. Nakano, T., Ando, S., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  8. Reichman, S., Terray, A., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 8518-8523 (2014).
  9. Meyer, J. S., Howden, S. E., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29, 1206-1218 (2011).
  10. Zhong, X., Gutierrez, C., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047(2014).
  11. Mellough, C. B., Collin, J., et al. IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).
  12. Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).
  13. Eiraku, M., Takata, N., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472, 51-56 (2011).
  14. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).
  15. Reichman, S., Slembrouck, A., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).
  16. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  17. Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).
  18. Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Retinalne organoidy z ludzkich iPSCkomórki nabłonka pigmentowego siatkówkikomórki progenitorowe siatkówkiróżnicowanie w zdefiniowanych mediachwarunki hodowli zawiesinowejmetody kriokonserwacjiróżnicowanie komórek siatkówkiprotokół izolacji organoidówekspansja komórek RPEdojrzewanie komórek siatkówki
Zdefiniowano warunki hodowli wolnej od ksenotypów i karmówek w celu wytworzenia modeli ludzkich komórek siatkówki pochodzących z iPSC
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.