Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57796

⸱

3 lipca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University Medical Center, 3CuriRX, Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Streszczenie

Polimodalne kanały jonowe przekształcają wiele bodźców o różnym charakterze w zmiany allosteryczne; te dynamiczne konformacje są trudne do określenia i pozostają w dużej mierze nieznane. Dzięki niedawnym postępom w dziedzinie kriomikroskopii elektronowej pojedynczej cząstki (cryo-EM), które rzucają światło na cechy strukturalne agonistycznych miejsc wiązania i mechanizm aktywacji kilku kanałów jonowych, przygotowano grunt pod dogłębną dynamiczną analizę ich mechanizmów bramkowania przy użyciu podejść spektroskopowych. Techniki spektroskopowe, takie jak paramagnetyczny rezonans elektronowy (EPR) i podwójny rezonans elektronowo-elektronowy (DEER), ograniczają się głównie do badania prokariotycznych kanałów jonowych, które można oczyścić w dużych ilościach. Zapotrzebowanie na duże ilości funkcjonalnych i stabilnych białek błonowych utrudniło badanie kanałów jonowych ssaków przy użyciu tych metod. EPR i DEER oferują wiele korzyści, w tym określenie struktury i dynamicznych zmian ruchomych regionów białka, choć w niskiej rozdzielczości, które mogą być trudne do uzyskania za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub cryo-EM, oraz monitorowanie odwracalnego przejścia bramkowania (tj. zamkniętego, otwartego, uczulonego i odczulonego). W tym miejscu udostępniamy protokoły uzyskiwania miligramów funkcjonalnych, rozpuszczonych w detergentach przejściowych kanałów kationowych potencjału receptora V członka 1 (TRPV1), które można oznaczyć do spektroskopii EPR i DEER.

Wprowadzenie

Dzięki najnowszym postępom w mikroskopii krioelektronowej pojedynczej cząstki (cryo-EM), struktury kanałów jonowych ssaków zostały uzyskane w niezwykłym tempie. W szczególności badania strukturalne polimodalnych kanałów jonowych, takich jak przejściowy potencjał receptora waniloidowego 1 (TRPV1), dostarczyły dalszych informacji na temat mechanizmów jego aktywacji1,2,3,4,5. Jednak dynamiczne informacje o kanałach jonowych osadzonych w środowisku membranowym są niezbędne do zrozumienia ich polimodalnych mechanizmów bramkowania i wiązania leków.

Spektroskopia paramagnetycznego rezonansu elektronowego (EPR) i podwójnego rezonansu elektronowo-elektronowego (DEER) dostarczyły jednych z najbardziej definitywnych modeli mechanistycznych dla kanałów jonowych6,7,8,9,10,11,12,13. Te podejścia ograniczały się głównie do badania prokariotycznych i archealnych kanałów jonowych, które w przypadku nadekspresji w bakteriach wytwarzają dużą ilość białek oczyszczonych detergentem. Wraz z rozwojem produkcji eukariotycznych białek błonowych w komórkach owadów i ssaków w celu charakterystyki funkcjonalnej i strukturalnej14,15,16, możliwe jest teraz uzyskanie biochemicznych ilości białek oczyszczonych detergentem do badań spektroskopowych.

Sygnały EPR i DEER pochodzą z etykiety paramagnetyczno-spinowej (SL) (tj. metanetiosulfonianu) przyłączonej do pojedynczej reszty cysteiny w białku. Etykiety spinowe zawierają trzy typy informacji strukturalnych: ruch, dostępność i odległości. Informacje te pozwalają określić, czy reszty są zakopane w białku, czy też są wystawione na działanie błony lub środowiska wodnego w stanach związanych z apo i ligandem13,17,18,19. W kontekście struktury o wysokiej rozdzielczości (jeśli są dostępne), dane EPR i DEER dostarczają zbioru ograniczeń dla wyprowadzania modeli dynamicznych w ich natywnym środowisku przy jednoczesnym monitorowaniu odwracalnego przejścia bramkowania (tj. zamkniętego, otwartego, uczulonego i odczulonego). Co więcej, elastyczne regiony, które mogą być trudne do określenia za pomocą krystalografii rentgenowskiej lub cryo-EM, można uzyskać, wykorzystując te zestawy danych środowiskowych do przypisania struktur drugorzędowych, a także lokalizacji w obrębie białka20. Struktury krio-EM uzyskane w nanodyskach lipidowych dostarczyły cennych informacji na temat bramkowania kanałów jonowych3,21,22,23,24,25; jednak podejścia spektroskopowe mogą dostarczyć dynamicznych informacji o stanach konformacyjnych (np. zmianach termicznych), które mogą być trudne do określenia za pomocą cryo-EM.

Wiele trudności musi zostać pokonanych, aby wdrożyć EPR i DEER, w tym brak funkcji białka podczas usuwania wszystkich reszt cysteiny (szczególnie obfite w kanałach ssaków), niska wydajność białka, niestabilność białka podczas oczyszczania i po znakowaniu wirowym, oraz agregacja białek w detergentach lub liposomach. W tym przypadku zaprojektowaliśmy protokoły pozwalające przezwyciężyć te krytyczne bariery i uzyskaliśmy informacje o widmach jeleni i EPR dla receptora czuciowego ssaków. Celem niniejszego artykułu jest opisanie metodologii wyrażania, oczyszczania, etykietowania i rekonstytucji funkcjonalnego minimalnego konstruktu TRPV1 szczura bez cysteiny (eTRPV1) do analiz spektroskopowych. Metodologia ta jest odpowiednia dla tych białek błonowych, które zachowują swoją funkcję pomimo usunięcia reszt cysteiny lub które zawierają cysteinę tworzącą wiązania dwusiarczkowe. Ten zbiór protokołów może zostać zaadaptowany do analizy spektroskopowej kanałów jonowych innych ssaków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Mutageneza TRPV1

Uwaga: Minimalny konstrukt TRPV1 do analizy spektroskopowej26 został zbudowany z pełnej długości kanału TRPV127 przy użyciu metody reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (Rysunek 1). Ten pozbawiony cysteiny minimalny konstrukt TRPV1 (określany dalej jako eTRPV1) składa się z reszt 110 - 603 i 627 - 764. eTRPV1 został sklonowany w pMO (wektor oparty na pcDNA3.1) w celu analizy funkcjonalnej oraz w rekombinowanym wektorze dawcy 28 zawierającym 8x białko wiążące histydynę-maltozę (MBP)-wirus wytrawiania tytoniu (TEV) do ekspresji i oczyszczania (Figura 2A). Mutanty pojedynczej cysteiny eTRPV1 zostały wygenerowane przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Sekwencje wektorów i kanałów są określone w pliku uzupełniającym 1: Metody uzupełniające.

  1. Projektowanie starterów mutagenezy za pomocą narzędzi online29.
  2. Wymieszać w probówce 0,2 ml: 5 μl 10x buforu reakcyjnego, 1 μl mieszanki dNTP (100 mM), po 1 μl oligonukleotydów 10 μM do przodu i do tyłu, 1 μL 100 ng/μL matrycy eTRPV1 DNA26, 1,5 μL DMSO, 1 μL enzymu mutagenezy, i 38,5 μl wody dejonizowanej. Zakręć mieszaniną przed umieszczeniem probówek w termocyklerze.
  3. Wykonaj mutagenezę PCR.
    1. Przeprowadzić a) denaturację w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, b) denaturację w temperaturze 95 °C przez 20 s, c) wyżarzanie w temperaturze 60 °C przez 10 s i d) wydłużenie w temperaturze 68 °C przez 4 minuty (30 s na 1 kb). Powtórzyć kroki od b do d przez 18 cykli, następnie przeprowadzić wydłużenie w temperaturze 68 °C przez 5 minut i utrzymać reakcję w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.
  4. Dodać 2 μl enzymu DpnI do reakcji; wymieszać, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  5. Wykonaj transformację
    1. Rozmrozić kompetentne komórki E. coli na lodzie.
    2. Do wstępnie schłodzonej sterylnej probówki o pojemności 14 ml dodaj 75 μl kompetentnych komórek i 10 μl mieszaniny PCR poddanej działaniu DpnI. Delikatnie wymieszaj.
    3. Inkubować reakcję na lodzie przez 30 minut. Utrzymywać probówkę w temperaturze 42 °C przez 45 s, a następnie natychmiast umieścić ją na lodzie na 2 minuty. Mieszaninę umieścić na płytce agarowej Luria Bulth (LB) zawierającej karbenicylinę (0,2 mg/ml). Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
    4. Zbierz co najmniej trzy pojedyncze kolonie z płytki i zaszczep każdą z nich w 4 ml LB zawierającego karbenicylinę (0,2 mg/ml) za pomocą sterylnej probówki o pojemności 14 ml. Inkubować kultury przez noc w temperaturze 37 °C i wstrząsać z prędkością 250 obr./min.
    5. Odwiruj nocne kultury w ilości 8 000 x g przez 10 minut i wyekstrahuj DNA zgodnie z instrukcjami zawartymi w dostępnych na rynku zestawach do mini-przygotowania.
    6. Sprawdzić obecność mutantów pojedynczej cysteiny za pomocą standardowego automatycznego sekwencjonowania DNA (patrz tabela materiałów).

2. Analiza funkcjonalna eTRPV1 i mutantów pojedynczej cysteiny

  1. Transfekcja linii komórkowej HEK29330
    1. Hodowla komórek HEK293 na 6-dołkowych płytkach w 2 ml pożywki o wysokiej zawartości glukozy (DMEM) na studzienkę (37 °C, 5% CO2, wilgotność 95%). Przygotuj komórki HEK293, które są w 70 \u2012 80% zlewane.
    2. Przygotuj mieszaninę do transfekcji w dwóch oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
      1. W przypadku reakcji A dodać 0,5 μg eTRPV1 lub pMO zawierającego mutant cysteiny do 250 μl minimalnej pożywki niezbędnej (np. Opti-MEM). W przypadku reakcji B dodać 3 μl odczynnika do transfekcji do 250 μl minimalnej pożywki niezbędnej. Inkubować każdą reakcję przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      2. Wymieszać reakcje A i B za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Inkubować mieszaninę przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Usunąć 500 μl pożywki hodowlanej z 70 - 80% zlewającej się studzienki i dodać 500 μl mieszaniny reakcyjnej. Płytki należy przechowywać przez noc w celu obrazowania Ca2+ (37 °C, 5 % CO2 i 95% wilgotności).
  2. Obrazowanie Ca2+ w komórkach HEK29330
    1. Wyczyść szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm etanolem i wodą i umieść je w 24-dołkowej płytce.
    2. Dodać 75 μl poli-l-lizyny na środek każdego szkiełka nakrywkowego i przechowywać płytkę przez 45 minut (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności).
    3. Usuń nadmiar poli-l-lizyny i trzykrotnie umyj szkiełka nakrywkowe solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby usunąć wszelkie resztki.
    4. Gdy szkiełka nakrywkowe będą gotowe, przystąp do odłączania komórek od płytki 6-dołkowej.
    5. Wyjmij podłoże i dodaj 500 μl ciepłego PBS (37 °C) do prania.
    6. Usuń PBS, dodaj 500 μl trypsyny i inkubuj przez 1 minutę.
    7. Dodać 500 μl ciepłej pożywki hodowlanej (37 °C) w celu zatrzymania reakcji trawienia i wymieszać pipetą; unikać tworzenia się pęcherzyków. W razie potrzeby dostosować stężenie komórek, rozcieńczając tę respodencję większą ilością pożywki hodowlanej.
    8. Wysiewać 250 μl transfekowanych komórek HEK293 (70% zlewających się) plus 250 μl pożywki hodowlanej (500 μl końcowej objętości na studzienkę) na wstępnie poddanych obróbce szkiełkach nakrywkowych i pozostawić je (do przymocowania) na 1-2 godziny w inkubatorze (37 °C, 5 % CO2, 95% wilgotności).
    9. W międzyczasie przygotuj roztwór ładujący, dodając 0,02% kwasu pluronowego i 1 μM Fluo-4-AM do buforu Ringera. Dobrze wymieszaj roztwór.
    10. Usunąć pożywkę hodowlaną HEK293 ze studzienki i dodać 500 μl roztworu ładującego. Inkubować komórki przez 1 godzinę (37 °C, 5% CO2, 95% wilgotności). Umyj ogniwa obciążone Fluo-4 dwukrotnie ciepłym buforem Ringera.
    11. Umieść szkiełko nakrywkowe z załadowanymi komórkami na 10-milimetrowej szalce Petriego w stoliku mikroskopowym (przy użyciu obiektywu 10X; wzbudzenie 494 nm i emisja 506 nm) w celu wykonania wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+.
    12. Zmierzyć zmiany intensywności fluorescencji po perfuzji odpowiednich ligandów (np. 10 μM kapsaicyny) za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania (patrz tabela materiałów).
  3. Przygotowanie mRNA i oocytów Xenopus laevis30
    1. Linearyzować eTRPV1 i pMO zawierające pojedyncze mutanty cysteiny za pomocą PmeI przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Oczyść DNA zgodnie z instrukcjami dostępnych na rynku zestawów oczyszczających.
    2. Użyj zlinearyzowanych i oczyszczonych DNA do syntezy zakrytych RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu kompatybilnego z polimerazą RNA T7.
    3. Oczyść zamknięte RNA zgodnie z dostępnymi na rynku zestawami do oczyszczania. Określ ilościowo ilość RNA, mierząc absorbancję przy długości fali 260 nm.  
    4. Przenieść 5 \u2012 10 ml oocytów X. laevis (dostępnych w handlu) do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 20 ml roztworu ND96 (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2; pH 7,4) z 1 mg / ml kolagenazy i nutianem przez 50 min w temperaturze pokojowej.
    5. Przepłukać oocyty w ND96 do momentu, aż roztwór będzie klarowny; dodać świeżą kolagenazę i wstrząsać przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zbadaj oocyty pod mikroskopem stereoskopowym i zatrzymaj trawienie, gdy zewnętrzna warstwa pęcherzykowa (błyszcząca warstwa z czerwonymi naczyniami krwionośnymi) jest nieobecna w większości oocytów (90%). Przepłukać oocyty w ND96, aż roztwór będzie klarowny.
    6. Przenieś oocyty do probówki polistyrenowej o pojemności 50 ml z ND96 plus 1 mM CaCl2 i wstrząsaj przez 1 godzinę. Niedotrawione oocyty przykleją się do rurki polistyrenowej.
    7. Przemyć oocyty ND96 plus 1 mM CaCl2 i uzupełnić roztwór 50 μg/ml gentamycyny i 50 μg/ml tetracykliny.
      Uwaga: Roztwory zawierające tetracykliny należy chronić przed ekspozycją na światło.
    8. Wybierz duże oocyty bez uszkodzonych błon i wykazujące wyraźną separację między biegunami zwierzęcymi i roślinnymi. Pozwól oocytom zregenerować się przez 4 godziny przed mikroiniekcją w temperaturze 16 °C.
    9. Użyj szklanych pipet (średnica zewnętrzna: 1,11 mm, średnica wewnętrzna: 0,5 i długość 8,8 cm), aby wstrzyknąć 1-5 ng mRNA z eTRPV1 i mutantów pojedynczej cysteiny do oocytów za pomocą systemu nanolitrów / wstrzykiwaczy (46 nL / s) i mikroskopu stereoskopowego (powiększenie 2X). Przechowuj oocyty w temperaturze 16 °C w ND96 uzupełnione CaCl2 i antybiotykami (gentamycyna/tetracyklina 1x).
    10. Po 72 godzinach zmierz prąd makroskopowy za pomocą dwuelektrodowego systemu akwizycji cęgów napięciowych (TEVC)31.
    11. Wyciągnąć pipety ze szkła borokrzemianowego (0,3 MΩ) i napełnić je 3 M KCl.
    12. Umieścić oocyt w komorze rejestracyjnej za pomocą pipety transferowej i ukrwić roztwór kąpieli (120 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EGTA i 10 mM roztwór HEPES; pH 7,4) z niską prędkością.
    13. Zanurz obie elektrody w roztworze kąpieli, aby wyregulować ich przesunięcia pipet. Delikatnie popchnij elektrody pipet (pipety ze szkła borokrzemianowego; O.D.: 1,5 mm, ID: 1,10 i długość 10 cm) do oocytu, aż do momentu zaobserwowania niewielkiego wgłębienia pod mikroskopem stereoskopowym (powiększenie 2X), a także zmiany potencjału błonowego.
    14. Zmień ustawienia wzmacniacza na tryb nagrywania i mierz prądy makroskopowe, stosując rampę cęgową od -80 do +80 mV przez 1 s. Załaduj system perfuzyjny roztworem użytym w kroku 2.3.12 o pH 7,4 (jako kontrola) i przy pH 5, aby sprawdzić aktywność eTRPV1.

3. Generowanie rekombinowanego bakmidu i bakulowirusa do ekspresji białek

  1. Bacmid powiedział:
    1. Przekształć 100 μl komórek DH10Bac E. coli z 7,5 ng rekombinowanego wektora dawcy zawierającego eTRPV1 i/lub mutanty pojedynczej cysteiny.
    2. Dodać 900 μl pożywki SOC (20 mg/ml tryptonu, 5 mg/ml ekstraktu drożdżowego, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mMMgSO4 i 20 mM glukozy) i inkubować przez 6 - 7 godzin w temperaturze 37 °C i 225 obr./min.
    3. Wysiewać 100 μl bezpośrednio z mieszaniny i z seryjnych rozcieńczeń (1/10 i 1/100) w płytkach LB-agar zawierających 100 μg/ml X-gal, 40 μg/ml IPTG, 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny i 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować płytki przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 37 °C.
    4. Wybierz białe kolonie o średnicy 2 mm, ponieważ niebieskie kolonie nie mają interesującej ich wkładki. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby sprawdzić, czy białe kolonie nie zawierają żadnych niebieskich plam.
    5. Zbierz co najmniej trzy pojedyncze kolonie i przenieś je do sterylnej probówki o pojemności 14 ml zawierającej 4 ml pożywki LB uzupełnionej 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny i 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować komórki przez noc (~16 h) w temperaturze 37 °C i 250 obr./min.
    6. Pobrać 1,5 ml nocnych kultur i wyizolować rekombinowane DNA bakmidu (szczegółowy protokół znajduje się w pliku uzupełniającym 1). Przechowywać bakimid w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch miesięcy.
      Uwaga: Przygotuj zapasy glicerolu DH10Bac E. coli zawierające bakmidowe DNA. Weź 300 μl kultury i dodaj 200 μl glicerolu o stężeniu 50% (końcowe stężenie glicerolu 20%). Przechowywać podwielokrotność w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
    7. Sprawdzić obecność eTRPV1 w rekombinowanym bakidach za pomocą PCR (szczegółowy protokół znajduje się w pliku uzupełniającym 1).
  2. Bakulowirus
    Uwaga: W tej procedurze należy przetransfekować komórki owadów Sf9 w formacie 6-dołkowym. Wszystkie ilości i objętości są podawane w odniesieniu do każdego odwiertu. Unikaj stosowania antybiotyków.
    1. Płytka 1 x 106 komórek Sf9 w 2 ml pożywki z komórek owadów. Pozwól komórkom przyczepić się przez co najmniej 45 minut.
    2. Rozcieńczyć 1 μg rekombinowanego bakmidowego DNA w 100 μl pożywki z komórek owadów. Delikatnie wymieszaj.
    3. Rozcieńczyć 6 μl odczynnika do transfekcji (TR) w 100 μl pożywki z komórek owadów. Delikatnie wymieszaj.
    4. Połączyć roztwory DNA i TR (odpowiednio z etapów 3.2.2 i 3.2.3). Delikatnie wymieszać i inkubować przez 30 minut w temperaturze smojonej.
    5. Dodać 0,8 ml pożywki z komórek owadów do mieszaniny DNA/TR; delikatnie wymieszać.
    6. Usuń pożywkę z komórek owadów z komórek Sf9 i przemyj raz 1 ml świeżej pożywki.
    7. Usunąć pożywkę płuczącą i dodać mieszaninę DNA/TR (3.2.2 \u2012 3.2.5) do komórek. Inkubować komórki w temperaturze 27 °C przez 5 godzin (bez mieszania).
    8. Usunąć mieszaninę transfekcji i zastąpić ją 2 ml pożywki z komórek owadów zawierającej 0,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Inkubować komórki w temperaturze 27 °C przez pięć dni.
      ostrożność: Zapobiegaj parowaniu pożywki komórkowej, wypełniając puste studzienki pożywką i przykrywając płytkę 6-dołkową dwiema warstwami folii parafinowej.
    9. Przenieś pożywkę do hodowli komórkowej do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wyizolować pierwsze pasaż (P1) wirusa, obracając probówkę o masie 8 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i natychmiast przechowywać w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Chroń wirusa przed ekspozycją na światło, przykrywając rurkę folią aluminiową.
    10. W przypadku drugiej generacji (P2) zapasu wirusa należy umieścić 25-mililitrową hodowlę zawiesinową pożywki z komórek owadów w 1 x 106 komórek Sf9/ml zawierających 2% FBS w kolbie o pojemności 125 ml (z gładkim dnem i wentylowaną). Dodać 25 μl wirusa P1 do 25 ml kultury.
    11. Inkubować kulturę w temperaturze 27 °C przez 72 godziny.
    12. Aby zebrać szczep wirusa P2, przenieś kulturę do nowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj ją przy 8 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    13. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml i natychmiast przechowywać w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Chroń wirusa przed ekspozycją na światło, przykrywając rurkę folią aluminiową. Przeprowadzić eksperyment na małą skalę w celu miareczkowania stosunku wirusa P2 do Sf9 w celu uzyskania optymalnej ekspresji TRPV1 (patrz Plik Uzupełniający 1, aby uzyskać szczegółowy protokół, sekcja 4 zatytułowana "Eksperyment na małą skalę dla wirusa P2").
    14. W celu ekspresji białek na dużą skalę należy umieścić 1-litrową hodowlę zawiesiny komórkowej Sf9 o stężeniu 2 x 106 komórek/ml w pożywce z komórek owadów uzupełnionej 0,5% FBS w kolbie ze szkła borokrzemianowego o pojemności 2,8 l.
    15. Dodać 1 ml preparatu wyjściowego wirusa P2 do 1-litrowej kultury i inkubować w temperaturze 27 °C przez 72 godziny.
      Uwaga: Trzeciego dnia gęstość komórek powinna wynosić około 1,5 do 2,5 x 106 komórek/ml.

4. eTRPV1 i oczyszczanie mutantów z pojedynczą cysteiną

  1. Izolacja membran28
    1. Zebrać 1-litrową zawiesinę komórek owadów, wirując w temperaturze 4 500 x g, 4 °C, przez 20 minut. Zważyć osad z komórek (oczekuje się, że będzie to około 6 - 9 g).
    2. Zawiesić osad komórkowy w 25 ml lodowatego buforu A (36,5 mM sacharozy, 2 mM tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) i 50 mM tris; pH 7,4) w obecności inhibitorów proteazy (1 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF), 3 μg/ml leupeptyny, 3 μg/ml aprotyniny i 1 μg/ml pepstatyny). Rozdzielić zbrylenia komórek w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny i obracać w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    3. Rozbij komórki za pomocą ręcznego (młynek do tkanek) lub homogenizatora wysokociśnieniowego. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie w stężeniu 8 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Utrzymuj lizowane komórki i probówki na lodzie podczas całego procesu.  
    4. Zebrać supernatant i odwirować przy 100 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad membranowy w całkowitej objętości 20 ml lodowatego buforu B (150 mM NaCl, 10% glicerolu, 2 mM TCEP, 50 mM HEPES; pH 7,4), uzupełnionego inhibitorami proteazy (jak w kroku 4.1.2).
    5. Podwielokrotność 20 ml zawiesiny membranowej w probówkach o pojemności 50 ml i błyskawiczne zamrożenie w ciekłym azocie. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Oczyszczanie białka26,28
    1. Rozmrozić podwielokrotności błony na lodzie i dodać 3 ml n-docecylo-β-D-maltopiranozydu (DDM) na probówkę (200 mM zapasu). Obracać rurkę przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    2. Odwirować próbkę o masie 100 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i dodać 1 ml czystej, mokrej żywicy amylozowej. Obracać mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Załadować mieszaninę białka/amylozy do kolumn chromatografii przepływowej.
      ostrożność: Nie dopuścić do wyschnięcia żywicy podczas prania.
    3. Przemyj żywicę amylozową związaną z białkami 10-krotnością objętości lodowate lodu buforu C (150 mM NaCl, 10% glicerolu, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/ml asolektyny, 0,5 mM TCEP; pH 7,4). Przemyć 10 objętościami lodowatego buforu D (150 mM NaCl, 10% glicerolu, 50 mM HEPES, 0,5 mM DDM, 0,1 μg/ml asolektyny, pH 7,4).
      Uwaga: Przed praniem należy odgazować bufor D bez detergentu i lipidów, przepłukując go azotem. Po odgazowaniu dodaj DDM i asolektynę.
    4. Elute białko eTRPV1 z 0,5 ml frakcji, do 5 ml, lodowato odgazowanego buforu D, uzupełnionego 20 mM maltozą. Jeśli to możliwe, przemywać i elucję w temperaturze 4 °C.
    5. Określ ilościowo ilość białka, mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm.
      Uwaga: Ten protokół daje od 0,5 do 1,0 mg białka na litr kultury. Wydajność białka może się różnić dla każdego mutanta pojedynczej cysteiny eTRPV1. W przypadku eksperymentów EPR i DEER wyhoduj 4 \u2012 6 L kultury.

5. eTRPV1 Etykietowanie wirowania z pojedynczym mutantem cysteiny skierowanym do miejsca

  1. Zagęścić frakcje zawierające eTRPV1 za pomocą filtra odśrodkowego (odcięcie = 100 kDa) do 2 \u2012 2,5 mg/ml do etykietowania (cykle 7 000 x g przez 2 min w temperaturze 4 °C).
  2. Dodać 10-krotny nadmiar molowy (3 razy, co 30 minut) znacznika wirowania (1-oksyl-2,2,5,5-tetra-metylopirolidyno-3-ylo) metylometatiosiulfonianu metylu (MTSSL) ze 100-mM roztworu podstawowego w DMSO do skoncentrowanego białka (monomer eTRPV1: MTSSL w stosunku molowym 1:10)17. Utrzymywać reakcję w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 h 30 min, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    Uwaga: Na tym etapie MBP można usunąć poprzez dodanie proteazy TEV podczas nocnej inkubacji znakowania spinowego.
  3. Załadować znakowany spinowo eTRPV1 na kolumnę chromatografii wykluczającej wielkość zrównoważoną w buforze E (150 mM NaCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM DDM; pH 7,4), kontrolowanym przez system szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC). Zbierz frakcje zawierające tetramer eTRPV1.
    Uwaga: Na tym etapie nie należy dodawać 10% glicerolu, ponieważ zmniejsza to skuteczność rozpuszczania.
  4. Określ ilościowo ilość białka, mierząc absorbancję przy długości fali 280 nm.
  5. Oceń czystość próbki, stosując żel SDS-PAGE (żel bez plam, 4 \u2012 20%). Próbka jest teraz gotowa do pomiarów spektroskopowych w roztworze i/lub proteoliposomach.

6. eTRPV1 Rekonstytucja pojedynczego mutanta cysteiny znakowana spinowo

  1. Suszyć 10 mg asolektyny za pomocą wyparki obrotowej w próżni (≤100 mbar) przez 1 godzinę w temperaturze 40 °C. Aby wytworzyć liposomy asolektyny, dodaj 1 ml buforu F (200 mM NaCl, 5 mM MOPS; pH 7,4) i poddawaj mieszaninę sonikacji przez 15 minut lub do momentu, gdy próbka będzie jednorodna.
  2. Destabilizować liposomy poprzez dodanie DDM do końcowego stężenia 2 mM i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Zagęścić znakowane białko w stężeniu 2 mg/ml i dodać je do liposomów, stosując stosunek białka do lipidów 1:5 (masa:masa).
    ostrożność: Ważne jest, aby utrzymać wyżej wymienione stężenia białka, ponieważ skuteczność znakowania spinowego spada przy niskich stężeniach, a przy wysokich białko może się wytrącać.
  4. Dodać bufor F, aby dostosować mieszaninę białka/liposomu do krytycznego stężenia miceli DDM (CMC) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem.
  5. Podwoić objętość mieszaniny białko/liposom za pomocą buforu F i usunąć detergent, dodając kolejno trzy podwielokrotności niepolarnych kulek adsorpcyjnych polistyrenu (30 mg, 50 mg i 80 mg) w odstępach 1-godzinnych z delikatnym mieszaniem w temperaturze pokojowej.
  6. Załadować mieszaninę na filtr kolumnowy (kolumna chromatografii grawitacyjnej) w celu usunięcia kulek i przeniesienia mieszaniny proteoliposomów do probówki ultrawirówkowej. Odwirować próbki przy 100 000 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 30 μl buforu F.
    Uwaga: Próbki są gotowe do analizy spektroskopowej i wstrzyknięcia do oocytów Xenopus. Jeżeli próbki nie mogą być wykorzystane tego samego dnia, należy je błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  7. Proteoliposomy-Elektrofizjologia oocytów Xenopus26,32
    1. Wstrzyknąć 50 nl różnych rozcieńczeń proteoliposomów znakowanych spinowo do oocytów Xenopus, jak opisano w punkcie 2.2.
    2. Pomiary TEVC należy wykonać po 12 godzinach od wstrzyknięcia, jak opisano w ppkt 2.3.10.
  8. Przystąp do wykonywania pomiarów spektroskopowych i analiz (sekcja 7).

7. Spektroskopia jeleni i EPR

  1. Spektroskopia podwójnego rezonansu elektronowo-elektronowego (DEER).
    1. Pomiary jeleni należy wykonywać w impulsowym spektrometrze EPR pracującym w paśmie Q (34 GHz) i wyposażonym we wzmacniacz o mocy 10 W z sekwencją czterech impulsów w czasie martwym pod kątem 83° przy użyciu oprogramowania dostarczonego przez producenta33.
    2. Uzupełnij 50 μM oczyszczonych detergentem mutantów cysteiny eTRPV1 znakowanych spinowo w buforze E (krok 5.5) 30% (v/v) glicerolem w celu krioochrony.
    3. Załaduj próbkę do szczelnie zamkniętej kwarcowej rurki kapilarnej i odwiruj na dno probówki przez krótkie wirowanie na niskiej prędkości (100 x g).
    4. Umieść rurkę kapilarną w ciekłym azocie, aby zamrozić próbkę. W tym momencie próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego pomiaru.
    5. Umieścić próbkę bezpośrednio w rezonatorze mikrofalowym i pozostawić do ponownego zrównoważenia w temperaturze -83° przez 10 –20 minut.
    6. Zmierz próbkę przy użyciu standardowego czteroimpulsowego protokołu DEER, (π/2)mw1–τ1–(π)mw1–τ1–(π)mw2–τ2–(π)mw1–τ2–echo34. Długości impulsów dla (π/2)mw1 i (π)mw1 wynoszą odpowiednio 10 i 20 ns oraz 40 ns dla (π)mw2. Ustaw separację częstotliwości na 63 MHz.
      Uwaga: Pierwotne dane dotyczące rozpadu jeleni mogą być analizowane za pomocą domowego oprogramowania (np. w Matlabie), które zakłada sumę rozkładów Gaussa w celu opisania odległości między etykietami spinów19,35.
  2. Spektroskopia EPR fal ciągłych (CW)
    1. Wykonaj eksperymenty CW EPR w RT na spektrometrze w paśmie X (9,6 GHz) przy użyciu oprogramowania producenta.
    2. Uruchom instrument, włączając agregat wody lodowej, konsolę i zasilacz magnetyczny. Podłącz oprogramowanie do instrumentu, ustaw instrument w stroju i odczekaj co najmniej 30 minut, aż instrument się rozgrzeje.
    3. Załadować 20 μl próbki z kroku 5.5 do szklanej rurki kapilarnej o pojemności 25 μl za pomocą działania kapilarnego i uszczelnić koniec probówki szczeliwem.
    4. Załaduj rurkę kapilarną do wnęki mikrofalowej i krytycznie sprzęgnij rezonator ręcznie lub automatycznie, korzystając z funkcji automatycznego dostrajania oprogramowania.
    5. Zbierz pierwsze widma pochodne w standardowych warunkach instrumentu: modulacja mikrofalowa 100 kHz, modulacja pola magnetycznego 1,6 G i moc mikrofalowa 10 mW.
    6. W celu analizy i prezentacji danych skoryguj widma na tle i znormalizuj je, dzieląc widma przez wartość międzyszczytową całki podwójnej.
    7. Określ ruchliwość znacznika spinowego, mierząc odwrotność szerokości linii środkowej widma absorpcji pierwszej pochodnej (ΔH o-1)36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Charakterystyka funkcjonalna minimalnego konstruktu TRPV1 pozbawionego cystein (eTRPV1) oraz mutantów z pojedynczą cysteiną

Pierwszym krokiem w badaniach spektroskopowych jest zaprojektowanie i charakterystyka konstruktów białek pozbawionych cystein (Rysunek 2A), które są funkcjonalne i pozwalają na uzyskanie biochemicznych ilości białka. Funkcjonalność eTRPV1 została potwierdzona za pomocą obrazowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecne technologie ekspresji i oczyszczania białek błonowych ssaków umożliwiły uzyskanie wystarczającej ilości białka do badań spektroskopowych 14,15,16,42. Tutaj dostosowaliśmy te technologie do ekspresji, oczyszczania, odtwarzania i wykonywania analiz spektroskopowych w TRPV1.

Wśród krytycznych kroków w protokole, poniżej znajdują się te, z którymi rozwiązaliśmy pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy bardzo wdzięczni dr H. Mchaourabowi za udostępnienie spektrometrów EPR i DEER oraz dr T. Rosenbaumowi za dostarczenie pełnowymiarowego plazmidu TRPV1 bez cysteiny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
QuikChange Lightning Zestaw mutagenezy skierowanej na miejsceAgilent Technologies210519-5
2-propanol (izopropanol)Fisher ScientificA416
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)GoldBio.comA-420-10
Żywica amylozaNEBE8021L
AprotininGoldBio.comA-655-25
Asolektyna z soiSigma11145
System ekspresji bakulowirusa Bac-to-BacInvitrogen Life Technologies10359016
Biobeads SM-2 Adsorbenty Bio-Rad152-3920
(3,5'') (inekcja oocytów)PipetyDrummond Scientific 3-000-203 G/X
(zapisy oocytów)Sutter InstrumentB150-110-10HP
CaCl2 2H2OFisher ScientificC79
Karbenicylina (disodowa)GoldBio.comC-103-5
Odczynnik do CellfectinInvitrogen Life Technologies10362-010
cellSensOlympus
ChloroformFisher ScientificC606SK
Kolagenaza Typ 1Worthington-BiochemLS004196
CritisealVWR18000-299
D-(+)-GlukozaSigma G8270
D-(+)-monohydrat maltozyFisher ScientificBP684
DDM (n-Docecyl-B-D-Maltopyranoside)AnatraceD310S
Pożywka o wysokiej zawartości glukozy (Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni)SigmaD0572 
Jednorazowe kolumny odsalające PD-10GE Healthcare45-000-148
EGTAFisher ScientificO2783
Surowica bydlęcapłodu Invitrogen Life Technologies10082-147
Fluo-4 AMLife TechnologiesF-14201
GenCatch Plus Plasmid DNA Mini-Prep KitEpoch Life Science, Inc2160250
Zestaw do czyszczenia GenCatch PCREpoch Life Science, Inc2360050
Siarczan gentamycynyLonza17-518Z
Kapilara szklana (25 &mikro; l)VWR53432-761
Szklana kolba 2800 mlPyrex USA4423-2XL
GlicerolFisher BioReagentsBP229
HEK293S GnTl-ATCCCRL-3022
HEPESSigma H4034
IPTG (izopropylo-tio-B-galaktozyd)GoldBio.comI2481C25
Siarczan kanamycynyFisher ScientificBP906-5
KClFisher ChemicalP217
LB Broth,Miller Fisher bioOdczynnikiBP1426
Hemisulfan leupeptynyGoldBio.comL-010-5
Lipofectamine 2000Invitrogen Life Technologies11668-019
MgCl2 6H2OFisher ScientificBP214
MgSO4 7H2OFisher ScientificBP213
mMESSAGE mMACHINE T7 KitAmbionAM1344
MOPSFisher bioReagentsBP2936
MTSL (1-Oxyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-3-yl) Metyl MetanetynosulfonianToronto Research Chemicals, IncO873900
NaClFisher ChemicalS271
Opti-MEMLife Technologies31985-062
Pepstatyna AGoldBio.comP-020-5
Kwas pluronowy F-127 (20%)PromoKine   CA707-59004
PMSFGoldBio.comP4170
Roztwór poli-L-lizynySigma-AldrichP4707
Rneasy Mini KitQiagen74104
Uszczelniona kapilaraVitroComna specjalne zamówienie
SF-900 II SFM (podłoże dla komórek owadzich)Gibco, Life Technologies10902-088
Sf9 Komórki (przystosowane do SFM)Invitrogen Life Technologies11496-015
Ekstrakt z polarnych lipidów sojowychAvanti Polar Lipids, Inc541602C
SacharozaFisher ScientificS25590
Superose 6 Increase 10/300 GLGE Healthcare29091596
TCEP HClGoldBio.comTCEP1
Chlorowodorek tetracyklinyFisher ScientificBP912-100
Tris BaseFisher BioReagentsBP152
TryptonDifco0123-01
X-galGoldBio.comX4281C
Oocyty XenopusNascoLM00935M
XL1 - Blue Competent CellsAgilent Technologies, Inc200249
Drożdże EkstraktDifco0127-01-7
Econo-Pack kolumna chromatograficznaBio-Rad7321010
Mini-PROTEAN TGX Bezplamiste żele prefabrykowaneBio-Rad17000436
pFastBac1 Wektor ekspresjiInvitrogen Life Technologies10360-014
DH10Bac Kompetentne komórkiInvitrogen Life Technologies10361-012
Uszczelniacz do rurek kapilarnych CritisealLeica Microsystems02-676-20
ABI Model 3130XL Analizatory genetyczneApplied Biosystems4359571
Pipeta transferowaFishebrand13-711-9AM
Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
Pipety ze szkła borokrzemianowego ze szkła borokrzemianowego

Bibliografia

  1. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504, 107-112 (2013).
  2. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504, 113-118 (2013).
  3. Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action. Nature. , (2016).
  4. Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel. Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).
  5. Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin. Elife. 5, (2016).
  6. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer. Science. 306, 491-495 (2004).
  7. Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation. Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).
  8. Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter. Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).
  9. Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel. Elife. 6, (2017).
  10. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321, 1210-1214 (2008).
  11. Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating. Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).
  12. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418, 942-948 (2002).
  13. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285, 73-78 (1999).
  14. Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).
  15. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
  16. Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors. Nature. 460, 599-604 (2009).
  17. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).
  18. Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure. Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).
  19. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98, L18-L20 (2010).
  20. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation. J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).
  21. Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359, 228-232 (2018).
  22. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  23. Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552, 205-209 (2017).
  24. McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6. Nature. 553, 233-237 (2018).
  25. Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel. Nature. , (2017).
  26. Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis. Sci Rep. 7, 9861(2017).
  27. Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic. Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).
  28. Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids. Neuron. 77, 667-679 (2013).
  29. Braman, J., Papworth, C., Greener, A. Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates. Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).
  30. Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats. Nature. 476, 88-91 (2011).
  31. Guan, B., Chen, X., Zhang, H. Two-electrode voltage clamp. Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).
  32. Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes. Sci Rep. 3, 1040(2013).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).
  34. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).
  35. Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter. Elife. 3, e02740(2014).
  36. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).
  37. Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  38. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19, 1549-1561 (2011).
  39. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  40. Jeschke, G. Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR. Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).
  41. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).
  42. He, Y., Wang, K., Yan, N. The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins. Protein Cell. 5, 658-672 (2014).
  43. Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ). Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie TRPV1elektronowy rezonans paramagnetycznypodwójny rezonans elektron-elektronsolubilizacja detergentemrekonstytucja białkamutageneza celowanaekspresja bakulowirusowachromatografia wykluczania molekularnegotworzenie proteoliposomów
Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.