Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57801

⸱

6 czerwca 2018

 ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, University of Iowa

W tym artykule

Podsumowanie

Przetwarzanie wsadowe drożdżowych 2-hybrydowych ekranów pozwala na bezpośrednie porównanie profili interakcji wielu białek przynęty z wysoce złożonym zestawem białek fuzyjnych ofiar. W tym miejscu opisujemy udoskonalone metody, nowe odczynniki oraz sposób ich zastosowania w takich badaniach przesiewowych.

Streszczenie

Badanie przesiewowe interakcji białko-białko za pomocą testu 2-hybrydowego drożdży od dawna jest skutecznym narzędziem, ale jego użycie zostało w dużej mierze ograniczone do odkrycia interaktorów o wysokim powinowactwie, które są bardzo wzbogacone w bibliotece współpracujących kandydatów. W tradycyjnym formacie test drożdży 2-hybrydowych może dać zbyt wiele kolonii do analizy, gdy jest przeprowadzany przy niskiej rygorystyczności, gdzie można znaleźć interakcje o niskim powinowactwie. Co więcej, bez kompleksowego i kompletnego zbadania tej samej biblioteki pod kątem różnych plazmidów przynęty nie można przeprowadzić analizy porównawczej. Chociaż niektóre z tych problemów można rozwiązać za pomocą tablicowych bibliotek zdobyczy, koszt i infrastruktura wymagane do obsługi takich ekranów mogą być zaporowe. Jako alternatywę dostosowaliśmy test drożdży 2-hybrydowych, aby jednocześnie odkryć dziesiątki przejściowych i statycznych interakcji białek w ramach jednego ekranu, wykorzystując strategię zwaną DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks), która obejmuje wysokoprzepustowe sekwencjonowanie DNA i obliczenia w celu śledzenia ewolucji populacji plazmidów, które kodują oddziałujących partnerów. W tym miejscu opisujemy niestandardowe odczynniki i protokoły, które umożliwiają łatwe i ekonomiczne wykonanie badania przesiewowego DEEPN.

Wprowadzenie

Pełne zrozumienie procesów biologicznych komórek opiera się na znalezieniu sieci interakcji białek, które leżą u podstaw ich mechanizmów molekularnych. Jednym z podejść do identyfikacji interakcji białkowych jest test drożdży 2-hybrydowych (Y2H), który działa poprzez złożenie działającego chimerycznego czynnika transkrypcyjnego, gdy dwie interesujące nas domeny białkowe wiążą się ze sobą1. Typowe badanie przesiewowe Y2H przeprowadza się poprzez utworzenie populacji drożdży, w której znajduje się zarówno biblioteka plazmidów kodujących oddziałujące białka połączone z aktywatorem transkrypcji (np. białkiem fuzyjnym "ofiary"), jak i dany plazmid "przynęty" składający się z białka będącego przedmiotem zainteresowania połączonego z domeną wiążącą DNA (np. domena wiążąca DNA Gal4, która wiąże się z sekwencją aktywującą Gal4). Jedną z głównych zalet podejścia Y2H jest to, że jest ono stosunkowo łatwe i niedrogie do przeprowadzenia w typowym laboratorium wyposażonym do rutynowych prac z zakresu biologii molekularnej2. Jednak w tradycyjnym przypadku użytkownik pobiera próbki pojedynczych kolonii, które powstają po selekcji w celu uzyskania pozytywnej interakcji Y2H. To poważnie ogranicza liczbę bibliotecznych klonów "ofiar", które można badać. Problem ten nasila się, gdy liczebność danej ofiary oddziałującej jest bardzo wysoka w stosunku do innych, co zmniejsza szansę na wykrycie interakcji z plazmidami ofiar o niskiej liczebności.

Jednym z rozwiązań do wykorzystania zasady Y2H w kompleksowym pokryciu proteomu jest użycie podejścia sformatowanego matrycowo, w którym tablica zawierająca znane pojedyncze plazmidy ofiar może być cyfrowo przesłuchiwana. Takie podejście wymaga jednak infrastruktury, która nie jest łatwo dostępna ani opłacalna dla indywidualnych badaczy, którzy są zainteresowani zdefiniowaniem interaktomii niewielkiej liczby białek lub domen3. Ponadto bardzo złożone biblioteki ofiar, które mogą kodować wiele fragmentów oddziałujących ze sobą białek, zwiększyłyby rozmiar takich macierzy do niepraktycznych rozmiarów. Alternatywą jest przeprowadzanie testów ze złożonymi bibliotekami w partiach i ocena obecności oddziałujących klonów przy użyciu masowego równoległego sekwencjonowania o wysokiej przepustowości4. Można to zastosować do oznaczenia obecności plazmidów ofiar, które powstają w wielu koloniach, przy użyciu typowego podejścia sformatowanego Y2H, w którym komórki drożdży zawierające oddziałującą parę białek fuzyjnych mogą rosnąć na płytce5,6. Tę ogólną ideę można zaakcentować, aby zwiększyć liczbę zapytań zarówno o wiele składników przynęty, jak i ofiary w tym samym czasie7,8.

Mimo to, wiele badań wymaga łatwiejszego, ale bardziej skoncentrowanego wysiłku na zaledwie kilku 'przynętach' białkowych i może przynieść więcej korzyści dzięki wyczerpującemu i częściowo ilościowemu przeszukiwaniu pojedynczej złożonej biblioteki zdobyczy. Opracowaliśmy i zwalidowaliśmy podejście do przeprowadzania szeroko zakrojonych badań interakcji białek przy użyciu zasady Y2H w formacie wsadowym4. Wykorzystuje to szybkość ekspansji konkretnego plazmidu ofiary jako wskaźnik zastępczy dla względnej siły interakcji Y2H9. Głębokie sekwencjonowanie wszystkich plazmidów w populacji poddanej normalnym warunkom wzrostu lub selektywnemu wzrostowi daje kompletną mapę klonów, które dają silne i słabe interakcje Y2H. Repertuar interaktorów można uzyskać i bezpośrednio porównać w wielu plazmidach przynęty. Uzyskany w ten sposób proces roboczy nazwany DEEPN (Dynamic Enrichment for Evaluation of Protein Networks) może być zatem wykorzystany do identyfikacji interaktomów różnicowych z tych samych bibliotek ofiar w celu identyfikacji białek, co pozwoli na porównanie jednego białka z drugim.

Tutaj demonstrujemy DEEPN i wprowadzamy ulepszenia w metodach laboratoryjnych, które ułatwiają jego użycie, które są opisane na rysunku 1. Do istotnych ulepszeń należą:

Generacja populacji drożdży drapieżnych. Jednym z kluczowych wymagań projektu DEEPN jest generowanie populacji drożdży z różnymi plazmidami przynęty, które mają taki sam rozkład bibliotek ofiar plazmidów. Równoważne populacje wyjściowe biblioteki plazmidów ofiar są niezbędne do dokonywania dokładnych porównań między interaktomami różnych przynęt. Najlepiej osiągnąć to, gdy plazmid biblioteczny jest już umieszczony w haploidalnej populacji drożdży, a przeniesienie danego plazmidu przynęty do tej populacji uzyskuje się poprzez krzyżowanie w celu wytworzenia diploidu. W tym miejscu przedstawiamy jasny przewodnik, jak tworzyć takie populacje za pomocą komercyjnych bibliotek mieszczących się w haploidalnych drożdżach. Chociaż znaleźliśmy metody, które generują dużą liczbę diploidów, ogólna skuteczność kojarzenia tych komercyjnych szczepów drożdży zawierających bibliotekę była niska. Dlatego skonstruowaliśmy nowy szczep, który może pomieścić biblioteki ofiar, które dają znacznie więcej diploidów na reakcję godową.

Nowy zestaw plazmidów przynęty. Wiele obecnych plazmidów, które wyrażają białka fuzyjne "przynęty" składające się z białka będącego przedmiotem zainteresowania i domeny wiążącej DNA, jest opartych na 2μ, co pozwala im na amplifikację liczby kopii. Ta liczba kopii może być dość zmienna w populacji i prowadzić do zmienności odpowiedzi transkrypcyjnej Y2H. To z kolei może zniekształcić zdolność do oceny siły danej interakcji białkowej na podstawie odpowiedzi wzrostu komórek poddanych selekcji. Można temu częściowo zaradzić, używając plazmidu o niskiej kopii, z których niektóre zostały już wcześniej opisane, takie jak dostępny na rynku pDEST3210. Skonstruowaliśmy nowy plazmid przynęty (pTEF-GBD), który wytwarza białka fuzyjne domeny wiążącej Gal4-DNA w plazmidzie o niskiej kopii na bazie centromeru TRP1 z genem oporności na Kanr, który umożliwia również klonowanie fragmentów przynęty zarówno przed, jak i za domeną wiążącą DNA Gal4

.

Nowa biblioteka fragmentów Y2H o wysokiej gęstości. Skonstruowaliśmy nowy plazmid do przechowywania bibliotek ofiar Y2H i wykorzystaliśmy go do zbudowania wysoce złożonej biblioteki Y2H wykonanej z losowo ściętych fragmentów genomowego DNA z Saccharomyces cerevisiae. Analiza sekwencji wykazała, że ta biblioteka zawierała ponad 1 milion różnych elementów, znacznie bardziej złożonych niż wcześniej opisane biblioteki plazmidów genomowych Y2H drożdży11. Dzięki tej nowej bibliotece byliśmy w stanie pokazać, że przepływ pracy DEEPN jest wystarczająco solidny, aby pomieścić złożone biblioteki z wieloma różnymi plazmidami w sposób, który jest niezawodny i powtarzalny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie mediów i płyt

UWAGA: Wszystkie tabliczki muszą być wykonane minimum 2 dni przed rozpoczęciem protokołu. Media można wykonać w dowolnym momencie. Jednak buforowany ekstrakt drożdżowy dekstroza peptonowo-adeninowa (bYPDA) musi być wykonany w dniu, w którym będzie używany. Niektóre podłoża są wytwarzane przy użyciu mieszanki suplementów zawierających poziom adeniny większy niż zwykle stosowany. Większość minimalnych dodatków pożywki określa 10 mg/l adeniny. Suplementy oznaczone jako "+40Ade" określają łączną zawartość adeniny 40 mg/l.

  1. Przygotuj roztwór glukozy (50% w/v). Na 1 l rozpuść 500 g D-(+)-glukozy w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Dostosuj objętość do 1,000 ml za pomocą cylindra z podziałką i przefiltruj przez sterylny filtr 0,2 μm do sterylnej butelki do przechowywania pożywki o pojemności 1,000 ml.
  2. Przygotuj płytki z dekstrozą peptonową (YPD) z ekstraktem drożdżowym. Na 1 l rozpuść 20 g peptonu i 10 g ekstraktu drożdżowego w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Wlać do cylindra z podziałką, napełnić do 960 ml wodą destylowaną. Wlać do kolby Erlenmeyera o pojemności 2 000 ml i dodać 15 g agaru. Autoklaw i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż temperatura łaźni wodnej spadnie do około 42 - 50 °C. Za pomocą pipety dodaj 40 ml 50% glukozy. Dobrze wymieszaj, mieszając.
    1. Wlać pipetą serię płytek o średnicy 100 mm z 20 ml pożywki.
  3. Przygotuj kompletne płytki syntetyczne z minimalnymi mediami (CSM)-Trp. Na 1 l rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Wlać do cylindra miarowego, napełnić do 960 ml wodą destylowaną. Wlać do 2000 ml kolby Erlenmeyera i dodać 0,7 g mieszanki dropout -Trp -Met, 20 mg metioniny i 15 g agaru. Autoklaw i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż temperatura łaźni wodnej spadnie do około 42 - 50 °C. Za pomocą pipety dodaj 40 ml 50% glukozy. Dobrze wymieszaj, mieszając.
    1. Wlać pipetą serię płytek o średnicy 100 mm z 20 ml pożywki.
  4. Przygotuj płyty CSM-Leu-Met. Na 1 l rozpuść 10,05 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Wlać do cylindra z podziałką i napełnić do 940 ml wodą destylowaną. Wlać do 2 000 ml kolby Erlenmeyera i dodać 1,005 g mieszanki -Leu -Met dropout i 15 g agaru. Autoklaw i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż temperatura łaźni wodnej spadnie do około 42 - 50 °C. Za pomocą pipety dodaj 60 ml 50% glukozy. Dobrze wymieszaj, mieszając.
    1. Wlać pipetą serię płytek o średnicy 100 mm z 20 ml pożywki.
  5. Przygotuj płytki CSM-Leu-Trp. Na 1 l rozpuść 10,05 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Wlać do cylindra z podziałką, napełnić do 940 ml wodą destylowaną. Wlać do 2 000 ml kolby Erlenmeyera i dodać 1,005 g mieszanki dropout -Trp -Leu+40Ade, 240 mg adeniny i 15 g agaru. Autoklaw i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż temperatura łaźni wodnej spadnie do około 42 - 50 °C. Za pomocą pipety dodaj 60 ml 50% glukozy. Dobrze wymieszaj, mieszając.
    1. Wlać pipetą serię płytek o średnicy 100 mm z 20 ml pożywki.
  6. Przygotuj talerze CSM-Leu-Trp-He. Na 1 l rozpuść 10,05 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Wlać do cylindra z podziałką, napełnić do 940 ml wodą destylowaną. Wlać do 2000 ml kolby Erlenmeyera i dodać 0,975 g mieszanki dropout -Trp -Leu-His+40Ade, 240 mg adeniny i 15 g agaru. Autoklaw i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż temperatura łaźni wodnej spadnie do około 42 - 50 °C. Za pomocą pipety dodaj 60 ml 50% glukozy. Dobrze wymieszaj, mieszając.
    1. Wlać pipetą serię płytek o średnicy 100 mm z 20 ml pożywki.
  7. Przygotuj płytki CSM-Leu-Trp-His-3AT. Na 1 l rozpuść 10,05 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Wlać do cylindra z podziałką, napełnić do 940 ml wodą destylowaną. Wlać do 2000 ml kolby Erlenmeyera i dodać 0,975 g mieszanki dropout -Trp -Leu-His+40Ade, 240 mg adeniny i 15 g agaru. Autoklaw i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż temperatura łaźni wodnej spadnie do około 42 - 50 °C. Za pomocą pipety dodaj 60 ml 50% glukozy. Wymieszać 100 μl 1 M sterylnego wywaru z 3-amino-1,2,4 triazolem (3AT) przez zawirowanie.
    1. Wlać pipetą serię płytek o średnicy 100 mm z 20 ml pożywki.
  8. Przygotować płytki LB-Kanr. Na 1 l rozpuść 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego i 10 g NaCl w 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 000 ml. Wlać do cylindra miarowego, napełnić do 1,000 ml wodą destylowaną. Wlać do 2 000 ml kolby Erlenmeyera i dodać 15 g agaru. Autoklaw i schłodzić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż temperatura łaźni wodnej spadnie do około 42 - 50 °C. Dodać 50 mg kanamycyny i mieszać przez mieszanie.
    1. Wlać pipetą serię płytek o średnicy 100 mm z 20 ml pożywki.
  9. Przygotowanie mediów YPD, CSM-Leu-Met, CSM-Trp, CSM-Leu-Trp i CSM-Leu-Trp-His. Zastosować powyższą procedurę dla płytek, z wyjątkiem tego, że zamiast nalewać do kolby Erlenmeyera, należy przelać do butelki do przechowywania pożywki i pominąć agar.
  10. Przygotuj bYPDA (buforowane YPDA). Weź sterylną pożywkę YPD i dodaj 200 mg/l adeniny do sterylnej wody destylowanej. Dostosuj pH do 3,7 za pomocą HCl. Przefiltruj przez sterylny filtr 0,2 μm do sterylnej butelki.
  11. Przygotować bufor transformacyjny: 2 M sorbitol, 1 M dwuwodny octan litu, 10 mM Tris pH 7,6, 0,5 mM EDTA, 0,2 mM chlorek wapnia w wodzie destylowanej. Przefiltrować przez sterylny filtr 0,2 μm do sterylnej butelki.
  12. Przygotuj roztwór PEG: 70% w/v glikolu polietylenowego 3350 w wodzie destylowanej. Sterylizuj w autoklawie.
  13. Przygotuj Twirl: 8 M mocznika, 4% w/v SDS, 50 mM Tris pH 6,8, 10% v/v glicerolu, 0,02% w/v błękitu bromofenolowego w sterylnej wodzie destylowanej.
  14. Przygotuj sTE (mocne TE): 50 mM Tris, 20 mM EDTA, pH 8,0 w wodzie destylowanej. Przefiltrować przez sterylny filtr 0,2 μm do sterylnej butelki.
  15. Przygotować roztwór podstawowy zymolazy: 10 mg/ml zymolazy 100T w 50 mM fosforan potasu dwuzasadowy pH 7,5, 50% v/v bufor glicerolu w sterylnej wodzie destylowanej (przechowywanej w temperaturze -20 °C).

2. Klonowanie i weryfikacja plazmidów przynęty

UWAGA: Budowa plazmidów wiążących Gal4-DNA. Obecnie istnieje wiele dostępnych na rynku i akademickich systemów Y2H. DEEPN może pomieścić wiele z nich, pod warunkiem, że plazmid przynęty wyrażający interesujące białko połączone z domeną wiążącą DNA znajduje się w plazmidzie zawierającym TRP1. Inne dalsze wymagania to to, że sekwencja znajdująca się bezpośrednio przed wstawką biblioteki ofiar jest znana i że pozytywna interakcja Y2H może być oceniona przez produkcję His3, co pozwala na selekcję w pożywkach pozbawionych histydyny. Tutaj opiszemy użycie nowego plazmidu przynęty Y2H (pTEF-GBD, Rysunek 2), jednak można również użyć innych plazmidów przynęty Y2H, w tym pGBKT7. Do budowy i oceny plazmidów przynętowych opiszemy zastosowanie pTEF-GBD. Ogólnie rzecz biorąc, zalecamy syntezę genów w celu wytworzenia otwartej ramki odczytu, która przylega do odchylenia kodonu drożdży, aby zapewnić dobrą ekspresję i łatwość klonowania. Upewnij się, że schemat klonowania pozwala na to, aby przynęta znajdowała się w ramce z domeną wiążącą DNA Gal4 i że podczas klonowania w miejscu 3' kodon stop podąża za regionem kodującym przynętę.

  1. Przygotuj wektor plazmidowy. Plazmid pTEF-GBD pozwala na klonowanie fragmentu kodującego białko będące przedmiotem zainteresowania w 5' lub 3' regionu kodującego domenę wiążącą DNA Gal4 przy użyciu metody szybkiego składania. W celu wprowadzenia w miejscu 5' należy wytrawić 3 μg pTEF-GBD za pomocą NarI i EcoRI lub w przypadku wprowadzenia w miejscu 3', trawić za pomocą BamHI i XhoI przez 2 - 4 godziny. Próbka elektroforezy w 1% żelu agarozowym DNA zawierającym 0,2 - 0,5 μg/ml bromku etydyny (EtBr) przy 100 V. Wyciąć wycinek 5,630 bp TEF-GBD i oczyścić za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu DNA zgodnie z instrukcjami producenta i określić ilościowo DNA przez absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru12.
    UWAGA: Generowanie wkładek kodujących przynętę. Fragmenty DNA kodujące białka lub fragmenty białek będące przedmiotem zainteresowania mogą być wytwarzane za pomocą syntezy genów i dostępne jako niesklonowane fragmenty. Zaleca się, aby kodony były zoptymalizowane pod kątem ekspresji w Saccharomyces cerevisiae, a narzędzia online do optymalizacji kodonów zostały włączone do listy materiałów.
  2. W przypadku insercji 5' należy otoczyć bok fragmentu DNA kodującego kodon start ATG odpowiednio przez 5'-TTAAGAAAAACAAACTGTAACGAATTC-3' i 5'-GCGCCTATGTGTGAACAAAAGCTTATT-3'. W przypadku insercji 3' w ramce z domeną wiążącą DNA Gal4, należy otoczyć fragment kodujący 5'- ctgcatatggccatggaggagggaa -3' i 5'-tagtaactagcataaccccttgggg-3'.
  3. Do budowy plazmidu należy użyć metody szybkiego montażu, zgodnie ze wskazówkami producenta dotyczącymi klonowania fragmentów do pociętego pTEF-GBD.
    1. Płytki wszystkie przekształcone E. coli na płytki LB-Kanr i inkubować przez 16 - 20 godzin w temperaturze 37 °C. Kolonie zawierające pTEF-GBD z pożądaną wkładką można zidentyfikować przez amplifikację PCR przy użyciu oligonukleotydów: 5'- CGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAG -3' i 5'-GAGTAACGACATTCCCAGGTTTTC-3' dla wkładki 5' oraz 5'-CACCGTATTTCTGCCACCTCTCTC-3' i 5'-GCAACCGACTATTTGGAGCGCTG-3' dla wkładki 3'. Te oligonukleotydy mogą również służyć jako startery do sekwencjonowania insertu.
    2. Zaplanuj przygotowanie >10 μg każdej pochodnej pTEF-GBD i samego pTEF-GBD, aby zapewnić materiał do sekwencjonowania i przemian drożdży.
    3. Stosować następujące warunki PCR: 3 min w temperaturze 98 °C, a następnie 25 cykli po 30 s w temperaturze 98 °C, 30 s w temperaturze 55 °C i 2 min w temperaturze 72 °C, a następnie 5 min w temperaturze 72 °C przy użyciu buforu zawierającego 2,5 mM MgCl2, 0,5 U/100 μL polimerazy DNA, i zastrzeżony bufor.

3. Ekspresja białek fuzyjnych domeny wiążącej Gal4-DNA

  1. Zrób kompetentne drożdże.
    1. Rozprowadź drożdże PJ69-4A na płytce YPD, biorąc sterylny drewniany aplikator, zeskrobując 1mm3 zamrożonego bulionu o temperaturze -80 °C i delikatnie pocierając nim płytkę YPD. Przesuń drewniany aplikator w dół płytki tak, aby każde przejście przechodziło przez nietkniętą część powierzchni podłoża. Inkubować płytkę YPD w temperaturze 30 °C przez 2 dni lub do momentu, gdy widoczne będą pojedyncze kolonie. Zamrożony wywar drożdży PJ69-4A należy przygotować przez zawieszenie drożdży w wodzie lub pożywce wzrostowej, uzupełnienie DMSO do 7% i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
    2. Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5 ml kultury YPD w probówce hodowlanej o wymiarach 20 mm x 150 mm za pomocą sterylnego drewnianego aplikatora i hodować przez noc w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    3. Zaszczepić 50 ml YPD w 250 ml sterylnej kolby Erlenmeyera z 4 ml nocnej kultury szczepu drożdży PJ69-4A. Hodować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C, 200 obr./min do gęstości optycznej (OD600) około 1,2, określonej za pomocą spektrofotometrii przy standardowej ścieżce światła wynoszącej 1 cm. Wzrost trwa zwykle 5 - 7 godzin.
    4. Wyizolować drożdże przez sedymentację w 50 ml stożkowej probówki o stężeniu 4,696 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w wirówce stołowej. Usunąć supernatant przez wrzucenie go do odpadów płynnych. Za pomocą pipety ponownie zawiesić osad w 5 ml buforu transformacyjnego i przenieść do 15 ml stożkowej probówki. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić drożdże w 1 ml końcowej objętości buforu transformacyjnego za pomocą pipety o pojemności 1000 μl.
    5. Inkubować komórki drożdży przez 60 minut w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min, a następnie umieścić na lodzie na 30 - 90 minut.
  2. Transformacja plazmidu drożdży.
    1. Do 1,5 ml sterylnej probówki do mikrowirówki dodać 1 μg plazmidu na bazie pTEF-GBD i 5 μl 10 mg/ml roztworu DNA nośnika plemników łososia. Dołącz również probówkę zawierającą tylko DNA nośnika nasienia łososia jako negatywną kontrolę transformacji. Dodać pipetą 100 μl lodowatej zawiesiny komórek drożdży do każdej probówki. Dodać 100 μl 70% roztworu PEG za pomocą pipety 1000 μl i delikatnie wymieszać, przesuwając probówkę 5 - 10 razy (nie wirować).
    2. Inkubować w temperaturze 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 45 min.
    3. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 15 min.
    4. Osad w mikrowirówce o sile 845 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, odpipetować i wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 150 μl sterylnej wody, pipetując w górę i w dół, i rozprowadzić na powierzchni płytki CSM-Trp.
    5. Umieścić płytki prawą stroną do góry w inkubatorze o temperaturze 30 °C i inkubować przez 2-3 dni, aż kolonie będą widoczne. Płytki można odwrócić do góry nogami, aby uniknąć kondensacji pary wodnej na powierzchni płytki po inkubacji w temperaturze 30 °C przez 6–12 godzin.
    6. Weź 2-3 kolonie na transformację i nałóż plaster na płytkę CSM-Trp za pomocą sterylnej wykałaczki. Pozostawić do wyrośnięcia na 24 godziny w temperaturze 30 °C.
  3. Wytwarzaj lizaty do ekspresji białka.
    1. Zaszczepić 3 ml płynnej pożywki CSM-Trp drożdżami wielkości główki zapałki z plastra i rosnąć przez noc w temperaturze 30 °C w probówce hodowlanej o wymiarach 20 mm x 150 mm, wytrząsając z prędkością 200 obr./min. Wykonaj dwie nocne kultury na przynętę i opróżnij wektor pTEF-GBD.
    2. Dodaj 1 ml YPD do każdych 3 ml nocnej hodowli CSM-Trp. Rosnąć przez 1 godzinę w temperaturze 30 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min. Sprawdź średnicę zewnętrzną komórek za pomocą spektrofotometru.
    3. Osadzaj równoważną liczbę komórek, normalizując się zgodnie z OD. Użyć sterylnych 1,5 ml probówek do mikrowirówek z 5-minutowym wirowaniem w temperaturze pokojowej 2,348 x g w temperaturze pokojowej w mikrowirówce. Użyć pipety, aby usunąć supernatant. Końcowe stado odpowiada minimum 2,1 OD.
      UWAGA: Przy obliczaniu równoważnej liczby komórek może się zdarzyć, że mogą być wymagane różne objętości z każdej hodowli przez noc, aby osiągnąć minimalny 2,1 OD.
    4. Zawiesić osad w 450 μl 0,2 M NaOH, pipetując w górę i w dół. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odwirować komórki przez 2 minuty przy 2,348 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant za pomocą pipety.
    5. Zawiesić osad w 50 μl buforu TWIRL, ostrożnie pipetując w górę i w dół, aby nie powstały pęcherzyki. Podgrzewać próbkę przez 5 minut w temperaturze 70 °C.
  4. Sprawdź ekspresję białka za pomocą SDS-PAGE.
    1. Użyj żelu gradientowego o stężeniu 4 - 20%, aby zapewnić rozdzielczość w szerokim zakresie mas cząsteczkowych. Załaduj równoważną ilość (ten sam OD) próbek do żelu SDS-PAGE i upewnij się, że dołączyłeś co najmniej jedną próbkę zawierającą niezmodyfikowany wektor pTEF-GBD13,14,15.
    2. Po separacji elektroforetycznej przenieś żel do nitrocelulozy i immunoblot za pomocą przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych anty-myc i roztworu do wykrywania ECL (Rysunek 3).

4. Test samoaktywacji

  1. Drożdże MATalpha należy rozprowadzić w temperaturze -80 °C odpowiadającej szczepowi, w którym znajduje się biblioteka ofiar będących przedmiotem zainteresowania, na płytkę YPD, biorąc sterylny drewniany aplikator, zeskrobując niewielką ilość drożdży z fiolki i rozprowadzając je po płytce YPD. Inkubować płytkę YPD w temperaturze 30 °C przez 2 dni lub do momentu, gdy widoczne będą pojedyncze kolonie. Umieścić kilka pojedynczych kolonii na płytce YPD i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C.
    UWAGA: Nowy szczep opracowany tutaj do przechowywania biblioteki zdobyczy jest PLY5725, podczas gdy niektóre kompatybilne dostępne na rynku biblioteki Y2H są umieszczone w Y187.
  2. Postępuj zgodnie z procedurami opisanymi w 3.3.1 - 3.3.4, aby przekształcić PLY5725 z plazmidem opartym na LEU2 używanym do przechowywania żądanej biblioteki zdobyczy. Dla opracowanych tutaj bibliotek odpowiednim plazmidem jest pGal4AD (pPL6343). Aby odzyskać transformanty drożdżowe, należy je ułożyć na płytkach CSM-Leu-Met. Po wytworzeniu kolonii rozprowadzić smugi w postaci plam na płytce CSM-Leu-Met i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 30 °C.
  3. Postępuj zgodnie z protokołem w 3.4, aby potwierdzić ekspresję pustego wektora pPL6343 za pomocą przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych anty-HA i roztworu do wykrywania ECL.
  4. Każdą z przekształconych drożdży PJ69-4A należy ułożyć na krzyż z PLY5725 konstruktami na płytce YPD, u której potwierdzono ekspresję białka w sekcji 3.4 i 4.3 protokołu, a następnie inkubować w temperaturze 30 °C przez noc. Weź 1 mm3 komórek, w których oba szczepy rosły razem, i nałóż na osobne płytki CSM-Leu-Met, CSM-Trp i CSM-Trp-Leu i hoduj 24 godziny
    UWAGA: Pożądane diploidy będą rosły na płytkach CSM-Trp-Leu. Wzrost na płytkach CSM-Leu-Met i CSM-Trp służy jako pozytywna kontrola wzrostu drożdży.
  5. Hodować diploidy w 1 ml pożywki CSM-Trp-Leu przez noc w temperaturze 30 °C. Osadzać 500 μl komórek w 1,5 ml probówki do mikrowirówki przy 2,348 x g, 3 minuty w temperaturze pokojowej w mikrowirówce. Odrzucić supernatant pipetą. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml sterylnej wody i powtórzyć sedymentację i ponowne wywieszenie. Sprawdź OD600 komórek.
  6. Wykonać serię seryjnych rozcieńczeń każdej zawiesiny komórek w stosunku 1:10, używając sterylnej wody z najbardziej stężonym roztworem wyjściowym każdego z nich o średnicy zewnętrznej 0,5. Umieścić 5 μl każdego rozcieńczenia na płytce CSM-Leu-Trp, płytce CSM-Leu-Trp-His i płytce CSM-Leu-Trp-His+3AT. Inkubować w temperaturze 30 °C i sprawdzać wzrost codziennie przez 3 dni (Rysunek 4).
    UWAGA: W przypadku rozcieńczania seryjnego 1:10 należy odpipetować 10 μl probówki zawierającej OD 0,5 do 90 μl wody i wymieszać, pipetując w górę i w dół. Kontynuuj wykonywanie seryjnych rozcieńczeń w stosunku 1:10, aż do uzyskania łącznie sześciu różnych stężeń.

5. Tworzenie populacji drożdży za pomocą biblioteki przynęt i zdobyczy

UWAGA: Szczep Y187, który zawiera komercyjne plazmidy z biblioteki zdobyczy, nie kojarzy się dobrze. W związku z tym do utrzymania złożoności biblioteki wymagane są następujące zoptymalizowane warunki. Szczep PLY5725 zawierający biblioteki zdobyczy Y2H lepiej się łączy i ta sama procedura krycia może być stosowana z tym szczepem (Rysunek 5).

  1. Zaszczepić 3 ml kultur każdego z transformantów PJ69-4A przenoszących różne plazmidy przynęty pTEF-GBD zawierające TRP1 w pożywce CSM-Trp w probówce hodowlanej. Włączyć dwie oddzielne kultury zawierające sam plazmid wektorowy pTEF-GBD, które służą jako kontrole proceduralne. Inkubować kultury w temperaturze 30 °C, 200 obr./min przez 6 godzin, a następnie rozcieńczyć do 25 ml kultury w sterylnej kolbie Erlenmeyera do wzrostu przez noc.
  2. Rozmrozić zamrożoną (-80 °C) fiolkę z komórkami MATalpha zawierającą bibliotekę "ofiar" przenoszącą LEU2 w temperaturze pokojowej. Zaszczepić 125 ml pożywki CSM-Leu-Met w sterylnej kolbie Erlenmeyera z całą rozmrożoną fiolką. Uprawiaj wszystkie kultury przez noc w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    UWAGA: OD600 kultur nocnych musi mieścić się w zakresie od 1,0 do 1,5 przed przejściem do kolejnych kroków.
  3. Odwirować 21 ekwiwalentów OD każdej z kultur transformacyjnych PJ69-4A z 5-minutowym wirowaniem przy 4,696 x g w temperaturze pokojowej. Na każde 10 pożądanych reakcji kojarzenia należy umieścić 39 OD600 równoważników szczepu MATalpha przenoszącego plazmidy biblioteczne w oddzielnych 50 ml stożkowych probówek.
    1. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml sterylnej wody i ponownie zagnieździć w nowej 50 ml stożkowej probówki 4,696 x g 5 min w temperaturze pokojowej w wirówce stołowej. Za pomocą pipety delikatnie usunąć supernatant, nie naruszając granulowanych komórek.
    2. Zawiesić osady komórek PJ69-4A w 4 ml i PLY5725 komórki w 10 ml bYPDA (pH 3,7).
  4. Aby ustawić reakcje kojarzenia, dodaj 1 ml komórek transformowanych PJ69-4A, 1 ml komórek zawierających bibliotekę MATalpha i 1 ml bYPDA pH 3,7 do nowych 50 ml stożkowej probówki. Inkubować w temperaturze 30 °C z delikatnym mieszaniem orbitalnym (100 - 130 obr./min) przez 90 min.
    1. Wirować komórki przez 5 minut przy 4,696 x g, w temperaturze pokojowej w wirówce stołowej. Usunąć supernatant pipetą i ponownie zawiesić osad w 2 ml 1:1 bYPDA:YPD. Umieścić wszystkie 2 ml na 100 mm płytce YPD za pomocą pipety i inkubować w temperaturze 30 °C przez około 20 godzin.
  5. Zebrać komórki z płytek YPD za pomocą skrobaka do komórek, aby przemieścić komórki do 2 - 3 ml pożywki CSM-Leu-Trp. Pipetą przemieszczono komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać płytki 4 - 5 razy za pomocą 2 - 3 ml pożywki CSM-Leu-Trp, pipetując pożywkę za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i delikatnie wyrzucając pożywkę po powierzchni płytki YPD.
    1. Wirować komórki przez 5 minut przy 4,696 x g w temperaturze pokojowej w wirówce stołowej. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w 40 ml pożywki CSM-Leu-Trp, pipetując w górę i w dół (nie wirować).
  6. Aby oszacować liczbę utworzonych komórek diploidalnych, należy rozcieńczyć 4 μl mieszaniny diploidalnej na 200 μl i 2000 μl pożywki CSM-Trp-Leu. Umieścić 200 μl każdego rozcieńczenia na płytce CSM-Leu-Trp.
    UWAGA: Dwie płytki reprezentują 1:10 000 i 1:100 000 krotne rozcieńczenie zebranego stada diploidów i dające oczekiwane ~9 000 - 27 000 kolonii na płytce rozcieńczonej 1:10 000 po inkubacji w temperaturze 30 °C przez 36 - 40 godzin. Sprawdź tabliczki znamionowe po kroku 5.7. Aby przejść do kroku 5.8, wymagana jest minimalna liczba 200 kolonii na płytce rozcieńczającej w stosunku 1:10 000
  7. Natychmiast pobrać pozostałą część z każdych 40 ml zawiesiny komórek i zaszczepić 1 000 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 500 ml pożywki CSM-Leu-Trp. Weź początkowy OD600. Inkubować te kolby w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 180 obr./min, aż osiągną nasycenie (~2,0 OD/ml). Zazwyczaj trwa to około 36 - 40 godzin. Monitoruj wzrost po 24 godzinach, a następnie ponownie po 36 godzinach przez OD600.
  8. Za pomocą pipety usunąć 20 ml podwielokrotności z każdej z nasyconych 500 ml kultur i zatruć 2 000 ml kolb Erlenmeyera, z których jedna zawiera 750 ml pożywki CSM-Leu-Trp, a druga 750 ml CSM-Leu-Trp-His o najniższym poziomie 3AT eliminującym tło (poprzednio określonym w sekcji 4.5). Dobrze wymieszaj nowe kultury (770 ml) przez wirowanie i weź początkowy OD600.
  9. Inkubować kultury w temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 180 obr./min, aż do osiągnięcia nasycenia, które zwykle następuje w ciągu 24 godzin w przypadku niewyselekcjonowanej kultury CSM-Leu-Trp i może zająć ponad 70 godzin w przypadku kultur poddanych selekcji pod kątem interakcji Y2H.
  10. Gdy kultury osiągną nasycenie (OD ~ 2,0), usunąć 11 ml pipetą, osadzać komórki w 5-minutowym wirowaniu przy 4,696 x g w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant za pomocą pipety i zamrozić w temperaturze -20 °C lub kontynuować ekstrakcję DNA. Zarówno wybrane, jak i niewybrane próbki zostaną wykorzystane do głębokiego sekwencjonowania.

6. Przygotowanie próbki do głębokiego sekwencjonowania DEEPN

  1. Ekstrakcja DNA.
    1. Za pomocą pipety ponownie zawiesić granulki komórek z sekcji 5.7 protokołu w 500 μl buforu sTE i przenieść do 1,5 ml probówki mikrowirówkowej. Dodać 3 μl betamerkaptoetanolu i 10 μl bulionu z zymolazy. Dobrze wymieszać i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 24-36 godzin.
    2. Ekstrahować próbkę dwukrotnie za pomocą 500 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego, używając dygestoria class16.
    3. Dodać 7 μl 4 M NaCl, 900 μl lodowatego 100% etanolu (ETOH), wymieszać przez inwersję i albo zamrozić w temperaturze -20 °C, albo kontynuować osadzanie DNA przez wirowanie w temperaturze 21 130 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w mikrowirówce.
    4. Odrzucić supernatant pipetą. Umyj granulat trzykrotnie 900 μl 70% ETOH.
    5. Osad 21,130 x g przez 2 min i usunąć resztki ETOH płukane pipetą. Suszyć granulat przez 7 minut w temperaturze 42 °C.
    6. Zawiesić osad w 120 μl 0,1x sTE w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 90 minut, przesuwać probówki do mieszania co 30 minut.
    7. Odpipetować 60 μl wyekstrahowanego DNA do sterylnej 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Dodać 120 μl sTE, 3,5 μl bulionu RNazy A, przetrzeć do wymieszania i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    8. Osad etanolu należy wytrącić jak poprzednio w sekcji 6.1.3 - 6.1.5, ale użyć 7 μl 5 M octanu amonu zamiast 4 M NaCl.
    9. Zawiesić DNA poddane działaniu RNazy A w 55 μl 0,1x sTE w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 90 minut, przesuwać probówki do mieszania co 30 minut. Określić ilościowo DNA przez absorbancję przy 260 nm na spektrofotometrze.
  2. Wstawki cDNA PCR.
    1. Wykonaj dwie reakcje PCR po 50 μl na próbkę DNA. Każda reakcja zawiera 25 pmol każdego startera do przodu i do tyłu pasującego do plazmidu z biblioteki ofiar (patrz materiały). Reakcje zawierają również 25 μl High-Fidelity 2x PCR Master Mix, 5 μg próbki DNA i wodę do 50 μl. Amplifikuj reakcje przez 25 cykli z czasem przedłużenia 3 min w temperaturze 72 °C, temperaturze wyżarzania 55 °C przez 30 s i denaturacji w temperaturze 98 °C przez 10 s. Cykl należy poprzedzić 30-sekundową denaturacją w temperaturze 98 °C, a następnie 5-minutową inkubacją w temperaturze 72 °C.
    2. Przeanalizować 4 μl każdej reakcji PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym DNA z żelem agarozowym DNA zawierającym 0,2 - 0,5 μg/ml EtBr17. Wizualizacja próbki DNA za pomocą transoświetlenia UV. Próbki pokażą rozmaz DNA około 1 - 3 kb, gdzie wzór prążkowania można znaleźć dla próbek, w których wybrano interakcję Y2H (Rysunek 6).
    3. Połączyć zduplikowane próbki PCR i oczyścić je za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta i określić ilościowo DNA przez absorbancję przy 260 nm na spektrofotometrze.

7. Głębokie sekwencjonowanie

UWAGA: Przygotowanie próbki i sekwencjonowanie na platformie do głębokiego sekwencjonowania jest zazwyczaj dostępne w komercyjnych i akademickich obiektach do sekwencjonowania DNA.

  1. Ścinanie 600 ng produktu PCR za pomocą wysokowydajnego ultrasonografu, aby uzyskać fragmenty o średniej długości ~300 pz.
  2. Generuj indeksowane biblioteki sekwencjonowania za pomocą zestawu przygotowawczego do głębokiego sekwencjonowania, który dodaje łączniki kodujące kody kreskowe, miejsca primingu i sekwencje przechwytywania asymetrycznie na końcach fragmentów DNA.
  3. Przygotowanie biblioteki należy wykonać zgodnie z instrukcjami producenta. Puluj indeksowane biblioteki i sekwencjonuj jako długie odczyty sparowanych końców na platformie głębokiego sekwencjonowania (np. odczyty PE 2 x 150 bp). Pożądana liczba odczytów docelowych dla każdej próbki wynosi od 10 do 40 milionów, przy czym więcej odczytów jest pożądanych dla niewybranych populacji, które są zwykle bardziej złożone. Zalecamy co najmniej 20 milionów lub więcej odczytów dla niewybranych populacji.

8. Przetwarzanie i weryfikacja bioinformatyczna

  1. Przetwarzanie danych sekwencjonowania DNA w postaci fastq za pomocą zestawu samodzielnych programów komputerowych zbudowanych w celu (1) mapowania plików odczytu sekwencji w uniwersalnym formacie SAM, (2) ilościowego określania wzbogacenia genów między zestawami danych, (3) przeprowadzania analizy statystycznej danych w celu uszeregowania, które geny kandydujące są dodatnie dla interakcji Y2H, (4) dostarczania informacji o tym, jakie regiony i jaka rama translacyjna każdego z ofiar cDNA na fragmenty genu, które dają dodatnie Y2H interakcje, które (5) dostarczają narzędzi do rekonstrukcji nie tylko końca 5', ale także końca 3' oddziałujących fragmentów, umożliwiając ich rekonstrukcję i weryfikację w tradycyjnym formacie Y2H. Działanie tych programów jest szczegółowo opisane w załączonym badaniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test Y2H był szeroko stosowany do wykrywania oddziaływań białko-białko i opracowano dla niego szereg adaptacji oraz systemów. W większości przypadków te same kwestie, które pomagają zapewnić sukces w poprzednich podejściach, są istotne również dla DEEPN. Do najważniejszych punktów odniesienia należą: zapewnienie ekspresji białek fuzyjnych domeny wiążącej DNA, zapewnienie niskiego tła nieswoistego wzrostu His+ w diploidach zawierających badaną przynętę z pustym plazmidem ofiary, wysoka wyd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj przedstawiamy przewodnik, jak wykonywać testy Y2H w partiach przy użyciu zoptymalizowanych metod. W procedurze składa się kilka krytycznych kroków, które mają pomóc w zapewnieniu, że populacja drożdży, która zostanie poddana selekcji, jest reprezentatywna dla biblioteki wyjściowej i że wystarczająca ilość początkowej populacji drożdży zostanie wykorzystana do poddania selekcji w celu ograniczenia zmienności. Co ważne, te punkty odniesienia są stosunkowo łatwe do osiągnięcia wraz z dostosowaniem metod i materiałów d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Dziękujemy pracownikom Instytutu Genetyki Człowieka za przygotowanie biblioteki NGS i sekwencjonowanie. Dziękujemy Einat Snir za jej doświadczenie w przygotowywaniu fragmentów biblioteki genomowej dla wykonanej tutaj biblioteki plazmidów Y2H. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 oraz przez NSF Research Project Grant: 1517110.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Illumina HiSeq 4000Platforma głębokiego sekwencjonowaniaIllumina
Przeciwciała monoklonalne anty-HABiolegend901514Przeciwciało pierwotne do wykrywania ekspresji HA w konstruktach pGal4AD
Poliklonalne przeciwciała anty-mycQED Biosciences Inc18826Przeciwciało pierwotne do wykrywania ekspresji MYC w konstruktach pTEF-GBD
NarINew England BioLabsR0191S
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
BamHI-HFNew England BioLabsR3236S
XhoINew England BioLabsR0146S
Glikol polietylenowy 3350, proszekJ.T. BakerU2211-08
DNA plemników łososiaTrevigen, Inc sprzedawane przez Fisher Scientific50-948-286DNA nośnika do przemiany drożdży, sekcja 3.2.1.
Monosiarczan kanamycynyMiędzynarodowe Produkty BadawczeK22000
LE AgarozaGeneMateE-3120-500używany do produkcji żeli agarozowych DNA
Chlorek soduProducts InternationalS23025
TryptoneResearch Products InternationalT60060
D-SorbitolResearch Products InternationalS23080
Octan litu dwuwodnyMP Biomedicals155256
Chlorek wapniaThermoFisherC79
EDTA Sól sodowaProdukty badawcze InternationalE57020
Ekstrakt drożdżowy w proszku Produktybadawcze InternationalY20020
Drożdżowa zasada azotowa (siarczan amonu) bez aminokwasówResearch Products InternationalY20040
CSM-TRP-LEU+40ADEFormediumDCS0789
CSM-TRP-Leu-His+40ADEFormediumDCS1169
CSM-Leu-MetFormediumDCS0549
CSM-TRP-MetBio 101, Inc4520-922
L-MetioninaFormediumDOC0168
AdenineResearch Products InternationalA11500
D-(+)-GlucoseResearch Products InternationalG32045
Bacto AgarBD214010używany do wytwarzania płytek z mediami w sekcji 1
PeptoneResearch Products InternationalP20240
3-amino-1,2,4 TriazoleSigmaA8056
2- Merkaptoehanol (BME)Sigma-AldrichM6250
Zymoliaza 100TUSBiologicalZ1004
Fosforan potasu dwuzasadowySigmaP8281
Fenol:Chloroform:IAAAmbionAM9732
Octan amonuSigma-Aldrich238074
EtanolDecon Laboratories, INC2716
RNAse AThermoFisherEN0531
MocznikProducts InternationalU20200
SDSResearch Products InternationalL22010
glicerolSigma AldrichG5516
Tris-HClGibco15506-017
błękit bromofenolowyAmresco449
Gibson Assembly Cloning KitNew England BiolabsE5510SMetoda szybkiego montażu do klonowania plazmidów w sekcji 2
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541SUżywany do amplifikacji produktów do montażu Gibsona w sekcji 2.3, a także przygotowania próbki do głębokiego sekwencjonowania DEEPN w sekcji 6.2.1
Bromek etydynyAmresco0492-5G
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104Używany do oczyszczania produktów PCR w sekcji 6.2.3
Zestaw do ekstrakcji żelu DNAQiaquick Qiagen28704Używany do oczyszczania strawionego pTEF-GBD w sekcji 2.1
Zestaw KAPA Hyper PrepZestaw przygotowawczy KAPA BiosystemsKK8500do głębokiego sekwencjonowania
Optymalizacja kodonówhttp://www.jcat.de
Optymalizacja kodonówhttps://www.idtdna.com/CodonOpt
Zintegrowane technologiegBlocksFragmenty DNA użyte do klonowania w sekcji 2.2
CiągiFragmenty DNA Thermofisherużyte do klonowania w sekcji 2.2
Zestaw mini-przygotowania plazmidowego DNA GenCatchEPOCH Nauki PrzyrodniczeUżywany do przygotowania ilości DNA w sekcji 2.3
Covaris E220Wysokowydajny ultrasonografCovaris
oligo nucelotyd 5'- CGGTCTT
CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'		Zintegrowane technologie DNA lub Thermofisherużywane do amplifikacji i sekwencjonowania pcr 5' wstaw pTEF-GBD podczas budowy plazmidu
oligo nucelotyd 5'-GAGTAACG
ACATTCCCAGTTGTTC-3'		Zintegrowane technologie DNA lub Thermofisherużywane do amplifikacji i sekwencjonowania pcr 5' wstaw pTEF-GBD podczas budowy plazmidu
oligo nucelotyd 5'-CACCGTAT
TTCTGCCACCTCTTCC-3'		Zintegrowane technologie DNA lub Thermofisherużywane do amplifikacji i sekwencjonowania pcr 3' wstawka pTEF-GBD podczas budowy plazmidu
oligonunilotyd 5'-GCAACCGC
ACTATTTGGAGCGCTG-3'		Zintegrowane technologie DNA lub Thermofisherużywane do amplifikacji i sekwencjonowania pcr 3' wstaw pTEF-GBD podczas budowy plazmidu
oligonukleotyd 5'-GTTCCGATG
CCTCTGCGAGTG-3'		Integrated DNA Technologies lub Thermofisher5' Pimer używany do amplifikacji insercji
oligonucelotydu pGAL4AD 5'-GCACATGCT
AGCGTCAAATACC-3'		Integrated DNA Technologies lub Thermofisher3' Pimer używany do amplifikacji insercji
oligonucelotydu pGAL4AD 5'-ACCCAAGCA
GTGGTATCAACG-3'		Integrated DNA Technologies lub Thermofisher5' Pimer używany do amplifikacji insercji
oligonucelotydu pGADT7 5'- TATTTAGA
AGTGTCAACAACGTA -3'		Zintegrowane technologie DNA lub Thermofisher3' Pimer używany do amplifikacji insercji szczepu drożdży pGADT7
PJ69-4A MatAhttp://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Biblioteki genomiczne i szczep gospodarza przeznaczony do wysoce wydajnej selekcji dwóch hybryd w drożdżach. GENETYKA 1996 144:1425-1436MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7
pTEF-GBDDr. Robert Piper LabGal4-DNA wiążący plazmid ekspresji doimain
ekspresji pGal4AD (pPL6343)Dr. Robert Piper Lab Plazmidekspresji domeny aktywacji Gal4
100 mm szalki PetriegoKord-Vallmark sprzedawany przez VWR2900
125 ml PYREX Kolba ErlenmeyeraFisher ScientificS63270
250 ml PYREX Kolba ErlenmeyeraFisher ScientificS63271
1,000 ml PYREX Kolba ErlenmeyeraFisherScientific S63274
2,000 ml PYREX Kolba ErlenmeyerFisher ScientificS63275
20 X 150 mm Jednorazowa probówka hodowlanaThermofisher14-961-33
Pipetaserologiczna Drummond4-000-100
5 ml DenvilleP7127
10 ml Pipeta serologicznaDenvilleP7128
25 ml Pipeta serologicznaDenvilleP7129
1 000 ml PYREX Zlewka GriffinFisher Scientific02-540P
1 000 ml PYREX Butelka do przechowywania nośników wielokrotnego użytkuFisher Scientific06-414-1D
Butla z podziałką 1,000 mlFisher Scientific08-572-6G
SpectraMax 190Urządzenia molekularnesłużące do pomiaru gęstości optycznej komórek
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000Spektrofotometr służący do ilościowego oznaczania ilości DNA
Elektroniczne UV transilluminatorUltra LumMEB 20służy do wizualizacji DNA w żelu agarozowym z bromkiem etydyny
P1000 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123602G
P200 Gilson PIPETMANFisher ScientificF123601G
P10 Gilson PIPETMANFisher ScientificF144802G
1250 i mikro; L Końcówki do pipet o niskiej retencjiGeneMateP-1236-1250
200 µ Końcówki do pipet LLow VWR10017-044
10 µ Końcówki do pipet L XL o niskiej retencji VWR10017-042
Rurka stożkowa 50 mlVWR490001-627
Rurka stożkowa 15 mlSkrobak do komórek VWR490001-621
DenvilleScientificTC9310
1,5 ml Probówki do mikrowirówekUSA Scientific1615-5500
HClFluka Analytical318949-1L
NaOHJ.T. Baker5674-02
Aplikatory drewnianeSolon Care55900
Mikrowirówka Eppendorf 5424Fisher Scientific05-400-005mikrowirówka
Sorvall ST16RThermo Fisher Scientific75004381wirówka stołowa
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (od osła)GE Opieka zdrowotnaNA934-1MLPrzeciwciało wtórne
Amersham ECL Mysie IgG, całe Ab sprzężone z HRP (od owiec)GE HealthcareNA931-1MLPrzeciwciało wtórne
SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjneThermo Fisher Scientific34080Roztwór do wykrywania ECL
Inkubator Isotemp Inkubatornaukowy Thermo Fisher Mutitron
2INFORS HTInkubator z wytrząsaniem
Kąpiel wodna Isotemp Digital-Control Model 205Fisher Naukowakąpiel wodna
Y2H mysza biblioteka cDNA w Y187 (tkanka pana)Clontech630482dostępna na rynku biblioteka cDNA
Y2H mysia biblioteka cDNA w Y187 (mózg myszy)Clontech630488dostępna na rynku biblioteka cDNA
pGADT7 AD WektorClontech630442dostępny na rynku wektor AD zawierający wiele bibliotek cDNA
pGBKT7 Wektor DNA-BDClontech630443dostępny na rynku wektor DNA-BD
Biolase Polimeraza DNABiolinePolimeraza DNA BIOLINE BIO-21042stosowana w sekcji 2.4
GeneMate GCL-60 Thermal CyclerBioExpressP-6050-60do pcr
TempAssure 0,5 ml probówki PCRAmerykański Naukowy1405-8100
Research Research DNA w sekcji 7 P20 Gilson PIPETMAN Fisher Scientific F123600G maszyna

Bibliografia

  1. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  2. Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  3. Vidal, M., Fields, S. The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years. Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).
  4. Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
  5. Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
  6. Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
  7. Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).
  8. Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
  9. Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements. Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).
  10. Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins. Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).
  11. James, P., Halladay, J., Craig, E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).
  12. Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).
  14. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  15. Alegria-Schaffer, A. Western blotting using chemiluminescent substrates. Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).
  16. Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from: http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/ (2018).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).
  18. Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. Cell. 75 (4), 805-816 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interakcje bia ko bia kometoda DEEPNg bokie sekwencjonowaniekonstrukcja plazmidu przyn typrzygotowanie biblioteki ofiarreakcje kojenia dro d yprotok ekstrakcji DNAamplifikacja PCRprzetwarzanie bioinformatyczne
Badanie przesiewowe drożdży 2-hybrydowych w partii w celu porównania interakcji białek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.