Artykuł metodologiczny

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

DOI:

10.3791/57804

⸱

17 lipca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiological Sciences, Eastern Virginia Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otyłości towarzyszy rozległa przebudowa tkanki tłuszczowej, głównie poprzez przerost adipocytów. Ekstremalny wzrost adipocytów powoduje słabą reakcję na insulinę, miejscowe niedotlenienie i stan zapalny. Stymulując różnicowanie funkcjonalnych białych adipocytów od progenitorów, można zapobiec radykalnemu przerostowi populacji adipocytów, a w konsekwencji poprawić zdrowie metaboliczne tkanki tłuszczowej wraz ze zmniejszeniem stanu zapalnego. Ponadto, stymulując różnicowanie beżowo-brązowych adipocytów, można zwiększyć całkowity wydatek energetyczny organizmu, co skutkuje utratą wagi. Takie podejście może zapobiec rozwojowi chorób współistniejących związanych z otyłością, takich jak cukrzyca typu 2 i choroby układu krążenia.

Ten artykuł opisuje izolację, ekspansję i różnicowanie białych i beżowych adipocytów z podzbioru ludzkich komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej, które wykazują współekspresję markerów CD31 i CD34. Metoda jest stosunkowo tania i nie jest pracochłonna. Wymaga dostępu do ludzkiej tkanki tłuszczowej, a magazyn podskórny nadaje się do pobrania próbek. Na potrzeby tego protokołu podczas zabiegów chirurgii bariatrycznej pobierane są świeże próbki tkanki tłuszczowej od osób z chorobliwą otyłością [wskaźnik masy ciała (BMI)) >35]. Stosując sekwencyjną immunoseparację od zrębowej frakcji naczyniowej, wystarczająca ilość komórek jest wytwarzana z zaledwie 2-3 g tłuszczu. Komórki te mogą być namnażane w hodowli przez 10–14 dni, mogą być kriokonserwowane i zachowują swoje właściwości adipogenne przy pasażowaniu do pasażu 5–6. Komórki są traktowane przez 14 dni koktajlem adipogennym przy użyciu kombinacji insuliny ludzkiej i agonisty PPARγ-rozyglitazonu.

Ta metodologia może być wykorzystana do uzyskania eksperymentów potwierdzających słuszność koncepcji na temat mechanizmów molekularnych, które napędzają reakcje adipogenne w komórkach śródbłonka tłuszczowego, lub do badania przesiewowego nowych leków, które mogą wzmocnić odpowiedź adipogenną skierowaną na różnicowanie białych lub beżowo-brązowych adipocytów. Wykorzystując małe biopsje podskórne, metodologia ta może być wykorzystana do odsiewania osób, które nie odpowiedziały na leczenie, do badań klinicznych mających na celu stymulację beżowo-brązowych i białych adipocytów w leczeniu otyłości i chorób współistniejących.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie dowody pokazują, że zarówno u myszy, jak i u ludzi, podzbiór komórek rezydujących w unaczynieniu tkanki tłuszczowej może być zróżnicowany na białe lub beżowo-brązowe adipocyty1,2,3. Fenotyp takich komórek jest przedmiotem kontrowersji, z dowodami potwierdzającymi komórki śródbłonka, mięśnie gładkie/perycyty lub spektrum fenotypów pośrednich4,5,6,7. Celem opracowania tej metodyki było przetestowanie potencjału adipogennego komórek śródbłonka CD34+CD31+ wyizolowanych z różnych magazynów tłuszczu od otyłych ludzi. Inne badania w literaturze koncentrują się na potencjale adipogennym całkowitej frakcji naczyniowej zrębu lub znanych progenitorów adipocytów2,8,9. Ponieważ obecnie istniejące technologie mogą celować w komórki śródbłonka tkanki tłuszczowej w celu dostarczania leków10, zrozumienie potencjału takich komórek do ulegania indukcji adipogennej w kierunku białych lub beżowych adipocytów jest ważne dla przyszłych terapii celowanych.

Różne grupy zgłosiły kombinację markerów CD31 i CD34 jako substytutów do izolacji komórek śródbłonka z ludzkiej tkanki tłuszczowej11,12,13. Zazwyczaj izolację wykonuje się za pomocą dwóch kolejnych kroków i pozytywnej selekcji za pomocą kulek magnetycznych. W tym raporcie wykorzystano immunoseparację za pomocą kulek magnetycznych CD34+ w połączeniu z plastikowymi kulkami CD31. Stwierdziliśmy, że ta technika jest lepsza od sekwencyjnej immunoseparacji magnetycznej pod względem zachowania typowej morfologii śródbłonka kostki brukowej. Byliśmy również w stanie wygenerować wystarczającą ilość komórek potrzebnych do ekspansji i indukcji adipogennej, zaczynając już od 1-2 g tłuszczu. Biopsja małej próbki podskórnej tkanki tłuszczowej wystarcza do wytworzenia wymaganej ilości komórek do dalszych zastosowań. Ten aspekt jest potencjalnie ważny, szczególnie jeśli metoda ta będzie wykorzystywana do badań przesiewowych pod kątem reakcji na indukcję adipogenną u ludzi.

W przeciwieństwie do innych systemów opisywanych w literaturze, ta metoda wykorzystuje tylko dwa składniki do adipogennej indukcji komórek CD34+CD31+: agonistę PPARγ - rozyglitazon - oraz ludzką insulinę. Co ważne, ilość użytej insuliny mieści się w normalnym/wysokim zakresie krążącej insuliny poabsorpcyjnej u ludzi14. Stopień reakcji komórek in vitro na insulinę, mierzony za pomocą fosforylacji Akt, nie koreluje z ich zdolnością do reagowania na koktajl indukcyjny. Co ciekawe, przy użyciu tego koktajlu indukcyjnego i warunków eksperymentalnych uzyskano mieszankę białych i beżowo-brązowych komórek, jak określono na podstawie wielkości i liczby wewnątrzkomórkowych kropelek lipidów oraz ekspresji markerów molekularnych. Ten prosty i ekonomiczny protokół indukcji wraz z ilościową oceną fenotypu komórek odpowiadających (biały vs. beżowy) pozwala na badanie przesiewowe czynników, które mogą potencjalnie zmienić równowagę zróżnicowanych adipocytów beżowo-białych.

Ta metoda dostarcza również podejścia translacyjnego do zrozumienia podstawowych mechanizmów adipogenezy komórek progenitorowych śródbłonka naczyniowego w ludzkiej tkance tłuszczowej. Korzystając z tej specyficznej techniki izolacji/różnicowania, badacze mogą badać różne szlaki odpowiedzialne za adipogenezę w podzbiorze komórek śródbłonka naczyń krwionośnych z różnych magazynów tłuszczu u szczupłych i otyłych ludzi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komisja Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej w Szkole Medycznej Wschodniej Wirginii zatwierdziła badania i pobieranie próbek ludzkiej tkanki tłuszczowej użytych w badaniu. Od pacjentów uzyskano świadomą pisemną zgodę.

1. Przygotowanie, mediów i instrumentów

  1. Przygotuj roztwór buforowany wodorowęglanem Krebsa Ringera (KRBBS): 135 mM chlorku sodu, 5 mM chlorku potasu, 1 mM siarczanu magnezu, 0,4 mM dwuzasadowego fosforanu potasu, 5,5 mM glukozy, 1 mM adenozyny, 0,01% mieszaniny antybiotykowo-przeciwgrzybiczej (50 μg/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny, 30 μg/ml gentamycyny, 15 ng/ml amfoterycyny) i 10 mM HEPES (pH = 7,4). Roztwór ten jest przygotowywany za każdym razem na świeżo w celu pobrania tkanek i trawienia.
  2. Przygotuj świeży roztwór kolagenazy: 1 mg/ml kolagenazy typu 1 w KRBSS; przygotuj 3 ml/g tłuszczu. Przed trawieniem tkanek podgrzej roztwór kolagenazy w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.
  3. Przygotuj bufor do izolacji komórek CD34: 2% płodowa surowica bydlęca (FBS) i 1 mM EDTA w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  4. Przygotuj pożywkę adipogenezy: DMEM/F12, 5% FBS, 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny, 1,25 μl/ml insuliny ludzkiej (5 μg/ml lub 144 mU/ml) i 0,36 μL/ml 2,8 mM rozyglitazonu (1 μM).
  5. Przygotować 0,3% roztwór podstawowy czerwieni olejowej (ORO) (wagowo-objętościowo), rozpuszczając 0,3 g ORO w 100 ml izopropanolu.

2. Izolacja frakcji naczyniowej zrębu tkanki tłuszczowej

UWAGA: Badanie obejmowało przekrojową kohortę chorobliwie otyłych osób z cukrzycą typu 2 (T2D) i bez cukrzycy, w wieku 18-65 lat, przechodzących operację bariatryczną w Sentara Metabolic and Weight Loss Surgery Center (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Kryteria wykluczenia obejmowały chorobę autoimmunologiczną, w tym cukrzycę typu 1, stany wymagające przewlekłego leczenia immunosupresyjnego, leki przeciwzapalne, tiazolinendiony, aktywne palenie tytoniu, przewlekłe lub ostre infekcje lub historię nowotworu złośliwego leczoną w ciągu ostatnich 12 miesięcy. T2D zdefiniowano jako stężenie glukozy w osoczu na czczo wynoszące 126 mg/dl lub większe, stężenie glukozy 200 mg/dl lub większe po 2-godzinnym teście tolerancji glukozy lub po zastosowaniu leków przeciwcukrzycowych.

  1. Pobrać ludzką tkankę tłuszczową (OM) i podskórną (SC) tkankę tłuszczową (AT) od ludzi poddawanych operacji bariatrycznej.
  2. Przechowywać OM i SC AT w oddzielnych fiolkach zawierających buforowany roztwór soli Hanka z 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny w temperaturze pokojowej natychmiast po ekstrakcji tkanek.
  3. Ostrożnie oczyść i usuń zwłókniałe i kauteryzowane odcinki tkanki za pomocą nożyczek i pęsety z 70% etanolu, gdy próbka dotrze do laboratorium po ekstrakcji tkanki.
  4. Zważ tkankę tłuszczową i podziel ją na 5 g (lub mniej) porcji w celu wytrawienia kolagenazy.
  5. Drobno zmielić 5 g AT w 5 ml roztworu kolagenazy w fiolce scyntylacyjnej w temperaturze pokojowej, używając dwóch par nożyczek.
  6. Dodaj dodatkowe 10 ml roztworu kolagenazy do tkanki mielonej, aby uzyskać łącznie 15 ml.
  7. Próbki trawić przez 1 godzinę, w temperaturze 37 °C, w łaźni wodnej z ciągłym wstrząsaniem.
  8. Odetnij końcówkę strzykawki o pojemności 20 ml, aby uzyskać koniec.
  9. Wytnij kwadrat o wymiarach 9 cm x 9 cm z siatki 250 μm i wepchnij go do połowy do stożkowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą strzykawki z końcem.
  10. Wlej próbki do strzykawki o pojemności 20 ml z końcem i przefiltruj przez nylonową siatkę 250 μm do stożkowej rurki o pojemności 50 ml, aby oddzielić adipocyty i komórki naczyniowe zrębu od niestrawionej tkanki.
    UWAGA: Nie używaj więcej niż 5 g AT na 50 ml stożkowej probówki, ponieważ siatka zostanie zatkana z powodu nadmiaru zwłókniałego niestrawionego materiału.
  11. Przepłukać fiolkę scyntylacyjną 10 ml KRBBS i przelać ją przez filtr w celu zebrania resztek komórek.
  12. Przefiltrowane próbki inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: Ten krok jest ważny, aby adipocyty unosiły się na górze rurki, a niektóre komórki naczyniowe zrębu osiadły na dnie probówki.
  13. Użyj strzykawki o pojemności 20 ml i igły do pipetowania 20 G x 6 cali, aby usunąć warstwę frakcji zrębu naczyniowego i przenieść ją do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  14. Dodać 10 ml KRBBS i pozostawić próbki na stole przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Powtórz kroki 2.12–2.14 dwukrotnie.
    Uwaga: Te kroki zapewnią, że nie dojdzie do zanieczyszczenia komórek naczyniowych zrębu pływającymi adipocytami.
  16. Frakcje naczyniowe zrębu z obu magazynów należy przechowywać na lodzie w celu dalszego przetwarzania, zgodnie z opisem w poniższych krokach.
    Uwaga: Nie pozostawiaj komórek na lodzie dłużej niż 1 godzinę, ponieważ może to mieć wpływ na żywotność komórek. Adipocyty można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania lub wykorzystać na świeżo do eksperymentów.

3. Izolacja komórek śródbłonka tkanki tłuszczowej

  1. Wirować frakcje naczyniowe zrębu (SVF) w temperaturze 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
  2. Wyjąć próbki z wirówki i ostrożnie wylać sklarowany nad osadem; zachować osad zawierający komórki SVF.
  3. Delikatnie zawiesić granulki komórek w 5 ml PBS.
    UWAGA: Jeśli więcej niż 5 g zapasu AT zostało przetworzone na wiele podwielokrotności (patrz krok 2.4), połącz ze sobą granulki komórek.
  4. Wirować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS i policzyć komórki.
    UWAGA: W tym przypadku do zliczania komórek użyto automatycznego licznika komórek. Żywotność komórek uzyskano przez zmieszanie 12 μl zawiesiny komórkowej z 12 μl roztworu pomarańczy akrydynowej/jodku propidyny (AO/PI) (patrz tabela materiałów). Średnia liczba komórek na gram AT dla każdego magazynu wynosi: a) OM Depot: 1,69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) Zajezdnia SC: 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. Rentowność ogniw z obu magazynów wynosiła >90%.
  6. Granulować próbki w temperaturze 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Protokół selekcji immunomagnetycznej CD34 (patrz tabela materiałów) został dostosowany do kroków 3.7–3.15.
  7. Zawiesić osad w 100 μl buforu izolacyjnego CD34.
    UWAGA: Całkowita liczba komórek wymaga następujących objętości rehisencji: a) <2 x 107 komórek: zawiesić osad w 100 μl; b) 2 x 108–5 x 108 komórek: ponownie zawiesić osad w 1 ml. W krokach 3.9–3.16 objętości użytych odczynników zostały zmniejszone dla komórek <2 x 107.
  8. Dodać 10 μl koktajlu CD34 i inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Dodać 5 μl kulek magnetycznych i inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  10. Dodaj 2,5 ml buforu izolacyjnego CD34 do każdej próbki i umieść próbki w magnesie na 5 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Odwróć magnes na 5 sekund, aby wylać bufor izolacyjny.
  12. Wyjmij próbki z magnesu i powtórz kroki 3.10 i 3.11 4x.
  13. Wyjmij probówkę z magnesu i dodaj 2 ml buforu izolacyjnego CD34.
  14. Granulować komórki w momencie 500 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
  15. Ponownie zawiesić osady komórek w 1 ml buforu izolacyjnego CD34 i policzyć komórki.
    UWAGA: Tutaj średnia liczba komórek na gram AT wynosi: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; b) Zajezdnia SC: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Protokół CD31 z tworzywa sztucznego został dostosowany do kroków 3.16–3.34 (patrz tabela materiałów).
  16. Komórki osadu w ilości 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad w 250 μl buforu B i 250 μl buforu do przemywania .
  17. Dokładnie zawieś koraliki CD31, obracając rurkę wirowo.
  18. Dodać 20 μl kulek CD31.
    UWAGA: Ze względu na całkowitą liczbę komórek >1 x 106, wolumin został przeskalowany w dół zgodnie z danymi wejściowymi producenta.
  19. Inkubować próbkę, kołysząc przez 30 minut, w temperaturze pokojowej.
  20. Podłącz sitko do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Większy otwór sitka musi znajdować się na górze.
  21. Przed rozdzieleniem komórek dodać 1 ml buforu do płukania, aby zrównoważyć sitko. Nanieść mieszaninę wytworzoną w kroku 3.16 na sitko.
  22. Przemyć sitko 5 ml buforu do przemywania okrężnymi ruchami, aby uzyskać całkowitą objętość 20 ml. Podłącz złącze do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zamknij blokadę luer-lock.
  23. Podłącz sitko do złącza. Dodać 1 ml buforu do płukania wzdłuż ścianki sitka. Dodać 1 ml aktywowanego buforu D wzdłuż ścianki sitka. Delikatnie zamieszać próbkę i inkubować ją przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  24. Dodać 1 ml buforu do płukania. Oddziel komórki od kulek, pipetując w górę i w dół 10x.
    UWAGA: Unikaj generowania pęcherzyków powietrza.
  25. Otwórz luer-lock i pozwól, aby odłączone komórki spłynęły do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Za każdym razem myj sitko 10x 1 ml buforu do mycia.
  26. Odrzucić łącznik i sitko i odwirować próbki o masie 300 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml kompletnej pożywki EGM-2 do hodowli.
    Uwaga: Średnia liczba komórek na gram AT w tym momencie wynosi: (a) OM Depot: 5,92 x 103 ± 4,27 x 103; b) SC Depot: 4,12 x 103 ± 2,1 x 103. Rentowność ogniw z obu magazynów wyniosła ponad 90%.

4. Indukcja adipogenezy w izolowanych komórkach śródbłonka

  1. Hodować komórki na 6-dołkowych płytkach poddanych działaniu kultur tkankowych z kompletną pożywką EGM-2 w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Wymieniaj pożywkę co 3–4 dni, aż komórki osiągną 80–90% zbieżności.
    UWAGA: Podwojenie populacji trwa od 2 do 3 dni.
  2. Rozwiń komórki, poszywając je na 100-milimetrowych szalkach Petriego i podziel komórki raz w stosunku 1:3. Na tym etapie komórki znajdują się w pasażu 2.
  3. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).
  4. Wysiewaj około 100–200 000 komórek na 6-dołkowych płytkach, zapewniając zduplikowane dołki dla każdego magazynu i hoduj je w kompletnych pożywkach EGM-2 przez 2 dni.
  5. Odessać wszelkie podłoża wzrostowe i zastąpić je 2 ml DMEM/F12 z 5% FBS i 50 μg/ml penicyliny/streptomycyny dla komórek kontrolnych i zastąpić 2 ml pożywki adipogenezy (patrz krok 1.4) dla komórek poddanych zabiegowi.
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 przez 13 dni, wymieniając odpowiednie podłoża co 3 do 4 dni.
    UWAGA: Komórki zaczną gromadzić lipidy po 4 dniach leczenia.
  7. Przeprowadź barwienie ORO i czerwieni nilowej zgodnie z opublikowanymi metodami15-17.
  8. Aby wyizolować komórki do ekstrakcji RNA, usuń pożywkę z 6-dołkowych płytek indukcyjnych i umyj je 1 ml sterylnego PBS.
  9. Dodać 350 μl roztworu tiocyjanianu guanidu, fenolu i chloroformu (patrz tabela materiałów) do każdego dołka i inkubować go w temperaturze pokojowej przez 5–10 minut.
  10. Zeskrobać komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść komórki do probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
    Uwaga: Próbki mogą być przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C w celu ekstrakcji RNA i dalszego przetwarzania w późniejszym terminie.
  11. Ekstrahować mRNA z próbek przy użyciu dostosowanego protokołu ekstrakcji RNA (patrz tabela materiałów).
  12. Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR), aby ocenić ekspresję genu za pomocą następujących sond: adiponektyny, UCP-1 i CIDEA (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: W tym przypadku procedury RT-PCR przeprowadzono przy użyciu następującego standardowego protokołu: denaturacja (95 °C; 15 s), wyżarzanie i wydłużanie (60 °C; 1 min) przez 40 cykli. Próbki, które wykazywały ekspresję genów o wartościach CT >35, uznano za niewykrywalne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz protokół ma na celu zapewnienie podejścia in vitro do określenia potencjału adipogennego komórek naczyniowych CD34+CD31+ z różnych składów ludzkiej tkanki tłuszczowej. Uproszczony schemat blokowy jest pokazany w Rysunek 1A. Pierwszy krok z wykorzystaniem pozytywnej selekcji komórek wykazujących ekspresję CD34 skutkuje > 95% komórek CD34 + w populacji świeżo wyizolowanych komórek (Figura 1A). Co ważne, marker ten jest traco...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem niniejszej pracy jest przedstawienie metodologii izolacji, ekspansji i indukcji adipogennej komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z trzewnych i podskórnych magazynów ludzkiej tkanki tłuszczowej.

Opisano metodologie izolacji komórek śródbłonka z różnych łożysk naczyniowych gryzoni lub ludzi, które obejmują głównie techniki wykorzystujące przeciwciała CD31 znakowane fluorescencyjnie lub sprzężone z kulkami magnetycznymi 18,19,20,21,22,23

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy pragną podziękować Becky Marquez, koordynatorowi klinicznemu w Centrum Bariatrycznym Sentara, za jej pomoc w procesie badań przesiewowych pacjentów i wyrażanie zgody. Badania te były wspierane przez R15HL114062 Anca D. Dobrian.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

Duży sprzęt

Gabinet bezpieczeństwa biologicznego

Nuaire

nu-425-400

Inkubator kultur komórkowych

Thermo-Fisher Scientific

800 DH

Kąpiel wodna

Forma Scientific

2568

Wytrząsarka wzajemna

RT-PCR Machine

BIO-RAD

CFX96-C1000

Skrzynka do elektroforezy

BIO-RAD

Mini 3-komórkowa

Transblot Box

BIO-RAD

Mini komórka trans-Blot

Zasilanie do elektroforezy

BIO-RAD

PowerPac Basic

ELISA

Urządzenia molekularne

SpectraMax M5

Blot Reader

LI-COR

Odyssey

Bliska podczerwień

Wirówka z chłodzeniem

Eppendorf

5810 R

Wirówka stołowa

Eppendorf

MiniSpin Plus

Mikroskop fluorescencyjny

Olympus

BX50

Mikroskop odwrócony

Nikon

TMS

KRBSS Buffer

HEPES

Research Products International

H75030

Wodorowęglan sodu

Sigma-Aldrich

792519

Chlorek wapnia dwuwodny

Sigma-Aldrich

C7902

Fosforan potasu monozasadowy

Sigma-Aldrich

P5655

Siarczan magnezu

Sigma-Aldrich

M2643

Chlorek sodu

Sigma-Aldrich

746398

Fosforan sodu jednozasadowy

Sigma-Aldrich

S9638

potas chlorek

Sigma-Aldrich

P9333

Glukoza

Acros Organics

410950010

adenozyna

Acros Organics

164040250

Albumina surowicy bydlęcej

GE Healthcare Bio-Sciences

SH30574.02

Penicylina/Streptomycyna

Thermo-Fisher Scientific

15070063

Trawienie tkankowe

20 mL Strzykawka

Global Medical

67-2020

Siatka nylonowa, 250 i mikro; m

Sefar

03-250/50

Igły do pipetowania

Popper

7934

Drobne nożyczki

Narzędzia naukowe

14058-11

Kleszcze do tkanek

George Tiemann & Co

160-20

Kolagenaza, typ I

Worthington Biochemical

LS004196

Petri, 100 mm

USA Scientific

5666-4160

TC poddane obróbce

Eppendorf, 1,5 ml

USA Scientific

1615-5500

Probówki stożkowe, 15 ml

Nest Scientific

601052

Probówki stożkowe, 50 ml

Nalgene

3119-0050

Fiolki scyntylacyjne

Kimble

74505-20

Tissue Dicing

Izolacja komórek

Cellometer

Nexcelom

Auto 2000

Slajdy wiolometryczne

Nexcelom

CHT4-SD100-002

Plama żywotności celulometru

Nexcelom

CS2-0106-5mL

Acridine Orange/Prop jod idowy

Koraliki magnetyczne anty-CD34

StemCell Technologies

18056

Kit

EasySep Magnet

StemCell Technologies

18000

<
p>Plastikowe koraliki anty-CD31

pluriSelect USA

19-03100-10

pluriSelect 10x bufor do mycia

pluriSelect USA

60-00080-10

pluriSelect Pierścień łącznika

pluriSelect USA

41-50000-03

pluriSelect Detachment Buffer

pluriSelect USA

60-00046-12

pluriSelect Bufor inkubacyjny

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect S Sitko komórkowe

pluriSelect USA

43-50030-03

Hodowla komórkowa

6-dołkowe płytki

USA Naukowe

CC7682-7506

TC poddane obróbce

4- Szkiełka z dobrze komorowymi

Corning Life Sciences

354559

Pokryte fibronektyną

4-komorowe

Thermo-Fisher Scientific

154526PK

Szkło niepowlekane

Ludzkie komórki mikronaczyniowe tkanki tłuszczowej (HAMVEC)

Laboratoria Badawcze Sciencell

7200

Pierwotna linia komórkowa

Pożywka dla komórek śródbłonka (ECM)

Laboratoria Badawcze ScienCell

1001

Kompletny zestaw

DMEM/F12 Pożywka podstawowa

Thermo-Fisher Scientific

11320082

Surowica bydlęca płodu (FBS)

Rocky Mountain Biologicals

FBS-BBT

Insulina

Lilly

U-100

Humalog

Rosiglitazone

Sigma-Aldrich

R2408

Analiza komórkowa

Oil Red O Dye

Sigma-Aldrich

O0625

Przygotowany w izopropanolu

96 płytkich dołkowych

USA Scientific

1837-9600

96 płytki PCR

Genesee Scientific

24-300

Ekstrakcja RNA

Zymo Research

R2072

Kit

cDNA Synteza

BIO-RAD

1708841

Supermix

JumpStart Polimeraza PCR

Sigma-Aldrich

D9307-250UN

Gorący start, z buforem PCR N

Roztwór chlorku magnezu

Sigma-Aldrich

M8787-5ML

3 mM końcowy w reakcji PCR

dNTPs

Promega

U1515

TaqMan AdipoQ

Thermo-Fisher Scientific

Hs00605917_m1

TaqMan CIDEA

Thermo-Fisher Scientific

Hs00154455_m1

TaqMan RPL27

Thermo-Fisher Scientific

Hs03044961_g1

TaqMan UCP1

Thermo-Fisher Scientific

Hs00222453_m1

Test

BCA

Sigma-Aldrich

QPBCA-1KT

Zestaw

Bis-akrylamid

BIO-RAD

1610146

40% roztwór podstawowy

Nadsiarczan amonu

BIO-RAD

1610700

TEMED

BIO-RAD

1610800

>Tris

Sigma-Aldrich

T1503

Glycine

BIO-RAD

1610718

Sodium Dodecal Sulfate

Sigma-Aldrich

L3771

EDTA

Fisher Scientific

S311-100

Błękit bromofenolowy

Sigma-Aldrich

B8026

Blot Membrana

EMD Milipore

IPFL00010

metanol

Fisher Scientific

A452-SK4

Odyssey Blocking Buffer, Tris

LI-COR

927-50000

< p>Przeciwciało anty-AKT

Cell Signaling Technology

2920S

Monoklonalne przeciwciało

Przeciwciało anty-pAKT

Technologia sygnalizacji komórkowej

9271S

Królik poliklonalny

Przeciwciało anty-UCP1

Abcam

 <2p>ab10983

Poliklonalne królicze przeciwciało poliklonalne

Przeciwciało przeciw mysim przeciwciałom IgG

LI-COR

926-68070

Kozioł poliklonalny, IRDye 680RD

Przeciwciało anty-królicze IgG

LI-COR

926-32211

5Kozioł poliklonalny, IRDye 800CW

Przeciwciało przeciw króliczemu IgG

Jackson ImmunoResearch

111-025-003

Kozioł poliklonalny, TRITC

Bufor fosforanowy Saline

Thermo-Fisher Scientific

10010049

37% Roztwór formaldehydu

Mikroskopia elektronowa Sciences

15686

4% roztwór do utrwalania komórek

Normalna surowica kozia

Vector Laboratories

S-1000

10% roztwór blokujący

Triton X-100

Sigma-Aldrich

X-100

0. 1% roztwór przepuszczalny

DAPI

Thermo-Fisher Scientific

D1306

Calcein AM

Thermo-Fisher Scientific

65-0853-39

Wizualizacja fluorescencyjna komórek

Matrigel Podstawna membrana membranowa

Corning Life Sciences

356231

Zmniejszony czynnik wzrostu

DiI oznaczony jako acetylowany LDL

Thermo-Fisher Scientific

L3484

<p

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
  2. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
  3. Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
  4. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  5. Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
  6. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  7. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  8. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  9. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
  10. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  11. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  12. Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
  13. Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
  14. Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  16. Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
  17. Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
  18. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
  19. Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
  20. Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
  22. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
  24. Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072(2015).
  25. Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
  26. Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644(2015).
  27. Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
  28. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
  29. Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
  30. Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
  31. Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
  32. Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
  33. Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
  34. Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
  35. van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ludzka tkanka t uszczowafrakcja naczyniowo stromalnacytometria przep ywowaimmunoseparacjahodowla kom rkowabarwienie Oil Red OPCR w czasie rzeczywistympo ywka EGM2

Powiązane artykuły