Artykuł metodologiczny

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

DOI:

10.3791/57806

⸱

7 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żywe organizmy regularnie muszą radzić sobie z zmiennymi warunkami środowiska podczas swojego cyklu życia, w tym zmianami temperatury, pH, akumulacją reaktywnych form tlenu i innymi. Wahania te mogą prowadzić do rozległego rozwijania się białka, agregacji i śmierci komórki. W związku z tym komórki wyewoluowały dynamiczną i specyficzną dla stresu sieć molekularnych białek opiekuńczych, które utrzymują "zdrowy" proteom w warunkach stresu. Białka opiekuńcze niezależne od ATP stanowią jedną z głównych klas molekularnych białek opiekuńczych, które służą jako cząsteczki obronne pierwszej linii, chroniąc przed agregacją białek w sposób zależny od stresu. Jedną z cech wspólnych dla tych opiekunów jest ich zdolność do wykorzystania plastyczności strukturalnej do specyficznej dla stresu aktywacji, rozpoznawania i uwalniania nieprawidłowo złożonego klienta.

W tym artykule skupiamy się na analizie funkcjonalnej i strukturalnej jednego z takich wewnętrznie nieuporządkowanych opiekunów, bakteryjnego Hsp33 regulowanego przez redoks, który chroni białka przed agregacją podczas stresu oksydacyjnego. W tym miejscu przedstawiamy zestaw narzędzi różnych technik do badania aktywności opiekuńczej regulowanej przez redoks, a także do mapowania zmian konformacyjnych białka opiekuńczego, leżących u podstaw jego aktywności. W szczególności opisujemy przepływ pracy, który obejmuje przygotowanie w pełni zredukowanych i całkowicie utlenionych białek, a następnie analizę aktywności antyagregacyjnej białka opiekuńczego in vitro przy użyciu rozpraszania światła, koncentrując się na stopniu aktywności antyagregacyjnej i jej kinetyce. Aby przezwyciężyć częste wartości odstające nagromadzone podczas testów agregacji, opisujemy zastosowanie Kfits, nowatorskiego narzędzia graficznego, które umożliwia łatwe przetwarzanie pomiarów kinetycznych. To narzędzie można łatwo zastosować do innych typów pomiarów kinetycznych w celu usunięcia wartości odstających i dopasowania parametrów kinetycznych. Aby skorelować funkcję ze strukturą białka, opisujemy konfigurację i przebieg techniki strukturalnej spektrometrii mas, spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej, która umożliwia mapowanie zmian konformacyjnych na chaperonie i substracie podczas różnych etapów aktywności Hsp33. Tę samą metodologię można zastosować do innych oddziaływań białko-białko i białko-ligand.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki często napotykają nagromadzenie reaktywnych form tlenu (ROS) wytwarzanych jako produkty uboczne oddychania1,2, utlenianie białek i lipidów3,4, oraz dodatkowe procesy5,6,7. Pomimo korzystnej roli ROS w różnych procesach biologicznych, takich jak sygnalizacja komórkowa8,9 i odpowiedź immunologiczna10, może wystąpić brak równowagi między produkcją ROS a jego detoksykacją, prowadzący do stresu oksydacyjnego7. Biologicznymi celami ROS są białka, lipidy i kwasy nukleinowe, których utlenianie wpływa na ich strukturę i funkcję. W związku z tym akumulacja utleniaczy komórkowych jest silnie związana z różnorodnymi patologiami, w tym rakiem9,11, zapaleniem12,13 i starzeniem się14,15, i stwierdzono, że są zaangażowane w wystąpienie i progresję chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona i ALS16,17,18.

Zarówno nowo zsyntetyzowane, jak i dojrzałe białka są bardzo wrażliwe na utlenianie ze względu na potencjalnie szkodliwe modyfikacje ich łańcuchów bocznych, które kształtują strukturę i funkcję białka19,20. Dlatego stres oksydacyjny zwykle prowadzi do rozległej inaktywacji białek, nieprawidłowego fałdowania i agregacji, co ostatecznie prowadzi do śmierci komórki. Jedną z eleganckich strategii komórkowych radzenia sobie z potencjalnymi uszkodzeniami wynikającymi z utleniania białek jest wykorzystanie białek opiekuńczych zależnych od redoks, które hamują powszechną agregację białek, zamiast tworzyć stabilne kompleksy z nieprawidłowo sfałdowanymi białkami klienta21,22,23. Te opiekuńcze białka opiekuńcze pierwszej linii są szybko aktywowane przez utlenianie specyficzne dla miejsca (zwykle na resztach cysteiny), które przekształca je w silne cząsteczki antyagregacyjne24. Ponieważ stres oksydacyjny powoduje zahamowanie oddychania i obniżenie poziomu ATP w komórkach25, kanoniczne białka opiekuńcze zależne od ATP są mniej skuteczne w warunkach stresu oksydacyjnego25,26,27. Dlatego aktywowane redoks białka opiekuńcze niezależne od ATP odgrywają istotną rolę w utrzymaniu homeostazy białek po akumulacji utleniaczy w bakteriach i eukariontach (np. Hsp3328 i RidA29 w bakteriach, Get330 w drożdżach, peroksyredoksyny31 u eukariontów). Aktywność tych białek opiekuńczych silnie zależy od odwracalnych strukturalnych zmian konformacyjnych wywołanych przez utlenianie specyficzne dla miejsca, które odkrywa hydrofobowe regiony zaangażowane w rozpoznawanie nieprawidłowo sfałdowanych białek klienta.

Badania nad mechanizmem antyagregacji i zasadami rządzącymi rozpoznawaniem białek klienta przez białka opiekuńcze nie są łatwe ze względu na dynamiczną i heterogeniczną naturę interakcji chaperon-substrate32,33,34,35,36,37. Jednak regulowane stresem białka opiekuńcze mają szansę pogłębić naszą wiedzę na temat funkcji antyagregacji ze względu na ich zdolność do: 1) uzyskania dwóch różnych form białka opiekuńczego, aktywnej (np. utlenionej) i nieaktywnej (np. zredukowanej), z wprowadzeniem lub usunięciem stanu stresu, który łatwo przełącza się między nimi (np., utleniacz i środek redukujący), 2) mają szeroki zakres substratów, 3) tworzą wysoce stabilne kompleksy z białkami klienta, które mogą być oceniane za pomocą różnych metodologii strukturalnych, oraz 4) koncentrują się wyłącznie na rozpoznawaniu i uwalnianiu substratu, w którym pośredniczą zmiany konformacyjne zależne od redoks, ponieważ większość tych białek opiekuńczych nie ma zdolności do fałdowania.

Tutaj analizujemy aktywność antyagregacyjną bakteryjnego restaurowanego przez redoks Hsp33, który jest istotnym składnikiem bakteryjnego systemu obronnego przed agregacją białek wywołaną utlenianiem28. Po redukcji Hsp33 jest ściśle pofałdowanym białkiem wiążącym bez aktywności opiekuńczej; jednak pod wpływem stresu oksydacyjnego Hsp33 ulega rozległym zmianom konformacyjnym, które odsłaniają regiony wiążące jego substrat38,39. Po utlenieniu uwalniany jest jon, który jest silnie związany z czterema wysoce konserwatywnymi resztami cysteiny domeny C-końcowej40. Powoduje to powstanie dwóch wiązań dwusiarczkowych, rozwinięcie domeny C-końcowej i destabilizację sąsiedniego regionu łącznikowego41. Regiony C-końcowe i łącznikowe są bardzo elastyczne i są definiowane jako wewnętrznie lub częściowo nieuporządkowane. Po powrocie do warunków bezstresowych cysteiny ulegają zmniejszeniu, a opiekun powraca do swojego naturalnego stanu fałdowania bez aktywności antyagregacyjnej. Ponowne fałdowanie białka opiekuńczego prowadzi do dalszego rozwijania się i destabilizacji związanego białka klienta, co powoduje jego transfer do kanonicznego układu opiekuńczego, DnaK/J, w celu ponownego fałdowania38. Analiza miejsc interakcji Hsp33 sugeruje, że Hsp33 wykorzystuje zarówno naładowane nieuporządkowane regiony, jak i hydrofobowe regiony na linkerze i domenie N-końcowej do wychwytywania nieprawidłowo sfałdowanych białek klienckich i zapobiegania ich agregacji38,42. W stanie złożonym te regiony są ukryte przez składany konsolidator i domenę C-terminal. Co ciekawe, region konsolidatora służy jako strażnik złożonego i nieaktywnego stanu Hsp33, "wyczuwając" stan składania sąsiedniej domeny C-terminala34. Po destabilizacji przez mutagenezę (albo przez mutację punktową, albo przez zaburzenie pełnej sekwencji), Hsp33 jest przekształcany w konstytutywnie aktywny chaperon, niezależnie od stanu redoks jego wrażliwych na redoks cystein 43.

Przedstawione tutaj protokoły pozwalają na monitorowanie zależnej od redoks aktywności opiekuńczej Hsp33, jak również na mapowanie zmian konformacyjnych podczas aktywacji i wiązania białek klienta. Metodologia ta może być zaadaptowana do badań nad innymi modelami rozpoznawania białka opiekuńczego-klienta, a także interakcji białko-białko niebędące białkami opiekuńczymi. Ponadto przedstawiamy protokoły przygotowania w pełni zredukowanych i utlenionych białek opiekuńczych, które mogą być wykorzystane w badaniach innych białek redoks-switch, w celu ujawnienia potencjalnych ról utleniania białek na aktywność białek.

Konkretnie, opisujemy procedurę monitorowania aktywności chaperonu in vitro i definiujemy jego specyficzność substratową w różnych typach agregacji białek (indukowanej chemicznie lub termicznie) za pomocą rozpraszania światła (LS) mierzonego przez fluorospektrometr44. Podczas agregacji rozpraszanie światła przy 360 nm gwałtownie wzrasta ze względu na rosnące zmętnienie. W ten sposób agregacja może być monitorowana w sposób zależny od czasu na tej długości fali. LS jest szybką i czułą metodą badania agregacji białek, a tym samym aktywności antyagregacyjnej białka będącego przedmiotem zainteresowania przy użyciu stężeń nanomolowych, umożliwiającej scharakteryzowanie parametrów kinetycznych związanych z agregacją białek w różnych warunkach. Co więcej, opisany tutaj protokół LS nie wymaga drogiego oprzyrządowania i można go łatwo ustalić w dowolnym laboratorium.

Niemniej jednak, uzyskanie "czystych" krzywych kinetycznych i wyprowadzenie parametrów kinetycznych białka z takich eksperymentów rozpraszania światła jest dość trudne, ze względu na szum i dużą liczbę wartości odstających generowanych przez pęcherzyki powietrza i duże agregaty. Aby pokonać tę przeszkodę, prezentujemy nowatorskie narzędzie graficzne, Kfits45, używane do redukcji poziomu szumów w różnych pomiarach kinetycznych, specjalnie dostosowane do danych kinetycznych agregacji białek. Oprogramowanie to zapewnia wstępne parametry kinetyczne do wczesnej oceny wyników i pozwala użytkownikowi szybko "wyczyścić" duże ilości danych bez wpływu na ich właściwości kinetyczne. Kfits jest zaimplementowany w Pythonie i dostępny w otwartym kodzie źródłowym pod adresem 45.

Jedno z najtrudniejszych pytań w tej dziedzinie dotyczy mapowania miejsc interakcji między białkami opiekuńczymi a ich białkami klienckimi oraz zrozumienia, w jaki sposób białka opiekuńcze rozpoznają szeroki zakres nieprawidłowo sfałdowanych substratów. Pytanie to komplikuje się jeszcze bardziej, gdy bada się wysoce dynamiczne kompleksy białkowe, które obejmują wewnętrznie nieuporządkowane białka opiekuńcze i podatne na agregację substraty. Na szczęście strukturalna spektrometria mas znacznie się rozwinęła w ciągu ostatniej dekady i z powodzeniem dostarczyła pomocnych podejść i narzędzi do analizy plastyczności strukturalnej i mapowania reszt zaangażowanych w rozpoznawanie białek46,47,48,49. Tutaj przedstawiamy jedną z takich technik - spektrometrię mas wymiany wodorowo-deuterowej (HDX-MS) - która umożliwia mapowanie zmian poziomu reszt w konformacji strukturalnej po modyfikacji białka lub wiązaniu białka z ligandem35,50,51,52,53,54,55. HDX-MS wykorzystuje ciągłą wymianę wodorów szkieletowych przez deuter, na szybkość której wpływa środowisko chemiczne, dostępność oraz wiązania kowalencyjne i niekowalencyjne56. HDX-MS śledzi te procesy wymiany za pomocą deuterowanego rozpuszczalnika, zwykle ciężkiej wody (D2O), i umożliwia pomiar w oparciu o zmianę masy cząsteczkowej następującą po wymianie wodoru na deuter. Wolniejsze tempo wymiany wodor-deuter może wynikać z udziału wodoru w wiązaniach wodorowych lub, po prostu, z przeszkody sterycznej, która wskazuje na lokalne zmiany w strukturze57. Zmiany w wiązaniu liganda lub modyfikacje potranslacyjne mogą również prowadzić do różnic w środowisku wodorowym, przy czym wiązanie skutkuje różnicami w szybkości wymiany wodorowo-deuterowej (HDX)46,53.

Zastosowaliśmy tę technologię do 1) mapowania regionów Hsp33, które szybko rozwijają się po utlenieniu, co prowadzi do aktywacji Hsp33, oraz 2) zdefiniowania potencjalnego interfejsu wiązania Hsp33 z jego pełnowymiarowym nieprawidłowo sfałdowanym substratem, syntazą cytrynianu (CS)38.

Metody opisane w tym manuskrypcie mogą być stosowane do badania funkcji białek in vitro zależnych od redoks, definiując aktywność antyagregacyjną i rolę zmian strukturalnych (jeśli takie istnieją) w funkcji białka. Metodologie te można łatwo dostosować do różnych systemów biologicznych i zastosować w laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie w pełni zredukowanych i w pełni utlenionych białek

  1. Przygotowanie w pełni zredukowanego białka
    Uwaga: Tutaj opisujemy redukcję białka zawierającego i używamy roztworu ZnCl2 do przywrócenia zredukowanego stanu białka z włączeniem Zn. Roztwór ZnCl2 można wymienić lub wyrzucić. Należy zauważyć, że czas i temperatura procesu redukcji zależy od stabilności i funkcji białka, a zatem jest specyficzna dla każdego białka.
    1. Rozmrozić próbkę białka na lodzie i odwirować ją w celu usunięcia kruszyw. Inkubować próbkę przez co najmniej 1,5 godziny w temperaturze 37 °C przy użyciu 5 mM DTT i 20 μM ZnCl2 (do 70% stężenia białka).
      UWAGA: Temperatura na tym etapie jest zależna od białka i powinna być dostosowana do stabilności białka.
    2. Usuń naziemną telewizję cyfrową za pomocą kolumn odsalających.
      UWAGA: Dostępne są różne kolumny odsalające. Poniższy protokół opisuje procedurę z wykorzystaniem określonych kolumn odsalających (patrz tabela materiałów). Przed użyciem innych kolumn odsalających zalecamy zbadanie ich skuteczności usuwania DTT i odzyskiwania białka, ponieważ niektóre kolumny odsalające mogą częściowo wchłonąć interesujące nas białko.
      1. Zrównoważyć kolumnę buforem fosforanu potasu (KPi) (40 mM, pH 7,5), wypełniając kolumnę całkowicie buforem i pozwalając buforowi wypłynąć. Powtórz ten proces 2x.
      2. Wyjmij biały filtr krążkowy z kolumny, delikatnie dociskając go pęsetą i wyjmując; najłatwiej jest go wyjąć, gdy kolumna jest wypełniona buforem KPi. Ponownie napełnić kolumnę buforem KPi i odwirować ją przy 1 000 x g przez 3 minuty.
      3. Przenieść kolumnę do czystej probówki, powoli dodać próbkę białka do środka kolumny i odwirować ją przy 1 000 x g przez 2 minuty. Białko wolne od DTT znajduje się teraz w przepływie.
    3. Sprawdź jego stężenie (np. użyj spektrometru UV/Vis) i zmierz jego absorbancję przy 280 nm. Oblicz stężenie białka za pomocą prawa Beera.
    4. Podzielić połowę próbek białka na podwielokrotności. Inkubować podwielokrotności w warunkach beztlenowych (np. w komorze beztlenowej) przez 20 minut w celu całkowitego usunięcia tlenu. Szczelnie zamknąć probówki folią z tworzywa sztucznego i przechowywać próbki w temperaturze -20 °C lub -80 °C, w zależności od zawartości białka.
      UWAGA: Zamiast korzystać z komory beztlenowej, rurki można również flashować argonem w celu usunięcia tlenu.
  2. Przygotowanie w pełni utlenionego białka
    UWAGA: Zaleca się przygotowanie utlenionych próbek białek z całkowicie zredukowanych białek (opisanych wcześniej). Zmniejszy to niejednorodność stopni utlenienia cystein. Możliwe jest stosowanie różnych odczynników utleniających; tutaj skupiamy się na nadtlenku wodoru (H2O2).
    UWAGA: Unikaj nadmiernego utleniania, ponieważ może to prowadzić do niepożądanych wewnątrzcząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych i nieodwracalnego utleniania różnych aminokwasów, w tym cysteiny, metioniny, tyrozyny i innych.
    1. Do pozostałej próbki białka dodać 5 mM H2O2 (świeżo rozcieńczonej) i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 40 °C, wstrząsając.
      UWAGA: Temperatura na tym etapie jest zależna od białka i powinna być dostosowana do stabilności białka.
    2. Zrównoważyć kolumnę z buforem KPi (40 mM, pH 7,5), wypełniając kolumnę całkowicie buforem i pozwalając, aby bufor wypłynął. Powtórz ten proces 2x.
    3. Wyjmij biały filtr krążkowy z kolumny, delikatnie dociskając go pęsetą i wyjmując; najłatwiej jest go wyjąć, gdy kolumna jest wypełniona buforem KPi.
    4. Ponownie napełnić kolumnę buforem KPi i odwirować ją przy 1 000 x g przez 3 minuty.
    5. Przenieść kolumnę do czystej probówki, powoli dodać utlenioną próbkę białka do środka kolumny i odwirować ją przy 1000 x g przez 2 minuty; utlenione białko znajduje się teraz w przepływie.
    6. Sprawdzić stężenia białek jak w kroku 1.2.5, podzielić utlenione białka na podwielokrotności i przechowywać je w temperaturze -20 °C lub -80 °C, w zależności od białka.

2. Test agregacji rozpraszania światła

Uwaga: Wszystkie stężenia w tym teście są specyficzne dla białka opiekuńczego i substratu i powinny być skalibrowane. Wszystkie powinny być filtrowane 0,22 μm, ponieważ niezwykle ważne jest, aby były wolne od jakichkolwiek cząstek lub pęcherzyków powietrza, a kuwety były czyste i wolne od kurzu. Bardzo ważne jest, aby używać mieszadła umieszczonego w kuwecie kwarcowej. Sprawdź różne rozmiary i kształty mieszadeł, aby zapewnić skuteczne wymieszanie całego roztworu bez wytwarzania niepożądanych pęcherzyków powietrza. Ponadto w laboratoriach i obiektach dostępne są różne flouorospektrometry. W tym przypadku użyto specjalnego fluorospektrometru (patrz tabela materiałów). Różne instrumenty mają różną czułość, prędkość pomiaru i parametry samplera. W związku z tym dokładne parametry pomiarowe (np. szerokość pasma emisji i wzbudzenia, czułość i inne) powinny być zoptymalizowane przy użyciu znanego białka podatnego na agregację i odpowiadających mu warunków. Zaleca się stosowanie syntazy cytrynianu (CS) i/lub lucyferazy jako początkowych substratów w stężeniach nanomolowych.

  1. Test agregacji chemicznej
    1. Przygotować denaturowany substrat przez inkubację 12 μM CS przez noc w 40 mM HEPES (pH 7,5) i 4,5 M GdnCl. Aby zachować pH, rozpuść GdnCl w 40 mM HEPES (pH 7,5).
    2. Otwórz oprogramowanie fluorospektrometru i przejdź do Pomiar przebiegu czasu. Ustaw parametry na: Temperatura: 25 °C; λem: 360; Szerokość pasma Em: 5 nm; λex: 360; Szerokość pasma Ex: 2,5 nm; i Interwał danych: 0,5 s.
    3. Przygotować próbkę, dodając 1 600 μl 40 mM HEPES do kuwety kwarcowej. Włóż kuwetę do uchwytu na próbkę i pozwól próbce osiągnąć żądaną temperaturę.
    4. Ustaw mieszanie na 600 obr./min i rozpocznij pomiar, aż do ustalenia linii bazowej. Utrzymuj mieszanie przez cały pomiar.
    5. Aby zmierzyć agregację CS przy braku białka opiekuńczego, po 120 s pomiaru dodać (delikatnie, ale szybko) 10 μl denaturowanego CS (końcowe stężenie 75 nM). Kontynuuj pomiar przez 1,200 s.
    6. Aby zmierzyć agregację CS w obecności Hsp33, po 60 s pomiaru dodać Hsp33 (stężenie końcowe 300 nM). Po dodatkowych 60 s dodać 10 μl denaturowanego CS (końcowe stężenie 75 nM). Kontynuuj pomiar przez 1 200 s.
      UWAGA: Podczas dodawania substratu lub białka opiekuńczego, aby uniknąć wprowadzania pęcherzyków, należy użyć pipety o pojemności 10 μl.
  2. Test agregacji termicznej
    UWAGA: Temperatura testu agregacji termicznej zależy od stabilności białka i powinna być dostosowana do każdego białka niezależnie.
    1. Otwórz oprogramowanie fluorospektrometru i przejdź do Pomiar przebiegu czasu. Ustaw parametry w następujący sposób: Temperatura: 43 °C; λem: 360; Szerokość pasma emisji: 5 nm; λex: 360; Szerokość pasma wzbudzenia: 2,5 nm; i Interwał danych: 0,5 s.
    2. Przygotować próbkę, dodając 1 600 μl wstępnie ogrzanego 40 mM HEPES do kuwety kwarcowej. Włożyć kuwetę do uchwytu na próbkę i pozwolić, aby próbka osiągnęła temperaturę 43 °C.
    3. Ustaw mieszanie na 600 obr./min i rozpocznij pomiar, aż do ustalenia linii bazowej. Utrzymuj mieszanie przez cały pomiar.
    4. Aby zmierzyć agregację CS przy braku białka opiekuńczego, po 120 s pomiaru, delikatnie dodać CS (końcowe stężenie 125 nM) i kontynuować pomiar przez 1,200 s.
    5. Aby zmierzyć agregację CS w obecności Hsp33, po 60 s pomiaru, dodać Hsp33 (końcowe stężenie 600 nM). Po dodatkowych 60 s dodać CS (końcowe stężenie 125 nM). Kontynuuj pomiar przez 1 200 s.
      UWAGA: Podczas dodawania substratu lub białka opiekuńczego należy unikać wkładania pęcherzyków powietrza.
  3. Analiza danych i usuwanie szumów przez Kfits
    Uwaga: Kfits jest dostępny w użyciu Kfits został wcześniej opisany w Rimon et al.45
    1. Prześlij plik danych.
      UWAGA: Dane wejściowe to surowe wyniki pomiarów rozpraszania światła w formacie tekstowym rozdzielonym przecinkami lub tabulatorami.
    2. Aby usunąć wszelkie szumy, wybierz parametry analizy. Użyj najlepszego modelu automatycznego (zalecane), zaznacz Szum jest zawsze powyżej flagi sygnału.
    3. Ręcznie usuń oczywiste wartości odstające za pomocą zielonej i czerwonej regulowanej linii; ten krok przefiltruje szum powyżej zielonej linii i poniżej czerwonej linii.
    4. Ustaw linię bazową i krzywą dopasowania. Po zastosowaniu progu szumu pobierz przetworzone dane.

3. Spektrometria mas wymiany wodorowo-deuterowej

  1. Przygotowanie i próbek białek (kompleks Hsp33 i Hsp33-CS)
    1. Rozcieńczyć próbki białka do końcowego stężenia 1 mg/ml w 25 mM buforze Tris-HCl o pH 7,5 i przenieść je do fiolek o pojemności 1,5 ml.
    2. Przygotować próbki kompleksu białko-substrat przez inkubację Hsp33 z CS w stosunku 1:1,5 w temperaturze 43 °C.
      1. Dodawaj CS w sposób krokowy, aby uniknąć szybkiej agregacji i zapewnić owocne wiązanie między Hsp33 a termicznie rozłożonym CS.
      2. Stosować co najmniej cztery etapy (tj. za każdym razem dodać jedną czwartą końcowej objętości) i inkubować próbki przez 15 minut po każdym dodaniu, aby umożliwić ochronę CS przez Hsp33.
    3. Usunąć wszelkie kruszywa za pomocą 30-minutowego wirowania w temperaturze 16 000 x g w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Nowe kompleksy białkowo-substratowe muszą być przygotowywane na świeżo. Dodawanie substratu powinno odbywać się stopniowo; W przeciwnym razie nastąpi agregacja. Temperatura, podłoże i stężenia substratu są specyficzne dla białka.
    4. Przygotować bufor H (25 mM Tris-HCl, pH 7,5), który służy jako kontrola deuteracji, oraz bufor D (25 mM Tris-DCl, pH 7,09), który jest buforem deuteracyjnym. Przygotuj również świeży bufor hartowniczy (150 mM TCEP, 3 M GdnCl, 0,1% kwas mrówkowy).
      UWAGA: Bufor wygaszający powinien być zoptymalizowany dla białka będącego przedmiotem zainteresowania, aby uzyskać maksymalne pokrycie jego sekwencji po trawieniu pepsyny.
    5. Przenieść wszystkie i próbki do fiolek i umieścić je w odpowiednich tacach. Przechowywać H i D w temperaturze 25 °C (taca 25 °C); z drugiej strony, próbki i bufor schładzający należy przechowywać w temperaturze 0 - 2 °C (taca 0 °C). Najpierw umieścić próbki w szklanych wkładkach o pojemności 150 μl (patrz tabela materiałów), a następnie przenieść je do fiolek.
  2. Przygotowanie instrumentu
    UWAGA: Spektrometr masowy jest dostarczany z dwoma dołączonymi programami: jeden steruje pompami, a drugi steruje spektrometrem mas (patrz Tabela materiałów). Kolejne kroki zostaną opisane przy użyciu tych dwóch programów.
    1. Ręcznie włącz wszystkie jednostki chłodzące. Gdy wszystkie systemy chłodzenia osiągną temperaturę docelową, ręcznie włącz zarówno wysokowydajną chromatografię cieczową (HPLC), jak i pompy podawcze.
      UWAGA: W naszym przypadku składają się one z dwóch kąpieli chłodzących i komory chłodzącej (która zawiera pułapkę i kolumny analityczne). Jedna jednostka chłodząca chłodzi tacę w temperaturze 0 °C, podczas gdy druga utrzymuje tacę w temperaturze 25 °C; temperatura komory chłodzącej wynosi 1 - 2 °C.
    2. Otwórz oprogramowanie sterujące obiema pompami, jak również oprogramowanie sterujące spektrometrem masowym; upewnij się, że MS jest w trybie czuwania.
    3. Odłączyć zawór wylotowy HPLC od źródła MS i umyć układ najpierw roztworem "potrójnego środka czyszczącego" (1% kwas mrówkowy, 33% acetonitryl, 33% izopropanol, 33% metanol), następnie buforem B (80% acetonitrylu, 0,1% kwasu mrówkowego), a na końcu buforem A (0,1% kwas mrówkowy, pH 2,25), a następnie włożyć kolumnę pepsyny do układu. W przypadku wymiany należy oczyścić obie pompy przed kontynuowaniem.
    4. Upewnij się, że natężenie przepływu dla obu pomp wynosi 0,1 ml/min, a ciśnienie jest stabilne.
    5. Po umyciu układu przy stałym przepływie i stałym ciśnieniu, włóż wylot HPLC do źródła MS i włącz MS.
  3. Parametry spektrometru mas
    1. Ustawić jonizację peptydową na jonizację elektronrozpylania (ESI) w temperaturze 175 °C, przepływ gazu w osłonie na 17, żarzenie gazu pomocniczego na 2, a napięcie rozpylania na 4,5 kV (rysunek uzupełniający 1).
    2. Ustaw parametry w następujący sposób dla próbek niedeuterowanych.
      1. Ustaw parametry: Zakres skanowania m/z na 300 - 1500; Rozdzielczość do 70 000; Docelowy automatyczny regulator wzmocnienia (AGC) do 106; oraz maksymalny czas wstrzykiwania (IT) przy 100 ms.
        UWAGA: 5 najbardziej intensywnych jonów o stanach naładowania od +2 do +6 (ich intensywność wyższa niż 1,3 x 104) i dynamicznym oknie 30 cali zostanie odizolowanych.
      2. Przeprowadź fragmentację jonów przez dysocjację zderzeniową o wyższej energii (HCD) w komórce wielokrotnego zderzenia ze znormalizowaną energią zderzenia (NCE) równą 28. Wykrywanie jonów fragmentacyjnych za pomocą tandemowych MS z rozdzielczością 35 000, celem AGC 105, maksymalnym IT przy 60 ms i oknem izolacji 2,0 m/z.
    3. W przypadku próbek deuterowanych należy stosować MS1 tylko o wyższej rozdzielczości 140 000 i innych podobnych parametrach.
  4. Przeprowadzanie eksperymentu
    1. Ustaw tace w następujący sposób.
      1. Umieścić bufor H i D w podajniku o temperaturze 25 °C, a następnie umieścić próbki i bufor do gaszenia w zasobniku o temperaturze 0 °C.
      2. Umieść X pustych fiolek, wyrównanych na obu tacach, gdzie X = liczba próbek x liczba punktów czasowych.
        UWAGA: W tacce o temperaturze 25 °C puste fiolki służą jako fiolki reakcyjne, a w tacce o temperaturze 0 °C służą jako fiolki do hartowania.
      3. Każda z pustych fiolek zawiera pustą szklaną wkładkę; wyrzuć i zastąp ją między eksperymentami.
        UWAGA: W celu przeprowadzenia eksperymentu HDX w najbardziej efektywny i jak najmniej czasochłonny sposób, wykorzystano oprogramowanie, które pozwala na jednoczesne badanie próbek (rysunek uzupełniający 2). Kolejne kroki zostaną opisane przy użyciu tego oprogramowania.
    2. Otwórz oprogramowanie. Skonfiguruj parametry programu, aby wykonać następujące czynności.
      1. Inkubować każdą próbkę (5 μl) z 45 μl buforu D przez kilka minut, w zależności od wybranych punktów czasowych (np. 1, 3, 18, 40 i 100 min) w temperaturze 25 °C. Zamiast tego inkubować próbkę niedeuterowaną z 45 μl buforu H.
      2. Bezpośrednio po inkubacji wymieszać 50 μl deuterowanego białka z 50 μl lodowatego buforu hartującego i wstrzyknąć je do unieruchomionej kolumny pepsynowej (20 mm długości, 2,0 mm średnicy).
      3. Eluować wszelkie peptydy z kolumny pepsyny do kolumny wstępnej, przemłukując ją buforem A przez 6 minut z szybkością 50 μl/min. Przechowywać bufor A w komorze chłodzącej w temperaturze 0 °C.
      4. Wypłukać peptydy z kolumny wstępnej do kolumny analitycznej C18 (kolumna C18, 130 A, 1,7 μm, 2,1 mm x 50 mm, utrzymywane w temperaturze 0 °C) i rozdzielić je, stosując gradient liniowy acetonitrylu przy 100 μl/min. Uruchomić gradient acetonitrylu używając acetonitrylu 100% jako buforu B: 7 min przy 2%, 7 min przy 10 - 30%, 2,5 min przy 30 - 90%, 1,5 min przy 90%, szybkie nachylenie przez 1 min przy 90 - 8%, a na koniec wyrównaj kolumnę przez 4 min przy 2%.
    3. Zbuduj sekwencję biegową (patrz Dodatkowe Rysunek 2): wprowadź wszystkie punkty czasowe, nazwy próbek i lokalizacje w zasobnikach, a także nazwy i lokalizacje.
      UWAGA: Oprogramowanie umożliwia dostosowanie wszystkich różnych czasów pracy do programu, który uruchamia kilka próbek jednocześnie, skutecznie skracając czas działania.
  5. Analiza danych
    UWAGA: W procesie analizy danych pracujemy z kilkoma programami, w tym Proteome Discoverer i MaxQuant (darmowe oprogramowanie) do identyfikacji peptydów i analizy pokrycia sekwencji, a także HDX workbench, darmowym oprogramowaniem, które umożliwia analizę inkorporacji deuteru w białkach oraz porównanie szybkości HDX między różnymi zestawami eksperymentów. Kolejne kroki zostaną opisane przy użyciu tych programów.
    1. Przeanalizuj pokrycie peptydowe próbki, przepuszczając niedeuterowane próbki kontrolne przez oprogramowanie (Dodatkowe Rysunek 3). Skonfiguruj oprogramowanie, korzystając z następujących parametrów.
      1. Metodę Sequest HT należy stosować z nieenzymatycznym (niespecyficznym) rozszczepieniem. Poszukiwanie peptydów 4 - 144 aminokwasów o tolerancji masowej 7 ppm i 0,5 Da dla jonu i fragmentu prekursora. Pozwolić na dynamiczne utlenianie metioniny.
      2. Utwórz bazę danych dla białka, za pomocą której oprogramowanie może określić pokrycie peptydami. Eksportuj zidentyfikowane peptydy w formacie tekstowym.
    2. Przeanalizuj zdeuterowane wyniki za pomocą bezpłatnego oprogramowania HDX workbench58.
      1. Otwórz edytor białek i zdefiniuj białko, wstawiając sekwencję białka i plik pokrycia peptydów.
      2. Następnie otwórz edytor kreatora eksperymentu instalacji i wprowadź wszystkie żądane dane wejściowe.
        UWAGA: Program wymaga podania liczby próbek, liczby punktów czasowych, liczby powtórzeń, wartości pH i temperatury.
      3. Na koniec wprowadź parametry dotyczące użytego spektrometru mas, po czym program generuje listę wykrytych peptydów.
        UWAGA: Oprogramowanie wykrywa peptydy "HDX", sprawdza klastry izotopowe i demonstruje wyraźną wizualizację deuteracji w próbkach.
  6. Prezentacja danych
    1. Oznacz regiony z deferentnym wychwytem deuteracyjnym na strukturze za pomocą oprogramowania PyMol lub dowolnego innego oprogramowania do wizualizacji.
    2. Wprowadzić poziomy wychwytu deuteru zamiast wartości współczynnika B.
      Uwaga: Podstawowy samouczek można znaleźć na stronie https://pymolwiki.org/index.php/Practical_Pymol_for_Beginners.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwie przedstawione metody umożliwiają śledzenie aktywności kinetycznej i dynamiki interakcji białkowych między chaperonem a jego substratem. Co więcej, protokół redukcji-utleniania pozwala na przygotowanie w pełni zredukowanego i całkowicie utlenionego białka opiekuńczego, co daje bardziej dogłębne zrozumienie mechanizmu aktywacji nieuporządkowanych białek opiekuńczych zależnych od redoks.

Po pierwsze, użyliśmy rozpraszania świa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiliśmy protokoły analizy aktywności opiekuńczej zależnej od redoks i charakterystyki zmian strukturalnych po związaniu białka klienta. Są to uzupełniające się metodologie definiowania potencjalnych kompleksów opiekuńczo-substratowych i analizy potencjalnych miejsc interakcji.

W tym przypadku zastosowaliśmy te protokoły do scharakteryzowania kompleksu między regulowanym przez redoks chaperonem Hsp33 a dobrze zbadanym substratem opiekuńczym CS. Przedstawiliśmy dwa różne r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wdzięczni Meytal Radzinski za jej pomocne dyskusje i krytyczne przeczytanie artykułu, a także Patrickowi Griffinowi i członkom jego laboratorium za ich nieograniczoną pomoc podczas tworzenia platformy analizy HDX. Autorzy są wdzięczni Fundacji Niemiecko-Izraelskiej (I-2332-1149.9/2012), Binational Science Foundation (2015056), grantowi integracyjnemu Marie-Curie (618806), Izraelskiej Fundacji Naukowej (1765/13 i 2629/16) oraz Human Frontier Science Program (CDA00064/2014) za wsparcie finansowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemikalia, Odczynniki
Acetonitryl HPLC plusSigma Aldrich34998-2.5Lrozpuszczalnik
Kwas mrówkowy Optima LC/MSFisher ChemicalsrozpuszczalnikowyA117-50
Alkohol izopropylowy, klasa HPLCFisher ChemicalsP750717rozpuszczalnik
MetanolFisher ChemicalsA456-212rozpuszczalnik
Tris(hydroksymetylo)aminometanSigma Aldrich252859 bufor
Kwas trifluorooctowySigma Aldrich76-05-1rozpuszczalnik
Woda do HPLCSigma Aldrich270733-2,5L-Mrozpuszczalnik
ZnCl2, ChlorekMerckB0755416 308odczynnik
DTTgoldbio27565-41-9środek redukujący
PD mini pułapka kolumny G-25 GE healthcarehealthcare29-9180-07kolumna odsalająca
Fosforan potasuStany Zjednoczone Biochemical Corporation20274bufor
Nadtlenek wodoru 30%MerckK46809910526środek utleniający
syntaza cytrynianusigma aldrichC3260podłoże
HEPES bezkwasowybuforsigma aldrich7365-45-9
Gndclsigma aldrichG3272-500Gdenaturant
Roztwór chlorku deuterusigma aldrich543047-10GBufor
Tlenek deuteru 99%sigma aldrich151882-100Grozpuszczalnik
TCEPbioworld42000058-2środek
redukującyMikrowkładka 150uL z wnętrzem trzpienia i Nóżki polimerowe, 29*5mmLa-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1,5 ml przezroczysta fiolka z krótkim gwintem gwint 9 mm, 11,6 * 32 mmLa-Pha-Pack -Kuweta kwarcowa Thermo Fischer Scientific
Hellma 101-QS
strong>Instruments
Jasco FP-8500 FluorospektrometrJasco
Thermomixer ComfortEppendorf13058/0
Heraeus Megafuge 16R, stołowaWirówkaThermo Scientific
pH-metr, PB-11 sartoriusSartorius13119/0
AffiPro Immobilizowana kolumna pepsynowa (długość 20 mm, średnica 2,0 mm).Kolumna wstępna AffiPro
Waters (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 & Aring;, 1.7um, 2.1mmx5mm)Kolumna
C18 (kolumna ACQUITY UPLC Peptide BEH c18, 130 & Aring;, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Winylowa komora anaerobowa z drzwiami śluzyCOY
Q-exactive-orbitrap spektrometr masowyThermo-Fischer Naukowy
system PAL LHX - zrobotyzowany system do obsługi próbek HDXSystem PALhttps://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, pompa XRSThermo Scientific
Pompa pomocnicza Dionex AXP-MSThermo Scientific
Oprogramowanie, Narzędzia programowe, Wyszukiwanie w bazie danych
Kfits: Dane agregacji dopasowańhttp://kfits.reichmannlab.com/fitter/
oprogramowanie Thermo Scientific Xcaliburhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Oprogramowanie Chronos (Axel Semrau)http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
oprogramowanie Proteome Discoverer V1.4https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
oprogramowanie HDX Workbenchhttp://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
Suplement GE < analityczna Waters

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43(2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes - an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804(2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357(2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry - a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 2 Pt A 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Biochemistry. 56 (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Aktywno chaperonowa Hsp33test rozpraszania wiat aanaliza Kfitsagregacja syntazy cytrynianowejwarunki stresu oksydacyjnegozmiany konformacyjne bia ekkonfiguracja spektrometrii masaktywno antyagregacyjna

Powiązane artykuły