Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO) i optycznej koherentnej tomografii (OCT)

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57814

⸱

4 sierpnia 2018

 ,  , 
1Department of Medicine, Boston University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający uzyskać trójwymiarową (3D) fluorescencję (3D) i obraz siatkówki OCT o dużym polu widzenia (FOV) za pomocą nowatorskiej platformy multimodalnej do obrazowania. Przedstawimy konfigurację systemu, metodę wyrównania i protokoły operacyjne. Przeprowadzone zostaną badania obrazowe in vivo, a ich wyniki zostaną przedstawione.

Streszczenie

Chociaż obrazowanie fluorescencyjne jest szeroko stosowane w okulistyce, trójwymiarowy (3D) obraz fluorescencji siatkówki o dużym polu widzenia (FOV) jest nadal dużym wyzwaniem przy najnowocześniejszych metodach obrazowania siatkówki, ponieważ wymagałyby one układania w stos z w celu skompilowania wolumetrycznego zestawu danych. Nowsze systemy optycznej koherentnej tomografii (OCT) i angiografii OCT (OCTA) pokonują te ograniczenia, aby zapewnić trójwymiarowe (3D) obrazy anatomiczne i naczyniowe, ale bezbarwny charakter OCT nie może wizualizować przecieku wskazującego na dysfunkcję naczyń. Protokół ten opisuje nowatorską technikę ukośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO), która zapewnia wolumetryczne obrazowanie fluorescencji siatkówki 3D. Konfiguracja systemu obrazowania generuje skanowanie ukośne za pomocą suwaka gołębiego ogona i wyrównuje końcowy system obrazowania pod kątem, aby wykryć fluorescencyjne obrazy przekroju poprzecznego. System wykorzystuje metodę skanowania laserowego, a zatem umożliwia łatwe włączenie OCT jako uzupełniającej metody wolumetrycznego obrazowania strukturalnego. Obrazowanie in vivo siatkówki szczura przedstawiono tutaj. Roztwór fluoresceiny wstrzykuje się dożylnie w celu wytworzenia wolumetrycznej angiografii fluoresceinowej (vFA).

Wprowadzenie

Okulistyka i nauka o widzeniu czerpią ogromne korzyści z nowoczesnych technik obrazowania optycznego, ponieważ siatkówka jest łatwo dostępna za pomocą światła. Fluorescencyjne obrazowanie siatkówki jest niezbędnym narzędziem w diagnostyce i leczeniu chorób naczyniowych naczyń naczyniowych naczyniówkowo-siatkówkowych, takich jak retinopatia cukrzycowa (DR) i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), które są głównymi przyczynami ślepoty w Stanach Zjednoczonych.

Jednak nadal trudno jest uzyskać duże pole widzenia (FOV), trójwymiarowe (3D) obrazowanie siatkówki za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Fotografia dna oka nie ma zdolności rozdzielczej głębi i nie odrzuca rozproszonego światła. W rezultacie mieszanie sygnałów o różnej głębokości obniża jakość obrazu. Skaningowa oftalmoskopia laserowa (SLO) i konfokalna SLO (cSLO) mogą zmniejszyć efekt rozproszonego światła za pomocą bramkowania konfokalnego1. Jednak SLO lub cSLO ma trudności z uzyskaniem obrazu 3D ludzkiej siatkówki ze względu na ograniczenie ich głębokości ostrości. Optyka adaptatywna SLO (AOSLO) może zapewnić doskonałą rozdzielczość i kontrast poprzez korekcję aberracji czoła fali wprowadzanych przez ludzkie oko. Jednak AOSLO nadal wymagałoby stosu z do obrazowania wolumetrycznego2. Optyczna tomografia koherentna (OCT)3 i systemy angiografii OCT (OCTA) pokonują te ograniczenia, zapewniając trójwymiarowe (3D) obrazy anatomiczne i naczyniowe4,5,6, ale bezbarwny charakter OCT nie może wizualizować przecieku wskazującego na dysfunkcję naczyń krwionośnych.

Ten protokół opisuje nowatorską platformę multimodalną do wolumetrycznego obrazowania siatkówki fluorescencji 3D, a mianowicie ukośną skaningową oftalmoskopię laserową (oSLO). W tym systemie obrazowania skanowanie ukośne jest generowane przez suwak ogona gołębiega, a końcowy system obrazowania jest ustawiany pod kątem w celu wykrycia obrazów przekroju fluorescencyjnego. System wykorzystuje metody skanowania laserowego, które umożliwiają łatwą integrację z OCT jako uzupełniającą wolumetryczną metodę obrazowania strukturalnego. Aktualna rozdzielczość głębokości wynosi około 25 μm w siatkówce szczura, a pole widzenia wynosi 30°. Zasadniczo, oSLO pozwala na fluorescencyjną wersję OCT i może być jednocześnie łączony z OCT i OCTA w dużym polu widzenia.

W tym protokole opiszemy konfigurację oSLO, metodę dopasowania i konstrukcji, metodę obrazowania in vivo siatkówki szczura oraz reprezentatywne wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami (ACUC) Centrum Medycznego w Bostonie.

1. Ustawienia systemu

  1. System oSLO
    1. Użyj źródła lasera supercontinuum jako systemowego źródła lasera.
      1. Oddziel zakres światła widzialnego (450-650 nm) od wyższego zakresu długości fali (650-2000 nm) za pomocą lustra dichroicznego (DM1). Rozszerz widmo za pomocą pary pryzmatów dyspersyjnych po wiązce przechodzącej przez rozdzielacz wiązki polaryzacyjnej (PBS).
      2. Umieść szczelinę, aby wybrać zakres długości fali wzbudzenia (475-495 nm). Użyj lustra odbijającego, aby odbić przefiltrowaną wiązkę z powrotem do pary pryzmatów, a następnie połącz światło w światłowód jednomodowy (SMF 1).
      3. Użyj spektrometru, aby potwierdzić wybór długości fali na wyjściu światłowodu jednomodowego.
    2. Podłącz światłowód jednomodowy do dwóch kaskadowych łączników światłowodowych, jak pokazano na Rysunek 2. Jeden z portów wyjściowych światłowodu z drugiego łącznika światłowodowego dostarcza światło do systemu oSLO.
    3. Najpierw skolimuj laser w systemie oSLO.
      1. Odchylić laser za pomocą zwierciadła galwanometrycznego (GM1). Przekaż laser do drugiego zwierciadła galwanometrycznego (GM2) za pomocą systemu teleskopowego 1:1, a następnie przekaż do źrenicy oka za pomocą systemu teleskopu 3:1.
      2. Zainstaluj zwierciadło dichroiczne (DM2) w systemie teleskopu 3:1, aby odbijać sygnały fluorescencyjne.
    4. Zamontuj system teleskopu 3:1 i zwierciadło dichroiczne (DM2) na niestandardowym suwaku ogona gołębiega, aby przesunąć oś optyczną i utworzyć ukośne oświetlenie skanowania, jak pokazano na Rysunek 3. Użyj suwmiarki, aby precyzyjnie kontrolować długość przesunięcia zgodnie z potrzebami.
    5. Ścieżka optyczna obrazowania fluorescencyjnego.
      1. Odbij fluorescencję przez zwierciadło dichroiczne i przekaż do trzeciego lustra galwanometru, aby odskanować powolne skanowanie.
      2. Przekaż światło do soczewki obiektywu obrazującego za pomocą innego systemu teleskopu 1:1. Zainstaluj powyższą optykę na etapie tłumaczenia.
        UWAGA: Pod trzecim zwierciadłem galwanometru (GM3) zainstalowano dwa dodatkowe stopnie translacji, aby zapewnić redundancję stopni swobody w celu optymalizacji obrazowania.
    6. Zamontuj końcowy system obrazowania na stoliku, który ma trzy stopnie swobody (obrót i dwie osie translacji). Użyj kamery planarnej, aby uchwycić obrazy fluorescencji przekroju poprzecznego.
  2. System optycznej koherentnej tomografii
    1. Użyj tego samego źródła lasera supercontinuum, co systemowe źródło lasera.
      1. Oddziel zakres bliskiej podczerwieni (NIR) (650-900 nm) od pozostałego światła (650-2000 nm) za pomocą innego zwierciadła dichroicznego (DM3). Użyj filtra długoprzepustowego, aby jeszcze bardziej ograniczyć pasmo do 800-900 nm. Połącz wiązkę w światłowód jednomodowy (SMF 2).
    2. Podłącz światłowód jednomodowy do drugiego portu wejściowego dwóch kaskadowych sprzęgaczy światłowodowych, aby połączyć się z niebieskim wzbudzeniem oSLO. Skieruj światło z drugiego portu wyjściowego drugiego łącznika światłowodowego do ramienia referencyjnego OCT, które ma filtr o zmiennej gęstości neutralnej (VNDF), płytki kompensacji dyspersji i lustro odbijające.
      UWAGA: Światło wraca z ramienia referencyjnego, a oko rekombinuje się na drugim sprzęgaczu światłowodu i jest dostarczane do spektrometru OCT w celu zebrania sygnału.
  3. Akwizycja danych
    1. Użyj oprogramowania systemu akwizycji danych napisanego w LabVIEW i zmodyfikowanego na podstawie protokołu skanowania OCTA7,8,9,10. Dla każdego B-scan, ząb piły o 80% cyklu pracy z 500 krokami jest wyprowadzany przez analogową płytkę wyjściową (AO1) do sterowania szybkim lustrem skanującym x, GM2.
    2. Uruchamiaj kamerę skanowania liniowego na każdym kroku, aby uzyskać dane dla OCT tylko wtedy, gdy lustro jest skierowane w kierunku skanowania do przodu. Ustaw czas naświetlania kamery liniowej na 17 μs.
    3. Aby uzyskać sygnał OCTA, powtórz pomiar 5 razy w tym samym miejscu B-scan.
    4. Ustaw częstotliwość wyjściową AO na 100 kHz, a częstotliwość wyjściową OCT A-line na 50 kHz. Kontroluj powolne lustro skanujące y, GM1, za pomocą narastającego kształtu fali. Zsynchronizuj lustro deskanowania, GM3, z GM1, aby odskanować powolne skanowanie.
    5. Uruchom kamerę planarną za pomocą innej karty wyjścia analogowego (AO2), aby przechwycić jeden obraz fluorescencyjny w każdym miejscu y'. Przytnij rozmiar obrazowania lub wrzuć sąsiednie piksele do kosza, aby zwiększyć szybkość i czułość zgodnie z potrzebami.

2. Wyrównanie systemu

  1. Wyreguluj szczelinę w źródle światła oSLO, aby wybrać niebieską długość fali wzbudzenia. Użyj spektrometru, aby monitorować zakres widmowy wynoszący około 475-490 nm.
  2. Wyreguluj suwak mocowania gołębiego ogona, aby przesunąć oś optyczną o ~5 mm. Spowoduje to przesunięcie źrenicy szczura o ~1,7 mm, co spowoduje ukośny kąt ~15° na siatkówce.
  3. Wyreguluj stopień translacji układu optycznego do wykrywania fluorescencji o te same 5 mm.
  4. Dostosuj końcowy system obrazowania fluorescencji na ~30°.
  5. Zmierz moc optyczną za pomocą miernika mocy. Upewnij się, że niebieska moc wzbudzenia oSLO wynosi ≤0,2 mW, a moc lasera OCT ≤0,8 mW, co nie spowoduje uszkodzenia siatkówki.
    UWAGA: W oparciu o standard ANSI, maksymalna dopuszczalna ekspozycja (MPE) na siatkówkę jest na poziomie ~2mW7,8 w zakresie światła widzialnego. Zgodnie ze wzorem Delori i wsp.9, MPE dla światła bliskiej podczerwieni jest około dwa razy wyższe niż dla światła widzialnego, wynosząc około 4 mW.

3. Eksperyment na zwierzętach in vivo

  1. Przenieś 12-tygodniowego samca szczura Long Evans do komory indukcyjnej. Znieczulać szczura 4,5% izofluranem w tlenie przez 10 minut z natężeniem przepływu 2 l/min za pomocą parownika izofluranu.
    1. Potwierdź głębokość znieczulenia określoną na podstawie braku odruchu odstawienia podczas szczypania międzypalcowego.
  2. Po indukcji umieść szczura na 5-osiowym (przesunięcia x, y, z, odchylenie i skok). Zapewnij dodatkowe ciepło za pomocą podgrzewanego etapu, cyrkulacyjnego koca z ciepłą wodą lub innej odpowiedniej metody w długotrwałym eksperymencie. Utrzymuj znieczulenie na poziomie 1,5% izofluoranu z natężeniem przepływu 2 litry/minuty podczas pozostałej części eksperymentu. Gdy nie używasz komory indukcyjnej z aktywnym wydechem, komorę indukcyjną należy umieścić na stole z prądem wstecznym lub zstępującym lub pod fajką w celu usunięcia izofluranu.
  3. Rozszerz źrenicę 1% roztworem okulistycznym Tropicamidu przez 2 minuty. Nałóż 0,5% roztwór okulistyczny Tetracaine HCl na oko szczura, aby w razie potrzeby zastosować dodatkowe znieczulenie miejscowe. Utrzymuj nawilżenie oka dostępnymi w handlu sztucznymi łzami co najmniej raz na minutę podczas eksperymentu.
  4. Wstrzyknąć sól fluoresceiny (10% w/w) lub FITC (10% w/w) rozcieńczoną w sterylnym roztworze soli fizjologicznej (0,1-0,3 ml) przez żyłę ogonową za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 29G.
  5. Włącz źródło lasera. Umieść filtr o neutralnej gęstości, aby stłumić wzbudzenie niebieskiego światła podczas wyrównywania. Zmierz moc światła OCT na ~0,8 mW, a niebieskie światło <0,01 mW, aby uniknąć powstawania zaćmy.
  6. Uruchom tryb skanowania i wyrównywania galwanometru. Dostosuj wysokość gałki ocznej, aby uzyskać nieruchomą plamkę lasera na rogówce. Dostosuj pozycję oka szczura tak, aby krawędź źrenicy była mniej więcej prostopadła do lasera i przesuń laser do wierzchołkowego środka oka do około ~1,5 mm.
  7. Dalej dostosuj uchwyt na zwierzęta, aż obrazy OCT osiągną optymalną jakość. W kierunku szybkiego skanowania x upewnij się, że obraz B-scan w przekroju poprzecznym jest płaski. Przełączając się na kierunek powolnego skanowania y, upewnij się, że obraz B-skanowania przekroju poprzecznego wydaje się nachylony ze względu na skanowanie ukośne.
  8. Usuń filtr o neutralnej gęstości do wzbudzenia światła niebieskiego i monitoruj obraz w czasie rzeczywistym z kamery. Powinien pojawić się przekrój poprzeczny obrazu fluorescencyjnego pokazujący naczynia krwionośne pojawiające się na różnych głębokościach.
    1. Dostosuj ostrość końcowego systemu obrazowania fluorescencyjnego, aby osiągnąć optymalną ostrość. Umożliwia precyzyjną regulację pozycji oka w płaszczyźnie bocznej, aby osiągnąć optymalną jakość obrazu oSLO.
  9. Po wyrównaniu zacznij wykonywać jednoczesną angiografię OCTA i wolumetryczną angiografię fluoresceinową (vFA).
  10. Skonstruuj obrazy wolumetryczne zarówno dla OCTA, jak i oSLO za pomocą Matlaba. Algorytmy zostały wcześniej szczegółowo opisane10. Generuj naczynia krwionośne siatkówki z rozdzielczością głębokościową poprzez segmentację obrazu.
  11. Po zakończeniu obrazowania wyłącz laser, uwolnij zwierzę i nałóż trochę maści okulistycznej na oczy, a następnie umieść zwierzę w pudełku do odzyskiwania.
  12. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka lub zgodnie z polityką instytucjonalną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 4a przedstawia przekrój OCT siatkówki szczura. Ryciny 4b-4c pokazują te same obrazy przekrojowe siatkówki uzyskane metodą OCTA oraz oSLO vFA, zarejestrowane w tym samym czasie. oSLO umożliwia uzyskanie przekrojowego obrazu FA analogicznego do B-skanu OCT. W porównaniu do OCTA, obraz przekrojowy oSLO vFA wyraźnie wskazuje naczynia w warstwie włókien nerwowych (NFL) i warstwie komórek zwojowych (GCL), a takż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy oSLO, technikę wolumetrycznego obrazowania fluorescencyjnego siatkówki in vivo z polem widzenia powyżej 30°. W porównaniu z OCT, obecną standardową metodą obrazowania w okulistyce, oSLO oferuje podobne możliwości obrazowania 3D, ale umożliwia kontrast fluorescencyjny, na który OCT nie jest wrażliwy. Zaletą oSLO jest to, że wymaga tylko jednego skanu rastrowego, a tym samym umożliwia bezproblemowe połączenie OCT, zapewniając dwie uzupełniające się techniki strukturalnego i fluorescencyjnego obraz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Ji Yi posiada oczekujący patent na oSLO. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Finansowanie pochodzi z funduszy Fundacji Evans Medical z Boston Medical Center, jak również z podwykonawstwa od NIH 5R01CA183101, pilotażowego grantu BU-CTSI 1UL1TR001430, programu pilotażowego BU-Joslin oraz BU-CTSI KL2TR001411.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Źródło lasera SupercontinuumNKT PhotonicsSuperK EXTREME EXU-OCT6
Lustro dichroiczne (DM1)ThorlabsDMLP650R
Lustro dichroiczne (DM2)Lustro dichroiczneChromaZT514/1064rpc
(DM3)ThorlabsDMLP900R
światłowód jednomodowy (SMF 1)ThorlabsP3-460B-FC-2
Światłowód jednomodowy (SMF 2)ThorlabsP3-780A-FC-2
Łącznik światłowodowyThorlabsTW850R5A2
System teleskopów 1:1ThorlabsAC254-100-A&czasy;
System teleskopów 3:1ThorlabsAC254-150-A&czasy;
System teleskopów 3:1ThorlabsAC254-50-A&czasy;
lustra Galvo (GM1,GM2)ThorlabsGVS201 i razy;
De-sacn Galvo Mirrors (GM3)ThorlabsGVS011
ObiektywOlympusUplanSApo 20×/0.75
Końcowy system obrazowaniaOlympusUplanFL N 10×/0.3
Końcowy system obrazowaniaComputar12-36mm/1:2.8
AparatPCOPco.pixelfly usb
FiltrThorlabsFEL0800
Bezstopniowy filtr NDThorlabsNDC-50C-4M-A Kamera
ThorlabsSPL2048-140K
Analogowa karta wyjściowa (AO1)National InstrumentPCI-6731
Analogowa karta wyjściowa (AO2)National InstrumentPCIe-6351
Filtr długoprzepustowyThorlabsFEL0800
2222 do skanowania liniowego

Bibliografia

  1. Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. Confocal scanning laser ophthalmoscope. Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).
  2. Roorda, A., et al. Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).
  3. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  4. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5(2015).
  5. Jia, Y., et al. Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration. Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).
  6. Chen, C. -L., Wang, R. K. Optical coherence tomography based angiography [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).
  7. Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy. Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).
  8. Zhang, X. Y., et al. Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer. Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).
  9. Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices. Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).
  10. Zhang, L., et al. Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO). Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wolumetryczna angiografia z fluoresceinobrazowanie mikrokr enia siatk wkifluorescencyjne obrazowanie siatk wkitr jwymiarowe obrazowanie siatk wkiobrazowanie w szerokim polu widzeniawizualizacja naczy kapilarnych siatk wkidiagnostyka retinopatii cukrzycowejmultimodalne obrazowanie siatk wki
Multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO) i optycznej koherentnej tomografii (OCT)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.