Artykuł metodologiczny

Biodrukowalny hydrożel alginianowo-żelatynowy 3D Systemy modelowe in vitro indukują tworzenie sferoidów komórkowych

DOI:

10.3791/57826

⸱

2 lipca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, McGill University Montreal, 2Department of Bioengineering, McGill University Montreal, 3Department of Molecular Biology, Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica, A.C. (IPICyT), 4Department of Mining and Materials Engineering, McGill University Montreal, 5Department of Biomedical Engineering, McGill University Montreal

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy heterogeniczny model raka piersi składający się z unieśmiertelnionych komórek guza i fibroblastów osadzonych w biodrukowalnym biotuszu alginian/żelatyna. Model podsumowuje mikrośrodowisko guza in vivo i ułatwia tworzenie wielokomórkowych sferoid guza, dostarczając informacji na temat mechanizmów napędzających nowotworzenie nowotworów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórkowa, biochemiczna i biofizyczna heterogeniczność rodzimego mikrośrodowiska guza nie jest rekapitulowana przez hodowanie unieśmiertelnionych linii komórek rakowych przy użyciu konwencjonalnej dwuwymiarowej (2D) hodowli komórek. Wyzwania te można przezwyciężyć, wykorzystując techniki biodruku do budowy heterogenicznych trójwymiarowych (3D) modeli nowotworów, w których osadzone są różne typy komórek. Alginian i żelatyna to dwa z najczęstszych biomateriałów stosowanych w biodruku ze względu na ich biokompatybilność, biomimikrę i właściwości mechaniczne. Łącząc te dwa polimery, uzyskaliśmy biodrukowalny kompozytowy hydrożel o podobieństwach do mikroskopijnej architektury rodzimego zrębu guza. Zbadaliśmy drukowność kompozytu hydrożelowego za pomocą reologii i uzyskaliśmy optymalne okno drukowania. Komórki raka piersi i fibroblasty zostały osadzone w hydrożelach i wydrukowane w celu utworzenia modelu 3D naśladującego mikrośrodowisko in vivo. Biodrukowany model heterogeniczny osiąga wysoką żywotność w długotrwałej hodowli komórkowej (> 30 dni) i wspomaga samoorganizację komórek raka piersi w wielokomórkowe sferoidy guza (MCTS). W tym modelu zaobserwowaliśmy migrację i interakcję komórek fibroblastów związanych z rakiem (CAF) z MCTS. Wykorzystując biodrukowane platformy hodowli komórkowych jako systemy kohodowli, oferuje unikalne narzędzie do badania zależności nowotworzenia od składu zrębu. Technika ta charakteryzuje się wysoką przepustowością, niskimi kosztami i wysoką odtwarzalnością, a także może stanowić alternatywny model dla konwencjonalnych hodowli jednowarstwowych komórek i zwierzęcych modeli nowotworów do badania biologii raka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż hodowla komórkowa 2D jest szeroko stosowana w badaniach nad rakiem, istnieją ograniczenia, ponieważ komórki są hodowane w formacie jednowarstwowym o jednolitym stężeniu składników odżywczych i tlenu. Hodowle te nie mają ważnych interakcji komórka-komórka i komórka-macierz obecnych w natywnym mikrośrodowisku guza (TME). W związku z tym modele te słabo podsumowują warunki fizjologiczne, co skutkuje nieprawidłowymi zachowaniami komórek, w tym między innymi nienaturalnymi morfologiami, nieregularną organizacją receptorów, polaryzacją błony i nieprawidłową ekspresją genów1,2,3,4. Z drugiej strony, hodowla komórkowa 3D, w której komórki są ekspandowane w przestrzeni wolumetrycznej jako agregaty, sferoidy lub organoidy, oferuje alternatywną technikę tworzenia dokładniejszych środowisk in vitro w celu badania podstawowej biologii i fizjologii komórki. Modele hodowli komórkowych 3D mogą również zachęcać do interakcji komórka-ECM, które są krytycznymi cechami fizjologicznymi natywnego TME in vitro1,4,5. Pojawiająca się technologia biodruku 3D daje możliwości budowania modeli, które naśladują heterogeniczne TME.

3D bioprinting wywodzi się z szybkiego prototypowania i umożliwia wytwarzanie mikrostruktur 3D, które są w stanie naśladować niektóre zawiłości próbek żywych tkanek6,7. Obecne metody biodruku obejmują druk atramentowy, wytłaczanie i druk wspomagany laserowo8. Wśród nich metoda ekstruzji pozwala na kontrolowanie niejednorodności w drukowanych matrycach poprzez precyzyjne pozycjonowanie różnych rodzajów materiałów w różnych początkowych lokalizacjach. Dlatego jest to najlepsze podejście do wytwarzania heterogenicznych modeli in vitro obejmujących wiele typów komórek lub matryc. Bioprinting ekstruzyjny został z powodzeniem wykorzystany do budowy rusztowań w kształcie małżowiny usznej9, struktury naczyniowe10,11,12 oraz tkanek skóry13, co skutkuje wysoką wiernością drukowania i żywotnością komórek. Technologia ta charakteryzuje się również wszechstronnym wyborem materiałów, możliwością osadzania materiałów z osadzonymi komórkami o znanej gęstości oraz wysoką odtwarzalnością14,15,16,17. Naturalne i syntetyczne hydrożele są często używane jako biotusze do biodruku 3D ze względu na ich biokompatybilność, bioaktywność i sieci hydrofilowe, które można zaprojektować tak, aby strukturalnie przypominały ECM7,18,19,20,21,22,23. Hydrożele są również korzystne, ponieważ mogą zawierać miejsca adhezji komórek, elementy strukturalne, przepuszczalność składników odżywczych i gazów oraz odpowiednie właściwości mechaniczne, aby stymulować rozwój komórek24. Na przykład hydrożele kolagenowe oferują miejsca zakotwiczenia integryny, które komórki mogą wykorzystać do przyłączenia się do macierzy. Żelatyna, zdenaturowany kolagen, zachowuje podobne miejsca adhezji komórek. W przeciwieństwie do tego, alginian jest bioobojętny, ale zapewnia integralność mechaniczną poprzez tworzenie wiązań krzyżowych z jonami dwuwartościowymi25,26,27,28.

W tej pracy opracowaliśmy kompozytowy hydrożel jako biotusz, składający się z alginianu i żelatyny, z podobieństwami do mikroskopijnej architektury rodzimego zrębu nowotworowego. Komórki raka piersi i fibroblasty zostały osadzone w hydrożelach i wydrukowane za pomocą biodrukarki opartej na wytłaczaniu, aby stworzyć model 3D, który naśladuje mikrośrodowisko in vivo. Zmodyfikowane środowisko 3D pozwala komórkom nowotworowym na tworzenie wielokomórkowych sferoid guza (MCTS) o wysokiej żywotności przez długie okresy hodowli komórkowej (> 30 dni). Protokół ten demonstruje metodologie syntezy hydrożeli kompozytowych, charakteryzując mikrostrukturę i drukowalność materiałów, biodrukując heterogeniczne modele komórkowe oraz obserwując powstawanie MCTS. Metodologie te można zastosować do innych biotuszy w biodruku ekstruzyjnym, a także do różnych projektów heterogenicznych modeli tkanek z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach przesiewowych leków, testach migracji komórek i badaniach koncentrujących się na podstawowych funkcjach fizjologicznych komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie materiałów, hydrożelu i materiałów do hodowli komórkowych

  1. Przygotowanie materiału i roztworu
    1. Umyj i wysusz szklane zlewki o pojemności 250 ml i 100 ml, mieszadła magnetyczne, szpatułki, wkłady 10 ml, dysze cylindryczne 25 G (o długości 0,5 cala i średnicy wewnętrznej 250 μm). Wysterylizować materiały przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C/15 min/1 atm. Przechowuj materiały w sterylnych warunkach do czasu użycia.
      Uwaga: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje o dostawcy.
    2. Odważyć 3 g alginianu (3% m/v) i 7 g żelatyny (7% m/v) (oznaczonych dalej jako A3G7).
    3. Sterylizuj następujące przedmioty w świetle UV przez co najmniej 4 godziny: proszki alginianowe i żelatynowe, folia parafinowa, kawałki folii aluminiowej o długości 5cm2 oraz strzykawki o pojemności 1 ml i 5 ml. Wysterylizuj zaślepki, zaślepki końcówek i tłoki, zanurzając je w 70% etanolu na co najmniej 4 godziny i umyj je 2x wysterylizowaną ultraczystą wodą.
      Uwaga: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje o dostawcy.
    4. Rozpuść 4 g agarozy w ultraczystej wodzie i wysterylizuj w autoklawie.
      Uwaga: Agaroza jest całkowicie rozpuszczona po procesie autoklawowania.
    5. Przed użyciem przygotować 100 mM roztwór bezwodnego chlorku wapnia (CaCl2) w wysterylizowanej ultraczystej wodzie i sterylnym filtrze (o wielkości porów 0,22 μm).
    6. W przypadku płytek 6-dołkowych pokrytych agarozą, stopić sterylną agarozę w kuchence mikrofalowej, aby uzyskać płynny roztwór; następnie, pod komorą bezpieczeństwa biologicznego (BSC) i za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml, dodać 2 ml na studzienkę i delikatnie wymieszać, aby utworzyć jednolitą warstwę na dnie studzienki. Pozostaw do ostygnięcia i uszczelnij studzienkę folią parafinową. Przechowuj go w temperaturze pokojowej (RT) do czasu użycia.
  2. Przygotowanie prekursora hydrożelu A3G7
    1. Wymieszać 3 g alginianu i 7 g żelatyny w proszku w zlewce o pojemności 250 ml w BSC. Dodaj mieszadło magnetyczne i 100 ml DPBS. Uszczelnij zlewkę sterylną folią parafinową i folią aluminiową (5cm2), aby uniknąć zanieczyszczenia.
    2. Rozpuścić proszki przy stałym mieszaniu na magnetycznej/gorącej płycie z prędkością 600 obr./min w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę i w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 2 godziny.
    3. Podgrzewać materiał w temperaturze 37 °C, aż żel przejdzie przemianę fazową do stanu ciekłego (w przypadku 100 ml podstawowego roztworu żelu trwa to około 45 minut). Przenieść roztwór do sterylnych stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, uszczelnić je i odwirować probówki o stężeniu 834 x g przez 5 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki gazu z materiału.
    4. Odessać prekursor hydrożelu do strzykawek o pojemności 10 ml. Uszczelnić strzykawki nakrętkami i folią parafinową. Przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  3. Hodowla komórkowa
    Uwaga: Czynności opisane w tej sekcji należy wykonywać w sterylnych warunkach.
    1. Przygotuj podstawową pożywkę DMEM w następujący sposób (na 1 l): w BSC wymieszaj 100 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) plus 10 ml roztworu antybiotyku/antybiotyku (100x stabilizowany roztwór) ze świeżym sterylnym pojemnikiem. Dodaj pożywkę DMEM, aby dostosować mieszaninę do 1,000 ml. Zamknąć pojemnik i przechowywać go w temperaturze 4 °C.
    2. W uprzednio podgrzanej łaźni wodnej (37 °C) rozmrozić 1 fiolkę MDA-MB-231-GFP (ludzka linia komórkowa raka piersi znakowana GFP, lokalizacja jądrowa) i 1 fiolkę komórek IMR-90-mCherry (linie komórkowe fibroblastów związanych z rakiem znakowane mCherry, z lokalizacją cytoplazmatyczną) z magazynu ciekłego azotu, delikatnie przenosząc je do wody. Obie linie komórkowe, jak i plazmidy do znakowania GFP i mCherry są dostępne na rynku.
    3. Przenieść 160 μl/dołek roztworu komórkowego (3 x 106 komórek/ml) do płytki 6-dołkowej i dodać 5 ml podgrzanej (37 °C) podstawowej pożywki DMEM. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 24 - 48 godzin, aż komórki osiągną 80% zbieżności.
    4. Po tym, jak komórki osiągną zbieżność, wyrzucić pożywkę i dwukrotnie przepłukać komórki DPBS; inkubować komórki z 500 μl roztworu/studzienki trypsyny-EDTA (0,25%, 1x, uprzednio ogrzane w 37 °C) w temperaturze 37 °C przez 6 minut. Następnie dezaktywuj trypsynę, dodając 500 μl FBS, odzyskaj roztwór komórek i przenieś go do kolb T-75. Inkubować je ponownie w temperaturze 37 °C/5% CO2 , aż komórki osiągną 80% konfluencji.
      Uwaga: Objętość roztworu trypsyny-EDTA może się różnić w zależności od naczynia do wzrostu komórek.
    5. Powtórz poprzedni krok, aby pracować z komórkami w pasażu 3 - 4, ponieważ wtedy komórki mają większą aktywność metaboliczną i stabilność.
    6. Policz komórki za pomocą testu błękitu trypanowego (0,4%) w celu określenia początkowego stężenia komórek, które mają być zmieszane z hydrożelem.

2. Pomiary właściwości reologicznych hydrożeli

  1. Przygotować prekursor hydrożelu alginian/żelatyny zgodnie z opisem w kroku 1.2.
    Uwaga: Warunki sterylne nie są wymagane w przypadku próbek generowanych do badań i analiz mechanicznych. Wszystkie badania reologiczne wykonywane są w trzech egzemplarzach.
  2. Wziąć strzykawkę z prekursorem hydrożelu i podgrzać ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Włącz reometr i zainicjuj system zgodnie z poniższymi krokami.
    1. Włącz sprężarkę powietrza podłączoną do reometru i pozwól sprężarce powietrza pracować przez 30 minut. Włącz skrzynkę kontrolną temperatury reometru, włącz sam reometr i włącz komputer podłączony do reometru.
    2. Otwórz oprogramowanie reometru, kliknij przycisk Inicjalizuj na panelu sterowania i poczekaj, aż proces inicjalizacji się zakończy. Ustaw temperaturę platformy na 37 °C na panelu sterowania.
    3. Kliknij kartę Zestaw pomiarowy i przejdź do funkcji Uruchom serwis, wybierz z menu rozwijanego opcję Dostosuj bezwładność sterownika, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij regulację w wyskakującym okienku.
    4. Zamontuj równoległe narzędzie pomiarowe w reometrze. We wszystkich przeprowadzonych tu eksperymentach wykorzystuje się płytkę o średnicy 25 mm z odstępem 1 mm między płytkami.
    5. Kliknij Ustaw zerową przerwę na panelu sterowania i poczekaj na zakończenie procedury. Zwróć uwagę na normalną siłę podczas tego procesu.
      Uwaga: Po tej procedurze siła normalna powinna wynosić 0.
    6. Kliknij kartę Zestaw pomiarowy i przejdź do funkcji Uruchom serwis, wybierz opcję Dostosuj bezwładność górnego układu pomiarowego, a następnie kliknij przycisk Rozpocznij regulację w wyskakującym okienku. Po zakończeniu kliknij przycisk trójkąta na panelu sterowania, aby umożliwić narzędziu pomiarowemu przesunięcie się w górę.
  4. Przeprowadź przemiatanie amplitudy.
    1. Kliknij Start, a następnie kliknij Wstaw w górnym menu, wybierz Czekaj z menu rozwijanego. Otwórz okno ustawień i ustaw czas oczekiwania na 2 h.
      Uwaga: Spowoduje to dodanie kroku oczekiwania przed testami.
    2. Kliknij przycisk Start, a następnie ponownie kliknij przycisk Wstaw i z menu rozwijanego wybierz opcję Urządzenie. Otwórz okno konfiguracji, wybierz Temperaturę i ustaw ją na 25 °C. Odznacz pole Poczekaj, aż zostanie osiągnięta wartość.
    3. Kliknij krok Pomiar, a następnie kliknij zmienną Odkształcenie oscylacyjne, otwórz okno konfiguracji, ustaw Profil na Logarytm rampy i zmień wartość na 0,001% i 100% odpowiednio jako odkształcenie początkowe i końcowe. Ustaw częstotliwość na 0.01 Hz.
    4. Kliknij przycisk Dodaj, aby dodać zmienną Temperatura. Kliknij zmienną Temperatura i ustaw ją na 25°C. W oknie rozwijanym rozwiń węzeł Kalkulator, ustaw Gęstość punktów na 10 punktów/dekadę.
    5. Wyjąć strzykawkę z łaźni wodnej i wytłoczyć około 0,5 ml prekursora na platformę reometru.
    6. Kliknij przycisk trójkąta skierowanego w dół na panelu sterowania. Poczekaj, aż przyrząd pomiarowy przesunie się w dół do pozycji przycinania.
    7. Za pomocą szpatułki odetnij nadmiar prekursorów, które wydostały się na krawędź narzędzia pomiarowego, i wyrzuć zbędny materiał.
    8. Odpipetuj olej mineralny na krawędź przyrządu pomiarowego i poczekaj, aż olej całkowicie uszczelni granicę.
    9. Kliknij przycisk Kontynuuj na panelu sterowania. Następnie kliknij przycisk Start (zielony trójkąt), a następnie kliknij przycisk Kontynuuj na dolnym ekranie.
    10. Po zakończeniu testowania zwolnij narzędzie pomiarowe, a następnie kliknij przycisk trójkąta skierowanego w górę na panelu sterowania. Wyjmij przyrząd pomiarowy i wyczyść go 70% etanolem. Wyczyść platformę 70% etanolem.
    11. W bieżącym projekcie kliknij krok Pomiar i otwórz okno konfiguracji. Teraz ustaw częstotliwość na 100 Hz. Zachowaj wszystkie inne parametry bez zmian.
    12. Powtórz kroki 2.4.5 - 2.4.10.
    13. Kliknij przycisk Diagram. Obserwuj krzywą G', G" w funkcji odkształcenia oscylacyjnego. Znajdź punkty odchylenia G' dla obu częstotliwości (0,01 Hz i 100 Hz). Znajdź odpowiednie odkształcenia oscylacyjne dla obu punktów ugięcia.
    14. Wybierz mniejsze odkształcenie oscylacyjne i użyj 1/10 tego szczepu do wszystkich testów oscylacyjnych przeprowadzanych później.
      Uwaga: Początek ugięcia G' jest uważany za ostateczne liniowe odkształcenie sprężyste (ULES), którego nie należy przekraczać w dalszych testach. Współczynnik 1/10 jest zwykle stosowany w inżynierii ze względów bezpieczeństwa. To obliczone odkształcenie jest oznaczone jako gC.
    15. Po zakończeniu testu kliknij pozycję Tabela, skopiuj wszystkie dane i wklej je do pliku tekstowego.
  5. Przeprowadź pomiar temperatury.
    1. Kliknij Moje aplikacje i wybierz szablon Rampa temperatury, ścinanie oscylacyjne: Żelowanie.
    2. Nazwij projekt.
    3. Kliknij krok Pomiar w przepływie pracy. Następnie kliknij zmienną Temperatura, otwórz okno konfiguracji i ustaw temperaturę początkową i końcową odpowiednio na 37 °C i 25 °C.
    4. W oknie podciągania ustaw odkształcenie oscylacyjne na 0.1%, częstotliwość oscylacji na 1 Hz. Następnie ustaw liczbę punktów danych na 61. Ustaw częstotliwość zbierania danych na 1 punkt/min. Kliknij Kalkulator i ustaw Gęstość punktów na 0.2 °C/punkt.
      Uwaga: Umożliwi to zmianę temperatury z szybkością 0.2 °C/min.
    5. Załaduj próbkę na platformę reometru i wykonaj test, wykonując czynności 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Kliknij Diagram, obserwuj G', G" w funkcji temperatury. Znajdź punkt przecięcia G' i G". Znajdź temperaturę w punkcie przecięcia.
      Uwaga: Jest to temperatura przejścia zol/żel prekursora hydrożelu.
    7. Powtórz krok 2.4.15.
  6. Przeprowadź izotermiczne przemiatanie w czasie.
    1. Kliknij pozycję Moje aplikacje, a następnie znajdź i kliknij szablon Izotermiczny test czasowo-temperaturowy. Kliknij krok Pomiar w przepływie pracy, a następnie kliknij zmienną Odkształcenie oscylacyjne, otwórz okno konfiguracji, ustaw odkształcenie oscylacyjne na 0,1% i ustaw częstotliwość oscylacji na 1 Hz. W oknie rozwijanym ustaw liczbę punktów danych na 120. Ustaw częstotliwość zbierania danych na 1 punkt/min.
      Uwaga: Wartość tego odkształcenia jest oparta na wynikach przemiatania amplitudy.
    2. Kliknij przycisk Dodaj, aby dodać zmienną Temperatura. Kliknij zmienną temperaturę w środkowym oknie i ustaw ją na 25 °C.
      1. Kliknij prawym przyciskiem myszy krok Przenieś urządzenie do punktu pomiarowego w przepływie pracy, kliknij przycisk Usuń. Następnie kliknij krok Wartość ustawiona przez urządzenie, odznacz pole Poczekaj, aż wartość zostanie osiągnięta i ustaw wartość na 25 °C. Kliknij Obraz, tytuł, przyciski na dole ekranu, odznacz pole Kontynuuj. Następnie kliknij krok Start, nazwij projekt i zapisz go.
    3. Załaduj próbkę na platformę reometryczną i rozpocznij test, wykonując czynności 2.4.5 - 2.4.10.
    4. Obserwuj G', G" w funkcji czasu. Znajdź punkt przecięcia G' i G". Znajdź czas w punkcie przecięcia. Po zakończeniu testu kliknij pozycję Tabela, skopiuj wszystkie dane i wklej je do pliku tekstowego.
      Uwaga: Jest to czas przejścia zol/żel prekursora hydrożelu w temperaturze 25 °C.
  7. Zmierz granicę plastyczności w różnych okresach żelowania.
    1. Kliknij pozycję Moje aplikacje, a następnie znajdź i kliknij szablon Stres plastyczności i przepływu, Żelowy. Nazwij projekt. Kliknij krok Rozpocznij w przepływie pracy. Kliknij Wstaw w górnym menu i z menu rozwijanego wybierz Czekaj. Otwórz okno konfiguracji i ustaw czas oczekiwania na 20 min.
      Uwaga: Spowoduje to dodanie kroku oczekiwania przed testami.
    2. Kliknij przycisk Start, a następnie ponownie kliknij przycisk Wstaw i z menu rozwijanego wybierz opcję Urządzenie. Otwórz okno konfiguracji, wybierz Temperaturę i ustaw ją na 25 °C. Odznacz pole Poczekaj, aż zostanie osiągnięta wartość.
    3. Kliknij krok Pomiar w procesie roboczym, wybierz zmienną Naprężenie ścinające, otwórz okno ustawień i ustaw początkowe i końcowe naprężenie ścinające odpowiednio na 0 i 10 000 Pa. Kliknij Kalkulator, ustaw gęstość punktów na 0,2 punktu/Pa. W zakładce Punkty danych po lewej stronie ustaw 1 punkt/ sekundę.
      Uwaga: spowoduje to szybkość narastania naprężeń na poziomie 5 Pa/s.
    4. Kliknij kartę Kontrolka zdarzenia u dołu okna rozwijanego i ustaw kryterium zatrzymania: zatrzymaj pomiar, jeśli szybkość ścinania > 100 s-1,
      Uwaga: Spowoduje to automatyczne zatrzymanie pomiaru, jeśli materiał zostanie uzyskany.
    5. Załaduj próbkę na platformę reometryczną i rozpocznij test, wykonując czynności 2.4.5 - 2.4.10.
    6. Kliknij przycisk Diagram. Przestrzegać krzywej odkształcenia-naprężenia. Znajdź punkt ugięcia odkształcenia i odpowiadające mu naprężenie. Powtórz kroki od 2.7.2 do 2.7.6, ale zmień czas oczekiwania na 30, 40 i 50 minut dla każdej repliki; Spowoduje to granicę plastyczności przy różnych czasach żelowania.
      Uwaga: Naprężenie to jest uważane za pozorną granicę plastyczności.
      Uwaga: kliknięcia oprogramowania mogą się różnić w zależności od modelu reometru i wersji oprogramowania. Zalecamy czytelnikom zapoznanie się z podanymi przez nas parametrami testowymi, a jednocześnie zapoznanie się z instrukcją obsługi konkretnego reometru/oprogramowania w praktycznym zastosowaniu.
       

3. Projekt rusztowania, hydrożel z komórkami i modele do druku 3D

  1. Konstrukcja rusztowania
    1. Narysuj na papierze model przypominający śmigło.
      Uwaga: Model przypominający śmigło został zaprojektowany w oparciu o następujące względy: (a) symuluje scenariusz in vivo, w którym komórki rakowe są otoczone przez CAF; (b) minimalizuje koncentrację naprężeń poprzez zastosowanie geometrii kołowej; c) jest elastyczny, tak aby w przyszłości można było dodać do modelu więcej sektorów bez zmiany istniejących geometrii; oraz (d) jest płaski w swojej pionowej skali, aby ułatwić dyfuzję składników odżywczych.
    2. Niech środek śmigła będzie początkiem i użyj symboli R0, R1 i R2, aby przedstawić maksymalny promień odpowiednio wewnętrznego koła, środkowych sektorów i zewnętrznych sektorów. Symbole m i n służą odpowiednio do przedstawiania liczby wewnętrznych łuków i szprych wewnątrz obszaru sektora.
    3. Oblicz współrzędne każdego węzła na modelu przypominającym śmigło i zapisz je w wyrażeniach symbolicznych R0, R1, R2, m i n.
    4. Uruchom skrypt programu, ustaw R0, R1, R2, m i n jako zmienne i wprowadź wyrażenie symboliczne każdego węzła klucza.
      Uwaga: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać wszelkie informacje dotyczące oprogramowania.
    5. Ułóż ścieżkę łączącą węzły i przypisz kasetę do wewnętrznego okręgu, środkowych sektorów i zewnętrznych sektorów. Ustaw grubość warstwy na 150 μm, a liczbę warstw na 4.
    6. Pozwól programowi wyprowadzić plik tekstowy w formacie G-code, który jest rozpoznawalny przez biodrukarkę.
    7. Ustaw R0 = 3,85, R1 = 6,85, R2 = 8,65, m = 2 i n = 5. Uruchom skrypt i pobierz wygenerowany plik G-code. Skopiuj i wklej plik do dedykowanego folderu G-code drukarki bio.
    8. Włącz biodrukarkę i jej oprogramowanie sterujące. Zainicjuj drukarkę. Otwórz właśnie utworzony skrypt G-code i ustaw wszystkie naciski na zero. Wróć do oprogramowania sterującego, kliknij zakładkę Generator monterów rusztowań, a następnie kliknij przycisk Uruchom w prawym dolnym rogu. Obserwuj ścieżkę ruchu drukarki.
      Uwaga: Spowoduje to przetestowanie precyzji wygenerowanego kodu G. Zapoznaj się ze Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje dotyczące biodrukarki.
    9. Ten krok jest opcjonalny. Zbuduj demonstracyjny model 3D na podstawie powyższych parametrów za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD).
      Uwaga: Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać informacje o oprogramowaniu dostawcy.
  2. Zrób obciążony komórkami prekursor hydrożelu A3G7
    Uwaga: Czynności opisane w tej sekcji należy wykonywać w sterylnych warunkach. Przechowuj biodrukarkę w BSC.
    1. Wysterylizuj biodrukarkę, dokładnie rozpylając 70% etanolu i wystawiając ją na działanie światła UV przez noc.
    2. Wyjąć strzykawkę z prekursorem hydrożelu (w temperaturze 4 °C) i ogrzewać ją w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
    3. Pobrać kolbę T z komórkami (patrz krok 1.3) z inkubatora CO2 i umieścić ją w BSC. Wyrzucić pożywkę hodowlaną i dwukrotnie przepłukać komórki DPBS. Dodać podgrzany roztwór trypsyny-EDTA (3,0 ml) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 6 minut. Dezaktywuj trypsynę tą samą objętością FBS. Policz komórki za pomocą testu błękitu trypanowego.
    4. Wyjmij strzykawkę z prekursorem hydrożelu z łaźni wodnej, wyczyść ją i wysterylizuj 70% etanolem. Umieścić strzykawkę w BSC.
    5. Wytłacz około 3 ml prekursora hydrożelu do 10 ml wkładu drukarskiego. Wymieszać prekursor z komórkami MDA-MB-231-GFP w proporcji 1 x 106 komórek/ml, powoli pipetując, unikając wytwarzania pęcherzyków. Przykryj wkład sterylną zaślepką końcową i górną i uszczelnij go folią parafinową. Odwirować go przy 834 x g przez 1 minutę, aby wyeliminować wszelkie powstałe pęcherzyki gazu.
    6. Powtórz kroki 3.2.3 - 3.2.5 dla prekursora IMR-90-mCherry obciążonego komórkami i prekursora bezkomórkowego.
    7. Wysterylizuj wszystkie 3 wkłady 70% etanolem, a następnie załaduj je do komór biodrukarki. W oprogramowaniu sterującym drukarki ustaw temperaturę wkładu na 25 °C. Odczekaj 35 minut, aby prekursor osiągnął warunki drukowania.
      Uwaga: Ten czas nie ma wpływu na żywotność komórek osadzonych w hydrożelu.
  3. Druk modeli 3D
    1. W oprogramowaniu sterującym drukarką rozwiń zakładkę Głowica narzędziowa w oprogramowaniu sterującym drukarki, kliknij 1 kasetę w interfejsie graficznym po lewej stronie, a następnie kliknij krótki przycisk Zmierz, aby zmierzyć położenie końcówki dyszy. Powtórz tę czynność dla pozostałych 2 wkładów.
    2. Umieść przezroczystą mikropłytkę polistyrenową, otwórz plik G-code i zmień ciśnienie na 200 kPa dla wszystkich wkładów. Wróć do oprogramowania sterującego, kliknij zakładkę Generator monterów rusztowań, wybierz punkt, aby rozpocząć drukowanie, a następnie kliknij przycisk Uruchom w prawym dolnym rogu. Powtórz ten krok, aby uzyskać 3 kolejne powtórzenia.
    3. Po wydrukowaniu wszystkich powtórzeń modeli śmigieł, dodaj 100 mM roztworu CaCl2, aby usieciować modele przez 1 minutę i przepłukać go 2x DPBS, aby usunąć nadmiar jonów Ca++.
    4. Ostrożnie przenieś modele na 6-dołkową płytkę pokrytą agarozą za pomocą szpatułki. Dodaj 5 ml pożywki DMEM do każdej studzienki. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
      Uwaga: upewnij się, że modele unoszą się w studniach.
    5. Zastępuj pożywkę do hodowli komórkowych świeżą pożywką co 3 dni, hoduj ją łącznie przez 30 dni.

4. Eksperymenty z żywotnością i tworzeniem sferoid na dyskach hydrożelowych.

  1. Przygotowanie krążka hydrożelowego
    1. Powtórz kroki 3.2.1 - 3.2.6.
      Uwaga: Możliwe jest zastąpienie wkładu małym sterylnym pojemnikiem.
    2. Użyj sterylnej strzykawki z podziałką o pojemności 1 ml i odetnij dyszę, aby utworzyć duży otwór w strzykawce (otwór ma taką samą średnicę jak reszta rurki strzykawki). Oczyść go 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
      Uwaga: Zrób to w sterylnym BSC.
    3. Użyć pokrywki z dołkiem, dodać 100 mM CaCl2, aż powierzchnia zostanie pokryta; następnie wziąć hydrożel z komórkami do napełnienia strzykawki; wycisnąć 100 μl metodą wiszącej kropli. Pozostaw hydrożel na 1 minutę i spłucz go nadmiarem DPBS. Przenieść krążki hydrożelu na 6-dołkową płytkę pokrytą agarozą, dodać 5 ml podstawowego DMEM i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez okres do 30 dni. Odświeżaj podłoże co 3 dni.
  2. Żywotność komórek i sferoidów
    1. Użyj testu MTS, aby określić żywotność komórek. Umyj każdy krążek DPBS i pokrój go na 4 części za pomocą drobnego sterylnego ostrza. Zebrać części całego dysku i przenieść je na płytkę 96-dołkową. Następnie dodać 100 μl DMEM plus 20 μl odczynnika MTS do każdego dołka i inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    2. Po reakcji MTS odzyskać supernatant i przenieść go na czystą płytkę 96-dołkową. Zmierzyć absorbancję próbek przy długości fali 490 nm.
  3. Formacja sferoidalna
    1. Wyjąć inkubowany model śmigła lub dysku z inkubatora w dniach 0, 7, 15, 21 i 30 kultury i przenieść je na czystą płytkę 6-dołkową.
    2. Użyj konfokalnego mikroskopu odwróconego z wirującym dyskiem, aby uwidocznić sferoidy i uzyskać obrazy przy użyciu wielu pozycji i stosów z. Wyobraź sobie każdy model śmigła lub dysku wzdłuż jego średnicy poziomej od lewej do prawej z przerwą 500 μm i uzyskaj stos z od dołu do góry płaszczyzny ogniskowej w każdej pozycji poziomej.
      Uwaga: Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać informacje o dostawcy.
    3. Zrekonstruuj obraz za pomocą narzędzia arytmetycznego maksymalnego stosu, dostarczonego przez program ImageJ, aby utworzyć obrazy 2D używane do analizy sferoidowej.

5. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM)

  1. Przygotować hydrożel alginian/żelatynowy zgodnie z opisem w kroku 1.2.
    Uwaga: Warunki sterylne nie są wymagane.
    UWAGA: Ciekły azot i paraformaldehyd są niebezpieczne i należy obchodzić się z nimi ostrożnie.
  2. Wsyp 1 ml hydrożelu do moździerza, dodaj ciekły azot i zmiel go za pomocą tłuczka. Kontynuuj dodawanie ciekłego azotu, aby uniknąć rozmrożenia hydrożelu. Przenieść proszek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, zamknąć ją i przechowywać w temperaturze -80 °C przez 2 godziny. Próbkę należy liofilizować przez 24 godziny.
  3. W celu obrazowania sferoidalnego należy delikatnie przemyć hydrożel DPBS 2x, utrwalić komórki przez zanurzenie w 4% paraformaldehydzie na 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie przepłukać je DPBS i zamrozić ciekłym azotem. Na koniec próbkę należy liofilizować przez 24 godziny.
  4. Analizuj strukturę i morfologię hydrożelu/sferoidy za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) przy napięciu 25,0 kV, poniżej 70 Pa (ciśnienie w komorze) przy powiększeniu od 40X do 5,000X.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar temperatury pokazuje wyraźną różnicę w stosunku do prekursora A3G7 w temperaturach 25 °C i 37 °C. Prekursor jest cieczą w temperaturze 37 °C i ma złożoną lepkość 1938,1 ± 84,0 mPa x s, co potwierdza się większą liczbą G" w stosunku do G'. Wraz ze spadkiem temperatury prekursor ulega fizycznemu żelowaniu w wyniku spontanicznego fizycznego splątania cząsteczek żelatyny w formację trójhelisową29,30. Zarówno G', jak i G" zwięks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Struktury obciążone komórkami mogą zostać naruszone, jeśli zanieczyszczenie (biologiczne lub chemiczne) wystąpi w dowolnym momencie procesu. Zwykle zanieczyszczenie biologiczne jest postrzegane po dwóch lub trzech dniach hodowli jako zmiana koloru pożywki hodowlanej lub struktury biodrukowanej. Dlatego sterylizacja (dezynfekcja fizyczna i chemiczna) jest kluczowym krokiem dla wszystkich procesów związanych z komórkami. Warto zauważyć, że autoklawowanie żelatyny zmienia jej właściwości żelujące, co sprawiło, że w prowadzo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tao Jiang dziękuje Chińskiej Radzie Stypendialnej (201403170354) i McGill Engineering Doctoral Award (90025) za ich stypendium. Jose G. Munguia-Lopez dziękuje CONACYT (250279, 290936 i 291168) oraz FRQNT (258421) za stypendium. Salvador Flores-Torres dziękuje CONACYT za stypendium (751540). Joseph M. Kinsella dziękuje Narodowej Radzie Badań Naukowych i Inżynieryjnych, Kanadyjskiej Fundacji Innowacji, Fundacji Rodziny Townshend-Lamarre i Uniwersytetowi McGill za ich finansowanie. Chcielibyśmy podziękować Allenowi Ehrlicherowi za umożliwienie nam korzystania ze swojego reometru, Danowi Nicolau za umożliwienie nam korzystania ze swojego mikroskopu konfokalnego oraz Morag Park za udostępnienie nam fluorescencyjnie znakowanych linii komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alginian soduFMC BioPolymerNr CAS: 9005-38-3Protanal LF 10/60 FT
ŻelatynaSigma-AldrichG9391Żelatyna typu B ze skóry bydlęcej
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dubelcco (DPBS 1X)GibcoLS141901361& razy;, bez wapnia, bez magnezu
Magnetyczna płyta grzewczaCorning Nie dotyczyMieszadło/płyta grzejna model PC-420
50 ml probówki wirówkoweCorning352098Falcon® 50 ml Probówka wirówkowa PP o wysokiej czystości, stożkowe dno, sterylna
wirówkaGMIN/ASorvall RT6000D, GMI, USA
Bezwodny chlorek wapniaSigma-AldrichC1016
MiliQ woda MilliporeN/A
Milipory 0,22 i mikro; m filtersMilliporeSLGS033SBFiltr strzykawkowy Millex-GS, 0.22  &mikro; M, Mieszane estry celulozy, 33  mm, tlenek etylenu sterylizowany
Reometr oscylacyjny MCR 302Anton PaarN/A
Przyrząd pomiarowy reometru CP25Anton Paar79038Stożkowa geometria płytki do reometru
RheoCompassAnton PaarN/AOprogramowanie sterujące reometrem MCR 302
Skaningowy mikroskop elektronowyHitachiN/ASEM, Hitachi SU-3500 Zmienne ciśnienie
Paraformaldehyd, 96%, ekstra czystyAcros Organics416785000
Dulbecco modyfikowane podłoże orła (DMEM)Gibco11965092
Antybiotyk/Roztwór przeciwgrzybiczy (100X) stabilizowanySigmaA5955
Płodowa surowica bydlęcaBioprodukty080-150
Kolby do hodowli komórkowych T-75Sigma-AldrichCLS43064175 cm2 Obróbka powierzchni TC
Biodrukarka 3D BioScaffolder 3.1GeSiMN/A
OprogramowanieGeSim GeSiMN/AOprogramowanie sterujące BioScaffolder 3.1
10cc Odporny na promieniowanie UVEFD Nordson7012126
ZaślepkaEFD Nordson7014472
Zaślepka końcówkiEFD Nordson
7014469 Tłok EFD Nordson7012182
Dysza nierdzewna G25EFD Nordson7018345
Kąpiel wodnaVWRN/A
AgarozaSigma-AldrichA9539Bioreodczynnik do biologii molekularnej
Costar płytki 6-dołkowe Corning3516z powłoką TC, pakowane pojedynczo, sterylne 
Konfokalny mikroskop odwrócony z wirującym dyskiemOlympus Life ScienceN/AOlympus IX83
MTS zestaw testowyPromegaG3582CellTiter 96® AQueous  Test proliferacji komórek w jednym roztworze 
Zestaw do cytotoksyczności żywotności żywej/martwejSondy molekularne, ThermoFisher ScientificL3224
Trypsyna 0,25/EDTA 1XGibco25200-072
Corning 96-dołkowa płytka Corning3595Przezroczysta mikropłytka z polistyrenu z płaskim dnem i poddana działaniu TC, indywidualnie pakowana, z pokrywką o niskiej parowaniu, sterylny
autoklaw TuttnauerHeidolph BrinkmannN/ASterylizator autoklawu Heidolph Tuttnauer 2540E Model elektroniczny z 4 tacami ze stali nierdzewnej, pojemność 23L
Trypan niebieskiInvitrogen T102820,4% roztwór
EtanolAlkohole handloweP016EA95Alkohole specjalistyczne Greenfield
CO2 InkubatorPanasonicN/AMCO 19AIC-PA
 SP ScientificN/AVirtis Sentry 2.0
SolidWorksDassault SystemsN/AOprogramowanie CAD używane do budowy demonstracyjnego modelu przypominającego śmigło
MATLABOprogramowanie do programowania MathWorksN/Aużywane do generowania G-code dla BioScaffolder 3.1
Płytki wielodołkowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. Advances in multicellular spheroids formation. Journal of the Royal Society Interface. 14 (127), (2017).
  2. Yip, D., Cho, C. H. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (3), 327-332 (2013).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. The relevance of using 3D cell cultures, in addition to 2D monolayer cultures, when evaluating breast cancer drug sensitivity and resistance. Oncotarget. 7 (29), 45745-45756 (2016).
  4. Yue, X., Lukowski, J. K., Weaver, E. M., Skube, S. B., Hummon, A. B. Quantitative proteomic and phosphoproteomic comparison of 2D and 3D colon cancer cell culture models. Journal of Proteome Research. 15 (12), 4265-4276 (2016).
  5. Priwitaningrum, D. L., et al. Tumor stroma-containing 3D spheroid arrays: a tool to study nanoparticle penetration. Journal of Controlled Release. 244 (Pt B), 257-268 (2016).
  6. Hong, S., et al. Cellular behavior in micropatterned hydrogels by bioprinting system depended on the cell types and cellular interaction. Journal of Bioscience and Bioengineering. 116 (2), 224-230 (2013).
  7. Dolati, F., et al. In vitro evaluation of carbon-nanotube-reinforced bioprintable vascular conduits. Nanotechnology. 25 (14), 145101(2014).
  8. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  9. Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
  10. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  11. Jia, W., et al. Direct 3D bioprinting of perfusable vascular constructs using a blend bioink. Biomaterials. 106, 58-68 (2016).
  12. Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
  13. Lee, V., et al. Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (6), 473-484 (2014).
  14. Jiang, T., et al. Directing the self-assembly of tumour spheroids by bioprinting cellular heterogeneous models within alginate/gelatin hydrogels. Scientific Reports. 7 (1), 4575(2017).
  15. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  16. Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338 (6109), 921-926 (2012).
  17. Nair, K., et al. Characterization of cell viability during bioprinting processes. Biotechnology Journal. 4 (8), 1168-1177 (2009).
  18. Costa, E. C., et al. 3D tumor spheroids: an overview on the tools and techniques used for their analysis. Biotechnology Advances. 34 (8), 1427-1441 (2016).
  19. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001(2014).
  20. Ling, K., et al. Bioprinting-based high-throughput fabrication of three-dimensional MCF-7 human breast cancer cellular spheroids. Engineering. 1 (2), 269-274 (2015).
  21. Liang, Y., et al. A cell-instructive hydrogel to regulate malignancy of 3D tumor spheroids with matrix rigidity. Biomaterials. 32 (35), 9308-9315 (2011).
  22. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
  23. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  24. Hospodiuk, M., Dey, M., Sosnoski, D., Ozbolat, I. T. The bioink: a comprehensive review on bioprintable materials. Biotechnology Advances. 35 (2), 217-239 (2017).
  25. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  26. Bhutani, U., Laha, A., Mitra, K., Majumdar, S. Sodium alginate and gelatin hydrogels: viscosity effect on hydrophobic drug release. Materials Letters. 164, 76-79 (2016).
  27. Biswal, D., et al. Effect of mechanical and electrical behavior of gelatin hydrogels on drug release and cell proliferation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 53, 174-186 (2016).
  28. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  29. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. I. Structural investigation. Journal de Physique (France). 49 (2), 319-332 (1988).
  30. Djabourov, M., Leblond, J., Papon, P. Gelation of aqueous gelatin solutions. II. Rheology of the sol-gel transition. Journal de Physique (France). 49 (2), 333-343 (1988).
  31. Coussot, P. Rheometry of Pastes, Suspensions, and Granular Materials: Applications in Industry and Environment. , Wiley-Interscience. Hoboken, NJ. (2005).
  32. Ouyang, L., Yao, R., Zhao, Y., Sun, W. Effect of bioink properties on printability and cell viability for 3D bioplotting of embryonic stem cells. Biofabrication. 8 (3), 035020(2016).
  33. Michon, C., Cuvelier, G., Launay, B. Concentration dependence of the critical viscoelastic properties of gelatin at the gel point. Rheologica Acta Rheologica Acta: An International Journal of Rheology. 32 (1), 94-103 (1993).
  34. Mouser, V. H., et al. Yield stress determines bioprintability of hydrogels based on gelatin-methacryloyl and gellan gum for cartilage bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 035003(2016).
  35. Benbow, J. J., Oxley, E. W., Bridgwater, J. The extrusion mechanics of pastes-the influence of paste formulation on extrusion parameters. Chemical Engineering Science. 42 (9), 2151-2162 (1987).
  36. Bingham, E. C. Fluidity and plasticity. , McGraw-Hill. New York, NY. (1922).
  37. Horrobin, D. J., Nedderman, R. M. Die entry pressure drops in paste extrusion. Chemical Engineering Science. 53 (18), 3215-3225 (1998).
  38. Soman, P., et al. Cancer cell migration within 3D layer-by-layer microfabricated photocrosslinked PEG scaffolds with tunable stiffness. Biomaterials. 33 (29), 7064-7070 (2012).
  39. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  40. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  41. Akasov, R., et al. Formation of multicellular tumor spheroids induced by cyclic RGD-peptides and use for anticancer drug testing in vitro. International Journal of Pharmaceutics. 506 (1-2), 148-157 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hydro el do biodruku3D model guzaanaliza reologicznakom rki raka piersifibroblasty zwi zane z nowotworemwielokom rkowe sferoidy nowotworowemikroskopia konfokalnasterylny biodruk

Powiązane artykuły